Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Summary

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Abstract

Fluorescentie microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen in situ ontdekken en hun dynamiek en interactie in real-time controleren. Naast conventionele epi-fluorescentie microscopie, zijn verschillende beeldvormende technieken ontwikkeld om specifieke experimentele doelen te bereiken. Enkele van de meest gebruikte technieken omvatten single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET), die conformationele veranderingen en moleculaire interacties met angstrom resolutie en single-molecuul detectie gebaseerde rapporteren kan Super resolutie (SR) imaging, die de ruimtelijke resolutie van ongeveer tien tot twentyfold in vergelijking met diffractie-limited microscopie verbeteren kan. Hier presenteren we een klant ontworpen geïntegreerd systeem, dat wordt samengevoegd meerdere beeldvormende methoden in een Microscoop, met inbegrip van conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde SR imaging en Multi-Color single-molecuul detectie, inclusief smFRET imaging. Verschillende beeldvormende methoden kunnen gemakkelijk en reproducibly worden bereikt door over te schakelen van optische elementen. Deze set-up is eenvoudig te nemen door een onderzoekslaboratorium dat in de biologische wetenschappen met een behoefte aan routine en gevarieerde beeldvorming experimenten op een lagere kosten en ruimte ten opzichte van de bouw van aparte microscopen voor individuele doeleinden.

Introduction

Fluorescentie microscopen zijn belangrijke hulpmiddelen voor de moderne biologische wetenschap onderzoek en fluorescerende imaging wordt routinematig uitgevoerd in vele biologie laboratoria. Door biomoleculen van belang met fluorophores te labelen, kunnen we direct visualiseren ze onder de Microscoop en de tijd-afhankelijke wijzigingen vastleggen in lokalisatie, conformatie, interactie, en vergadering staat in vivo of in vitro. Conventionele fluorescentie microscopen hebben een ruimtelijke resolutie van diffractie-limited, die daarom ~ 200-300 nm in de laterale richting en ~ 500-700 nm in de axiale richting^1,2, en zijn beperkt tot de beeldvorming op de 100s van nanometer-naar-micron schaal. Om te onthullen fijnere details in de moleculaire assembly of organisatie, hebben verschillende SR-microscopies die de diffractie-limiet breken kunnen ontwikkeld. Strategieën gebruikt om SR omvatten niet-lineaire optische effecten, zoals de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie^3,4 en gestructureerde verlichting microscopie (SIM)^{5,6, 7}, stochastische detectie van afzonderlijke moleculen, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)⁸ en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM)⁹, en een combinatie van beide, zoals MINFLUX¹⁰. Onder deze microscopies SR, kunnen single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopen relatief moeiteloos worden gewijzigd van een single-molecuul Microscoop set-up. Met de activering van de repetitieve en beeldvorming van photoactivatable fluorescente proteïnen (FPs) of foto-schakelbare kleurstoffen getagd op biomoleculen van belang, is ruimtelijke resolutie 10-20 nm¹¹bereikbaar. Om te krijgen informatie over de moleculaire interacties en conformationele is dynamiek in real-time, angstrom-naar-nanometer resolutie vereist. smFRET^12,13 is een benadering om deze oplossing te bereiken. In het algemeen, zijn afhankelijk van de biologische kwesties van belang, beeldvormende methoden met verschillende ruimtelijke resoluties nodig.

Meestal is voor elk type voor imaging, specifieke excitatie en/of emissie optische configuratie nodig. Bijvoorbeeld, is een van de meest gebruikte verlichting methoden voor single-molecuul detectie door middel van totale interne reflectie (TIR), waarin een specifieke excitatie hoek moet worden bereikt door middel van een prisma of door middel van het objectief. Voor de detectie van de smFRET moeten emissies van zowel donor als acceptor kleurstoffen worden ruimtelijk gescheiden en gericht op verschillende delen van het elektron-te vermenigvuldigen, charge - coupled apparaat (EMCCD), die kan worden bereikt met een set van spiegels en dichroïde beam splitters Geplaatst in het pad van de emissie. Voor driedimensionale (3-D) is SR imaging, een optische component, zoals een cilindrische lens¹⁴, nodig om een astigmatisme effect te veroorzaken in het pad van de emissie. Daarom, EIGENBOUW of verkrijgbare geïntegreerde microscopen, meestal, functioneel gespecialiseerd zijn voor elk type van imaging methode en zijn niet flexibel om te schakelen tussen verschillende beeldvormende methoden op de zelfde set-up. Hier presenteren we een kosteneffectieve, hybridesysteem waarmee verstelbaar en reproduceerbare Hiermee schakelt u tussen drie verschillende beeldvormende methoden: conventionele epi-belichting fluorescerende beeldbewerking met diffractie-beperkte resolutie, single-molecuul detectie gebaseerde SR beeldbewerking en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van smFRET imaging (figuur 1A). In het bijzonder de hier gepresenteerde set-up bevat vezel-gekoppelde ingang lasers voor Multi-Color excitatie en een commerciële verlichting arm in het pad van excitatie, waardoor geprogrammeerd controle van de excitatie-hoek, om te schakelen tussen epi-modus en TIR. In het pad van de emissie, een verwisselbare EIGENBOUW cilindrische lens cassette is geplaatst binnen het lichaam van de Microscoop voor 3D-SR imaging en een commerciële balk splitter is geplaatst voor een EMCCD-camera die kan selectief worden ingeschakeld om te detecteren van meerdere kanalen van de emissie tegelijkertijd.

Protocol

1. Microscoop constructie- en montage

1. Excitatie-pad
   Opmerking: De excitatie-pad bevat lasers, differentiële interferentie contrast (DIC) onderdelen, het lichaam van de Microscoop en haar arm verlichting.
   1. Een optische Vibratie-geïsoleerd-tabel voorbereiden. Bijvoorbeeld, geeft een structurele demping inhoudsopgave 48 x 96 x 12'' genoeg ruimte voor alle componenten.
      Opmerking: Bouwen de set-up in een kamer met temperatuurregeling (bijvoorbeeld21.4 ± 0.55 ° C). Temperatuur stabiliteit is van cruciaal belang voor het behoud van de optische uitlijning.
   2. Installeren van een Microscoop lichaam dat is uitgerust met een arm van de verlichting voor optische vezel verbinding, een 100 X olie-immersie objectief voor TIRF en DIC onderdelen.
   3. Plaats vier laser koppen (647 nm, 561 nm, 488 nm, en 405 nm, omcirkeld in figuur 1B) en hun warmte zakt op optische tafel, en zorg ervoor dat de uitgestoten laserstralen hebben dezelfde hoogte en zijn zo kort mogelijk te zijn om goede stabiliteit (bv 3'').
      Opmerking: Als een laser-hoofd op een kortere hoogte dan andere lasers zit, plaatsen en een aluminiumplaat met voldoende dikte eronder. Zorg altijd ervoor maximale contact tussen de heatsinks en de optische tabel voor de beste warmtedissipatie (figuur 1B). De lasers moeten krachtig genoeg voor SR imaging. Zie tabel met materialen. Het is aanbevolen om de laser-opschonen filters voor Diodelasers hebben.
   4. Installeer een gegevenskaart verwerving via een peripheral component interconnect (PCI)-interface in een werkstation en sluit lasers met deze kaart. Controle van de lasers' ON/OFF gedrag door transistor-transistor-logic (TTL) output, en de aanpassing van hun macht door de analoge uitgang van deze kaart (Figuur 1 c). Installeer een goede microscopie denkbaar software (commercieel of EIGENBOUW) om te bepalen van de data-acquisitie kaart, evenals de Microscoop lichaam.
   5. Montage van de spiegels en dichroïde beam splitters (590, 525 en 470 lange pass filters) met hun respectieve mounts. Gebruik zeer stabiel spiegel klemstroken voor de spiegels. Circulaire splitters met behoud van ringen om te voorkomen dat eventuele buiging van de dichroïde beam splitters (Figuur 1 d) gebruiken.
   6. Plaats de spiegels en dichroïde beam splitters op de optische tafel te combineren van de laserstralen (figuur 1B). Om te bereiken de meest stabiele uitlijning, de ganse regeling zo compact mogelijk te maken en gebruiken van 1''-dikte optische berichten. De lasers zo rangschikken dat het kortere golflengte lasers dichter bij de optische koppeling (figuur 1B), zijn omdat korte golflengte lichten meer in de lucht verdrijven.
   7. Laserstralen combineren tot een enkelvoudige modus optische vezel. Om dit te doen, door een fiber coupler te bouwen in een kooi-systeem bezorgd via de volgende stappen uit:
      1. Monteer een fiber adapter plaat in een z-as vertaling mount (figuur 1E, meest linkse paneel).
      2. Een achromatische doublet lens mount (brandpuntsafstand = 7,5 mm) in een kooi plaat (figuur 1E, tweede paneel van links).
      3. Sluit de twee delen boven door verlengstangen te vormen van een kooi. Monteer de kooi op de optische tafel met montagebeugels op de 1'' dikke optische posten (figuur 1E, middelste deelvenster).
      4. Sluiten de 647-nm laser eerst bij een enkelvoudige modus optische vezel (FC/APC daartoe het voorste koppelingsvlak).
         Opmerking: Een ruwe uitlijning een multi-mode optische vezel te gebruiken voordat u de enkelvoudige modus optische vezel kan het helpen van het uitlijning proces. Aanpassen van de hoeken van de spiegels en dichroïde beam splitters (Figuur 1 d, door aanpassing knoppen), evenals de afstand tussen de Achromatische doublet lens en de fiber adapter plaat (figuur 1E, door aanpassing van de z-as vertaling mount) te krijgen maximale laservermogen door middel van de vezel.
      5. Zodra de uitlijning van de eerste laser wordt gedaan, tijdelijk installeren van een paar van irissen en uitlijnen van de rest van de lasers één voor één (figuur 1F). Controleer de uitlijning efficiëntie met een Energiemeter.
      6. Laat een iris aan de voorkant van de plaat van de adapter om de reflecties van de lasers.
         Opmerking: Sterke terug reflecties kunnen de levensduur van de laser bronnen verminderen. U kunt desgewenst kan een optische isolator worden geïnstalleerd voor elk hoofd laser de reflecties om volledig te verwijderen.
   8. Sluit het andere uiteinde van de optische vezel aan de tak van de verlichting van de Microscoop (Figuur 1 H).
   9. Ontwerpen en installeren van de "vergroting lens (mag lens)" door de volgende stappen:
      Opmerking: De lasers voor epi-fluorescentie beeldvorming van het monster kunnen worden gebruikt, maar de grootte van de smalle lichtbundel van elke laser beperkt de verlichte ruimte van het monster tot een gebied meerdere malen kleiner is dan de werkelijke grootte van de bijbehorende camerasensor, speciaal voor de nieuwere camera's (met 18,8 mm in diagonale lengte in vergelijking met de conventionele 11,6 mm lengte). Het is dus wenselijk om uit te breiden van de lichtbundel te bereiken een groter en platter verlichting van het monster.
      1. Het ontwerp van de lens van de mag, die in de arm van de verlichting (Figuur 1 H passen kan).
         Opmerking: Het ontwerp van de lens mag afhankelijk van waar het zal worden geïnstalleerd. Figuur 1 H toont een voorbeeld van de installatie in de arm van de verlichting, maar het kan worden geïnstalleerd op elke plek nadat de laserstralen worden collimated (Zie discussie). Het ontwerp met een computer-aided design / opstelling software.
      2. Plaats twee Achromatische lenzen, een concaaf (brandpuntsafstand = f₁), en een convexe (brandpuntsafstand = f₂) in de huisgemaakte mag lens houder (figuur 2A en 2 C), met een afstand gelijk aan de som van hun brandpuntsafstanden, f₁ + f₂ = (-25) + 50 = 25 mm (figuur 2B).
         Opmerking: Met deze keuze van de brandpuntsafstanden, de lens mag breidt de lichtbundel door f₂/ | f₁| = 2 plooien. De mag-lens biedt veelzijdigheid. Het kan worden verwijderd om te hervatten reguliere verlichting zonder uitbreiding van de balken (figuur 2D) of ingevoegd in de omgekeerde richting te richten de laserstraal om een sterkere excitatie-intensiteit.

2. luchtverontreiniging door emissies pad

Opmerking: De emissie pad bestaat uit een verwisselbare cilindrische lens, een filterwiel barrière, een emissie-splitter en een EMCCD camera (figuur 1G). Om te bereiken de beste punt verspreiden functie (PSF) van afzonderlijke moleculen, de DIC-prisma wordt uit de buurt van het objectief.

1. Custom-ontwerp de cilindrische lens (3D-lens) cassette, die in de handmatige DIC analyzer passen kan invoegen sleuf in het lichaam van de Microscoop (Figuur 3 c).
   Opmerking: Dit ontwerp niet afdoet aan de DIC analyzer aangezien een blok analyzer kan worden ingevoegd in het torentje van het filter.
2. Plaats van de 3D-lens van 10 m van brandpuntsafstand in de cassette en plaatst u deze in de emissie lichtbundel pad naar het effect van astigmatisme worden geschapen voor het extraheren van de z-coördinaat van elke één molecuul¹⁴.
   Opmerking: Optioneel, de 3D-lens cassette kan worden geplaatst in of uit het pad van de emissie (Figuur 3 c).
3. Installeer een multi-band dichroïde balk splitter in het filter torentje binnenkant van het lichaam van de Microscoop.
4. Emissie filters installeren.
   Opmerking: De filters van de emissie worden gekozen afhankelijk van de voorkeur fluorophores. Afhankelijk van de beeldvorming module, worden emissie filters geplaatst op verschillende locaties gebruikt zoals hieronder beschreven:
   1. Bij sequentiële Multi-Color epi-fluorescentie imaging of SR imaging, gebruik emissie filters geplaatst in de barrière filterwiel verbonden naast het lichaam van de Microscoop om te minimaliseren van de trilling in het lichaam van de Microscoop tijdens de channel-schakelaar (figuur 1G).
   2. Plaats voor de gelijktijdige Multi-Color detectie (b.v., smFRET-experimenten), een ander filter instellen in een emissie splitter (selectievakje stap 4 voor meer informatie).
      Opmerking: Meestal een commerciële emissie splitter heeft twee schakelbare modi (dat wil zeggen, "betrokken" of "overslaan" modi). Als u wilt scheiden emissie lichten chromatisch voor gelijktijdige Multi-Color beeldvorming ("betrokken"-modus), een kubus van de filter houdt twee dichroïde beam splitters en drie emissie filters wordt gebruikt ("triple cube," figuur 4C en 4 D). Een lege sleuf in de barrière filterwiel wordt gebruikt in combinatie met de triple kubus. Aan de andere kant, voor sequentiële Multi-Color imaging, is de drievoudige kubus vervangen door een kubus die net een spiegel binnen ("bypass cube," figuur 4A en 4 D heeft).
5. Installeer de EMCCD camera als het laatste deel van het pad van de emissie. Gebruik de USB-PCI-verbinding om een snelle framesnelheid.
   Opmerking: Een EMCCD camera wordt aanbevolen voor de meest gevoelige detectie van single-molecuul kan, maar een geavanceerde sCMOS camera een alternatief.

3. diffractie-beperkte Imaging met Epi-excitatie

1. Pas de excitatie lasers incidentele hoek epi-modus in de arm van de verlichting.
2. Losraken van de 3D-lens als bezig (Figuur 3 c, rechter paneel).
3. Plaats de rondweg kubus in de emissie-splitter (figuur 4A en 4E, onderste paneel).
4. (Optioneel) Plaats de lens mag voor een bredere verlichting gebied (figuur 2D, linkerpaneel).
   Opmerking: Met het gebruik van een mag-lens en een 100 X olie-immersie objectief, ongeveer 91 x 91 µm² kan worden verlicht gelijkmatig, eliminerend de behoefte om een witte lichtbron en meerdere filter kubussen te gebruiken.
5. Een denkbaar software te nemen de Multi-Channel, microscopie en/of Z-stapel, en/of time-lapse afbeeldingen gebruiken.
   Opmerking: Er zijn meerdere programma's beschikbaar voor microscopie imaging, niet alleen van Microscoop fabrikanten, maar ook van andere fabrikanten of open bronontwikkelaars.

4. multi-kanaals Single-molecuul Imaging met inbegrip van smFRET

Opmerking: Verplaatsen naar een "lege" positie in de barrière filterwiel, zodat alle de uitstoot met een golflengte in de tweede set met filters/dichroïde beam splitters in de splitter emissie kan bereiken.

1. Voor het instellen van meerdere kleuren aanpassen single-molecuul detectie van oppervlak-geïmmobiliseerd moleculen¹⁵ met behulp van excitatie van de TIRF, met inbegrip van meting van de smFRET, de excitatie lasers incidentele hoek om de hoek van de TIRF. Los de mag-lens en de 3D-lens.
2. De drie-kanaals mode deelnemen aan de emissie-splitter (figuur 1G) via de volgende stappen uit:
   1. Vervangen van de rondweg kubus met een "kalibratie kubus" waarmee licht om te gaan via alle kanalen (figuur 4B en 4E).
   2. Zet de camera onder DIC (dat wil zeggen, geen emissie filter in de barrière filterwiel) en pas van de opening van de emissie-splitter totdat drie volledig gescheiden kanalen op het scherm verschijnen.
      Opmerking: Voeren deze stap met het licht van de kamer verlicht, zodat het visualiseren van alle kanalen.
   3. De verticale/horizontale aanpassing controle knoppen inschakelen door de emissie-splitter en uitlijnen ruwweg de drie kanalen (figuur 4E en 4F).
   4. Uitschakelen van de camera en de kalibratie-kubus vervangen door een drievoudige kubus (figuur 4C en 4E).
   5. Plaats een monster met 100-nm meerkanaals kralen op de top van de 100 X objectief en focus op het monster.
   6. Zet de camera en de 488-nm laser, zoom in op een van de heldere kralen en fijn het uitlijnen van de drie kanalen door te draaien aan de aanpassing controle knoppen weer (figuur 4E en 4 G).
      Opmerking: 100-nm meerkanaals kralen uitstoten verschillende golflengten van het licht op 488-nm excitatie, waardoor de drie-kanaals-uitlijning.
3. Inschakelen van de camera en de lasers, de focus en vinden een goede positie met een redelijke plek dichtheid. De laser macht en blootstelling tijd tot aanvaardbare niveaus van signal-to-noise en photobleaching aanpassen. De microscopie beeldbewerkingssoftware gebruiken om time-lapse beelden te nemen.

5. SR Imaging

Opmerking: Dit is één-molecuul detectie gebaseerde SR microscopie.

1. U stelt SR beeldvorming, invoegen van de 3D-lens en de lens mag verwijderen. Stel de blootstellingstijd van de camera in de juiste laser kanalen (bijvoorbeeld5-60 ms). Bepalen en de optimale excitatie lasers incidentele hoek om de hoek van de TIRF handmatig in te stellen.
2. Breng de monsterhoeveelheid in SR imaging buffer¹⁶. Toestaan dat de buffer equilibreer gedurende ten minste 10 minuten vóór imaging.
   Opmerking: SR imaging buffer verloopt na ongeveer 1 h, zodat nieuwe SR imaging buffer dienovereenkomstig.
3. Neem een beeld van de DIC voor SR imaging. Gebruiken om te vinden van de juiste objectieve hoogte voor SR, die het astigmatisme effect optimaliseert, DIC imaging om te zoeken naar het middelste vlak van de cellen. Identificeren van het vliegtuig door de hoogte waarop de cellen overgang van "licht" tot "dark" beelden en lijken te worden transparant (figuur 5A, 5Ben 5 C). Nadat de gewenste brandvlak is vastgesteld, gaan de z-drift correctie systeem (figuur 1A).
4. Gedrag SR imaging. De kracht van de laser van 405 nm te houden een redelijke dichtheid van 'knipperen-on' plekken te wijzigen.
   Opmerking: Hoewel het mogelijk handmatig wijzigen van de laser van 405 nm, is het handiger een geprogrammeerde gegevens overname code te handhaven van de dichtheid van "knipperen-on" vlekken uit te voeren. Hier is een voorbeeld van hoe het verloopt automatisch. De broncode is beschikbaar op aanvraag (Figuur 6).
   1. Start de imaging overname met 0 W/cm² violet laser belasting.
   2. Het aantal knipperende-op plekken in een bepaalde periode.
   3. De kracht van de violette laser moduleren zodat het aantal knipperende-op plekken wordt gehouden boven een user-defined "tellen drempel" in het gezichtsveld. De kracht van de violette laser verhogen wanneer het aantal knipperende-op plekken onder de drempel te tellen daalt.
   4. De overname beëindigen wanneer het aantal knipperende-op plekken daalt de tellen drempel met behulp van de kracht van de maximale violette laser.
      Opmerking: De maximale kunnen instellen anders afhankelijk van de helderheid van het monster, maar niet hoger dan 130 W/cm². Afhankelijk van het werkelijke doel van de SR-beeldvorming, kan deze automatische overname code handmatig worden beëindigd op elk gewenste moment.
5. Controleer de knipperende gedrag en spinnen bestemde van de plekken snel na het begin van de overname.
   Opmerking: Als het knipperende gedrag niet ideaal is, de excitatie lasers incidentele hoek wijzigen of vervangen van de beeldvorming buffer. Verwachten een steekproef van de "verticale", "horizontal" en "diamant" vormen van PSF, respectievelijk fluorophores van beneden, boven, en binnen het brandvlak, (figuur 5D). Als de meeste spots Toon verticaal of horizontaal spinnen bestemde, vervolgens het brandvlak uitstaat vanuit het midden van de cellen, dus het experiment beëindigen en het brandvlak opnieuw aanpassen. Een aanwezigheid van de luchtbel in de immersie-olie of andere lokale factoren, kan dit gevolgen hebben voor de spinnen bestemde kwaliteit, dus het kan nodig zijn om de olie vervangen of wijzigen in een ander gebied van de beeldvorming van het monster.
6. Voor de data-analyse, open bron (in NIH ImageJ plugins) of commercieel beschikbare codes op te sporen centroids van elke plek in elk imaging frame en uittreksel van z-waarden van elke vlek uit de x - en y-breedtes¹⁴te gebruiken.
   Opmerking: In dit verslag, een broncode oorspronkelijk ontwikkeld in een van de vroegste single-molecuul detectie gebaseerde SR⁸ is bewerkt voor 3D-detectie¹⁶ en werd gebruikt.
7. In het geval van twee kleuren imaging, het imago van de fluorophore met de langere golflengte van excitatie, gevolgd door degene met de kortere golflengte van excitatie. De geautomatiseerde acquisitie-code op dezelfde manier uitvoeren aan degene die zijn beschreven in stap 5.4, maar met een verschillende beeldvormende laser.
   Opmerking: chromatische aberratie moeten worden gecorrigeerd tussen afbeeldingen met verschillende fluorophores (bijvoorbeeld, rode kleurstof en geel-groene kleurstof). Hier zijn de stappen.
   1. Immobiliseren meerdere 100 nm meerkanaals parels op het glas dekglaasje aan, vermijden van de vorming van clusters.
   2. Het nemen van beelden van hen in verschillende excitatie kanalen.
   3. Uittreksel hun (X, Y, Z) door software (stap 5.6 coördineert).
   4. Uitzetten ΔX_ik = X_1i - X_2i en ΔY_i = Y_1i - Y_2i (ik is voor verschillende parels en 1 en 2 zijn verschillende kleurkanalen) afzonderlijk en ze passen met de juiste functies. Sla de functies.
      Opmerking: Het lineaire functies zijn in de meeste gevallen voldoende. Zodra deze functies zijn bepaald, hoeft deze meting niet te worden herhaald telkens voor imaging.
   5. In de werkelijke twee kleuren SR beeldvorming van een steekproef van belang, de functies van toepassing op de juiste (X, Y) chromatische aberratie. Voor z-directionele chromatische aberratie, voeren het door het verkrijgen van ΔZ = Z₁ - Z-₂ voor meerkanaals kralen of bekende meerkanaals referentiemonsters ontpit samen met het monster van belang.
      Opmerking: in tegenstelling tot (X, Y) chromatische aberratie, z-directionele chromatische aberratie is niet goed-reproduceerbaar in elk experiment, voornamelijk als gevolg van onvolledige z-directionele focus onderhoud op het kanaal over te schakelen. Dus is het aangeraden om uit te voeren van de correctie telkens. ΔZ = Z₁ - Z-₂ is meestal onafhankelijk van (X, Y), dus gewoon een paar kralen of referentiemonsters voldoende per elke samplegebied van belang zou zijn. Uitzetten van de geconstrueerde laatste twee kleuren SR beelden in een 3D-visualisatie software en ΔZ handmatig controleren.

Results

Deze microscoop kan flexibel en reproduceerbare schakelen tussen verschillende beeldvormende methoden. Hier laten we steekproefbeelden verzameld met elke imaging module.

Figuur 5D toont de PSF van het molecuul knipperen-op tijdens de overname SR. Duizenden van dergelijke beelden worden gereconstrueerd voor het genereren van het eindbeeld SR (figuur 5E).

Discussion

Deze hybride Microscoop systeem elimineert de noodzaak voor de aankoop van meerdere microscopen. De totale kosten voor alle onderdelen, inclusief de optische tabel, tabel installatie arbeid, software en werkstation, is ongeveer 230.000 dollar. Aangepaste-machinaal bewerkte onderdelen, inclusief de mag lens en 3D-lens, kost ongeveer $700 (de kosten hangt af van de werkelijke kosten bij verschillende instituten). Typische verkrijgbare geïntegreerde systemen voor single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopie meer dan 3...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Ti-E microscope stand	Nikon	Ti-E
Objective lens	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm	Nikon	Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M	This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block	Nikon	Ti-A	This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system	Nikon	PFS	This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top	TMC	783-655-02R
Optical table bases	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser	Coherent	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser	Crystalaser	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular, M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink	Cobolt	11658 (HS-03)	Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink	Coherent	1193289	Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable	L-com	CC58C-6	RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter	L-com	BA1087	Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter	HOD	SMA-870	Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card	National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Optical Filter Changer
Emission Splitter	Cairn	OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T640LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter	Chroma	T565LPXR-UF2	Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter	Chroma	ET700/75M	Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET595/50M	Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Chroma	ET525/50M	Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set	Chroma	49000	installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 long pass filter	Chroma	T590LPXR-UF1	for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter	Chroma	T525LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter	Chroma	T470LPXR-UF1	for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647)	Chroma	zet640/20x	for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488)	Semrock	LL01-488-25	for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source	Excelitas	X-Cite120LED	used only for DAPI imaging
Mirror mount	Newport	SU100-F3K
Optical posts	Newport	PS-2
Clamping fork	Newport	PS-F
Power Meter	Newport	PMKIT	For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring	Thorlabs	CMRR	used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount	Thorlabs	SM1Z	Z-Axis Translation Mount,