Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

Summary

Het knooppunt en de notochordal plaat zijn voorbijgaande signalering organisatoren in het ontwikkelen van muis-embryo's die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van verschillende technieken. Hier beschrijven we in detail hoe uit te voeren van twee van de technieken voor het bestuderen van hun structuur en morfogenese: 1) scanning elektronen microscopie (SEM); en 2) hele mount immunofluorescentie (WMIF).

Abstract

Het embryo na inplanting muis ondergaat grote vorm veranderingen na de inleiding van gastrulatie en voedselproductie. Een kenmerk van de voedselproductie is de vorming van de voorbijgaande organisatoren, het knooppunt en de notochordal plaat, uit cellen die zijn gepasseerd via de primitiefstreek. De juiste vorming van deze signalering centra is essentieel voor de ontwikkeling van het lichaam-plan en technieken om te visualiseren ze zijn van groot belang voor muis developmental biologen. Het knooppunt en de notochordal plaat liggen op het ventrale oppervlak van gastrulating muis embryo's rond embryonale dag (E) 7.5 van ontwikkeling. Het knooppunt is een beker-vormige structuur waarvan de cellen een één slanke cilium bezitten. De juiste subcellular localisatie en de rotatie van de trilharen in de put knooppunt bepaalt links-rechts asymmetrie. De cellen van de notochordal plaat bezitten ook enkele cilia weliswaar korter is dan die van de cellen van het knooppunt. De notochordal plaat vormt de chorda die als een belangrijk signalering organisator voor somitogenesis en neurale patronen fungeert. Omdat de cellen van het knooppunt en de notochordal plaat Transient aanwezig zijn op het oppervlak en cilia bezitten, kunnen zij worden gevisualiseerd met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM). Onder andere technieken gebruikt om te visualiseren is deze structuren op cellulair niveau hele mount immunofluorescentie (WMIF) met behulp van de antilichamen tegen de proteïnen die zeer op het knooppunt en de notochordal plaat worden uitgedrukt. In dit verslag beschrijven we onze geoptimaliseerde protocollen voor het uitvoeren van SEM en WMIF van het knooppunt en de notochordal plaat in ontwikkelingslanden muis embryo's om te helpen bij de beoordeling van weefsel vorm en cellulaire organisatie bij wild-type en gastrulatie mutant embryo's.

Introduction

Gastrulatie en de begeleidende morfogenetische bewegingen zijn cruciaal voor het vormgeven van de muis embryo¹. De veranderingen in de cellulaire vorm en organisatie tijdens morfogenese dicteren positionele gegevens voor het lot van de cel reguleren ook zodat de daaruit voortvloeiende signaalroutes juist hun functies om te diversifiëren van de nieuw gevormde kiem lagen¹. De vorming van voorbijgaande organiseren van structuren en signalering van centra zoals het knooppunt en het chorda is essentieel voor de uitvoering van de ontwikkelings programma². Developmental biologen hebben een scala aan technieken gebruikt bij het bestuderen van de morfogenese van deze structuren, meest opvallende dat het gebruik van cellulaire verslaggevers en levende ex vivo imaging is te volgen de dynamiek in de cellulaire en subcellular gedrag^{2 ,3,4}. In dit verslag, richten we ons op de beschrijving van de details voor onze geoptimaliseerde protocols voor twee van deze technieken: scanning elektronen microscopie (SEM) en hele mount immunofluorescentie (WMIF), die waren en zijn nog steeds instrumentaal in het bestuderen van de morfogenese van het knooppunt en de notochordal plaat, de voorloper van de chorda.

De muis embryonale knooppunt is een teardrop-vormige kop van cellen, die op het ventrale oppervlak van het embryo van de muis rond de vroege tot late stadia van het hoofd schoot tijdens de gastrulatie en voedselproductie (embryonale day, E7.5-E8 bevindt zich)^{2,5, 6,7}. De notochordal plaat is morfologisch anteriorly afkomstig uit het knooppunt³. Elke cel in het knooppunt en de notochordal plaat wordt gekenmerkt door een enkele cilium die aan de buitenkant uitsteekt, die langer is in knooppunt cellen maar waarvan de lengte varieert met de ontwikkelings fase². De rotatie van de trilharen in de put knooppunt is aangetoond als belangrijk voor signalering die links-rechts asymmetrie⁴bepaalt. De notochordal plaat is de voorloper van de chorda, de signalering center, dat is belangrijk voor de patronen van de aangrenzende somieten en de bovenliggende neurale buis³.

Vanwege de kenmerken van de locatie (oppervlak), vorm (cup) en bezitten verschillende cellulaire buitenconstructies (cilia), is SEM traditioneel gebruikt voor het visualiseren van het knooppunt en de notochordal plaat en het bestuderen van hun vorming en structuur^{2, 7}. SEM wordt ook gebruikt voor het bestuderen van de veranderingen in de structuur van het knooppunt zelf of de trilharen op de cellen in de mutaties die gastrulatie, voedselproductie, evenals cilia vorming^8,9,10beïnvloeden. SEM is een techniek die gebruik maakt van een gerichte lichtbundel van elektronen aan het ondervragen van de topologische ultrastructuur van de buitenste oppervlakte van materialen zoals biologische monsters¹¹. Het monster is meestal vaste, gedroogd en vervolgens sputter-gecoat met metalen voor observatie onder een Scannende Elektronen Microscoop zoals in stap 1 beschreven.

WMIF is een kleuring techniek voor het visualiseren van gene producten, zoals eiwitten, in drie dimensies (3D). WMIF van weefsels, organen of zelfs hele organismen geeft ruimtelijke informatie over de distributie van het signaal en de vorm van de resulterende structuur in 3D. De techniek is gebaseerd op de vaststelling van het monster het vervolgens kleuring met fluorescerende geconjugeerde. Muis embryo's ~ E7.5 zijn klein, transparant en dus ideaal voor WMIF protocollen bij het visualiseren van het knooppunt en de notochordal plaat. Bijvoorbeeld, de transcriptiefactor Barchyury (T) wordt uitgedrukt in de kernen van het knooppunt en de notochordal plaat, en in mindere mate in de primitiefstreek, rond E7.5-E8 van embryonale ontwikkeling en goed werkende antilichamen tegen T door WMIF zijn commercieel beschikbaar en de kleuring procedure mogelijk te maken. De cellen van het knooppunt en de notochordal plaat worden ook gekenmerkt door vernauwde apicale oppervlakken, die het gezicht van de buitenkant en dus kunnen worden gekleurd met fluorescentie-geconjugeerde Phalloidin aan mark F-actine in de apicale beperkingen. Deze reagentia als voorbeelden gebruikt, biedt de combinatie van T en de F-actine kleuring door WMIF een weergave van het knooppunt en de notochordal plaat in 3D in gastrulating muis embryo's zoals we in stap 2 ⁸aantonen. Markers van cilia, zoals ARL13B of geacetyleerd tubuline, evenals andere merkers van het knooppunt en de notochordal plaat, zoals FOXA2, kunnen echter ook worden gebruikt voor het uitvoeren van WMIF op ontwikkelingslanden muis embryo's-^3,4.

We hebben aangetoond dat striatin-interactie eiwit 1 (STRIP1) essentieel voor normale gastrulatie en voedselproductie in de muis embryo^{8 is}. STRIP1 is een kernonderdeel van de striatin-interactie phosphatases en kinases complexen (STRIPAK), die wij en anderen hebben betrokken in de actine cytoskelet organisatie^8,12. Een groot gebrek in Strip1 mutant embryo's is in de vorming van de axiale mesoderm (knooppunt en notochordal plaat) en uitbreiding van het antero-posterior lichaam as. Wij zijn gewend SEM en WMIF analyseren het knooppunt en de notochordal plaat in wild-type (WT) en Strip1 mutant embryo's als we in de Resultaten van de vertegenwoordiger en de overeenkomstige cijfers weergeven.

Protocol

Alle experimenten met betrekking tot dierproeven zijn goedgekeurd door de verantwoordelijke autoriteiten in Noord-Rhein Westfalen (LANUV-NRW).

1. scanning elektronen microscopie van de muis embryonale knooppunt

1. De zwangere vrouwelijke muis offeren ~ E7.5 (2-4 Somiet fase) door cervicale dislocatie. Een gedetailleerde uitleg met diagrammen van stappen 1.1 - 1.7 is beschikbaar in muis embryo laboratorium handleidingen¹³.
2. Open de buik door de huid en de mesenteries en het verwijderen van de baarmoeder met schaar en fijne pincet.
3. Spoel de baarmoeder kort in gedistilleerd water en breng dit in een kleine schone petrischaal (6 cm) met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
4. Verwijder de baarmoeder spieren om vrij van de afzonderlijke deciduae of de implantatie sites onder een microscoop te ontleden en het gebruik van fijne pincet.
5. Houd elke decidua met één paar pincet en het andere paar gebruik te maken van een longitudinale full-dikte snede tussen de rode gedeelte (toekomstige placenta) en witte gedeelte (waar het embryo zich bevindt). Oppervlakkige perforaties verticaal langs het witte deel van de decidua aaneengesloten waren met de incisie maken Trek de decidua apart horizontaal in twee helften en zorgvuldig schep het embryo in het witte deel van de decidua.
6. Het embryo overbrengen in een nieuwe petrischaal (35 mm) met verse steriele gefiltreerd PBS. Herhaal voor alle deciduae/embryo's.
7. Verwijderen van Reichert membraan, een relatief ondoorzichtige membraan Djaja van het embryo, van elk embryo door plagen het weg als een sok basisgewicht van de kegel van ectoplacental (roodachtig implantatie site). Voor genotypering, neem een klein stukje (~ 0,1 mm²) van de dooierzak in dit stadium.
8. Onder een chemische kap en het dragen van passende bescherming (handschoenen), wordt het embryo's overbrengen door EM rang fixeerspray samengesteld van 2,5% Glutaaraldehyde in steriele gefiltreerd PBS in een buis van de microcentrifuge (1,5 mL) bij kamertemperatuur. Bevestigen van de embryo's 's nachts bij 4 ° C.
9. Zorgvuldig de Glutaaraldehyde fixeerspray verwijderen uit de buis zonder het aanraken van de embryo's en gooi deze weg in een juiste afval container. Spoel de embryo's driemaal in steriele gefiltreerd PBS, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
10. Uitdrogen van de embryo's in een serie van ethanol voor elke 5 min: 50%, 70%, 85% en drie keer in de 100% of absolute ethanol. Opslaan van de embryo's op −20 ° C in ethanol of ga direct naar de volgende stap.
11. De embryo's in ethanol overbrengen in manden voor kritische punt (CPD) drogen in een droger machine van kritieke punt. De kamer met ethanol ter dekking van de manden volledig vullen.
12. Wisselen van de ethanol door zorgvuldig te spoelen met vloeibare CO₂ voor tien keer bij 10 ° C. Afvoer van vloeibare CO₂ na de laatste stap totdat de kamer half vol is. Verwarm tot 40 ° C tot de druk 80 bars (het kritieke punt bereikt) en de vloeibare CO₂ gas omgezet. Wacht 10 min dan langzaam uit het gas te blazen over ongeveer 45 min.
13. Als een gemakkelijker alternatief voor CPD voor het drogen, voeg toe hexamethyldisilazane (HMDS) bij een verhouding van 1:1 aan de embryo's in ethanol voor 30 min. Vervolgens transfer van de embryo's naar pure HMDS voor 30 min. verwijderen de embryo's uit de vloeistof met behulp van een precisiepipet en laat ze drogen voor 30 min.
    Opmerking: Beide drogen methoden werkte even goed in onze handen.
14. Gebruik een fijne borstel te monteren de gedroogde embryo's met de ventrale zijde (knooppunt) omhoog op een SEM beginnetje met dubbele dubbelzijdige tape.
15. De categorie: met de embryo's invoegen in een sputter coating machine voor gouden deeltje coating, die heeft de voorkeur om te laden van de lange dunne cilia. Breng een laag van 120-150 Å; de tijd is afhankelijk van de stroom, die met elk monster variëren zal.
16. Plaats van de gecoate stubs met embryo's in een SEM-Microscoop, vacuüm van toepassing en observeren van de embryonale knooppunt en de notochordal plaat cellen met cilia bij vergrotingen variërend van 1000 X tot en met 15, 000 X.

2. de hele Mount immunofluorescentie van de muis knooppunt en de Notochordal plaat

1. Ijskoude PBS met 0,05% stappen tween-20 (PBSTw), 1.1-1.7 hierboven om te verwijderen van de embryo's op E7.75 en plaats ze in PBSTw in een 35 mm petrischaal op ijs.
2. Houdt in een chemische kap en het dragen van passende bescherming (handschoenen), de embryo's tot een kleefpoeders oplossing van 4% paraformaldehyde in PBS in een microcentrifuge buis. Bevestigen van de embryo's 's nachts bij 4 ° C.
3. Zorgvuldig de paraformaldehyde-fixeerspray verwijderen uit de buis zonder het aanraken van de embryo's en gooi deze weg in een juiste afval container. Wassen van de embryo's drie keer in PBS met 0,2% Triton X-100 (PBSTr) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Alle wassen en incubatie vervolgstappen op een shaker nutating uitvoeren.
4. Verwijder de laatste wasbeurt en blokkerende oplossing met PBSTr met 10% warmte-geïnactiveerd serum (uit de host-soort van het secundaire antilichaam) toevoegen. Blok van 2 uur 's nachts (of langer) op een nutator bij 4 ° C.
5. Verwijder de blokkering en voeg ~ 1 mL van het primaire antilichaam verdunde oplossing, bijvoorbeeld een anti-T-antilichaam bij 1:500 verdunning te blokkeren. Incubeer 's nachts (of meer) op een nutator bij 4 ° C.
6. Verwijder het primaire antilichaam en op te slaan voor later gebruik door natriumazide toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,02% (1 µL van 20% aandelen tot 1 mL van antilichaam oplossing). Het antilichaam kan worden hergebruikt ~ 10 keer. Spoel de embryo's tweemaal met PBSTr en daarna wassen ze drie keer voor elke 30 min op een nutator bij 4 ° C.
7. Vervang het wassen met een fluorescentie-geconjugeerde secundair antilichaam, tegen het primaire antilichaam host soorten, verdund op ~ 1:1000 overnachting (of langer) op een nutator bij 4 ° C.
8. Het secundaire antilichaam verwijderen en spoel tweemaal met PBSTr, dan wassen drie keer, gedurende 30 min met PBSTr.
9. De laatste was vervangen door PBSTr met 1:500 de phalloidin van de fluorescentie-geconjugeerde, om vlek F-actine en 1:1000 DAPI, vlek kernen, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
10. Spoel tweemaal in PBSTr en een keer wassen met PBSTr gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
11. Vervang PBSTr door PBS en laat de embryo's op ijs. Bereiden schoon positief-geladen dia's (60 x 24 mm) en coverslips (24 x 24 mm) en waterige glycerol gebaseerde montage media, bijvoorbeeld 90% glycerol in 1xPBS en een antifade reagens, monteren van de embryo's.
12. Twee stukken van duidelijke tape zetten op een afstand van ~ 15 mm van elkaar op het duidelijk deel van de dia. Hierdoor ontstaat voldoende 3D-ruimte (in de Z-dimensie) die het mogelijk maken het afvlakken van de embryo's, maar niet volledig squishing hen.
13. Onder een Microscoop ontleden, zorgvuldig de embryo's met behulp van een gesneden P200 precisiepipet (voor voldoende ruimte voor het embryo worden overgebracht en niet beschadigd) naar de dia te verplaatsen.
14. Met behulp van fijne pincet, maken twee volledige bezuinigingen aan de laterale zijden van de dooierzak te ontvouwen van het embryo. Plaats het embryo met de ventrale zijde (knooppunt en notochordal plaat) omhoog (dorsale van neurale buis naar beneden op de dia).
15. Voeg 50 µL van montage van media op het embryo. 4-5 embryo's per dia plaats. Voeg een schar van montage media aan de zijkant van het dekglaasje aan die eerst aanraken van de dia (bovenste of onderste kant), dan plaatst u deze tussen de twee stukken van de tape en lagere het langzaam op de embryo's met fijne pincet of een gebogen fijne naald terwijl het vermijden van luchtbellen te creëren.
16. Reinig de overtollige montage media met behulp van een absorberend doekje. Wees voorzichtig niet te verhuizen van het dekglaasje aan in het proces.
17. Met behulp van een royaal bedrag van nagellak, het zegel van de zijkanten van het dekglaasje aan zonder het te verplaatsen.
18. Observeren onder een scanning confocal microscoop.

Results

Om te onderzoeken van de vorming van het knooppunt in WT en Strip1 mutant embryo's op ~ E7.5, we gebruikten SEM als in stap 1 beschreven en afgebeeld in Figuur 1-⁸. De ultrastructurele details van de buiten topologie gebruiken SEM waren heel informatief en het was meteen duidelijk dat in tegenstelling tot de pit-vormige knooppunt in WT embryo's, de mutant embryo's had een afgevlakte en onregelmatige knooppunt. Hogere vergroting van de embryo's toonde de karakteristieke trilharen op knooppunt cellen die ondubbelzinnig heeft vastgesteld dat ze. De schijnbare lagere dichtheid van de trilharen in de mutant is mogelijk te wijten aan het verlies van knooppunt pit structuur en kromming of een lager aantal cellen van het knooppunt. De notochordal plaat die blijkens het knooppunt emanating was ook onregelmatig in de mutant embryo's. Ze waren herkenbaar met hun kortere cilia. SEM was daarom belangrijk te onthullen het knooppunt morfogenese defecten in Strip1 mutanten⁸. Wij zijn ook gewend SEM in eerdere studies tonen het ontbreken van cilia in het embryonale knooppunt van mutanten dat centrioles, die de sjabloon cilia^{9 voorzien}ontbrak.

Studeren de axiale mesoderm vorming gebreken in Strip1 mutant embryo's op cellulair niveau, we gebruikten WMIF als beschreven in stap 2 en getoond in Figuur 2. Met deze techniek kan waren het knooppunt en de notochordal plaat gemakkelijk geïdentificeerd door F-actine en T kleuring. WT-knooppunt en notochordal plaat cellen hebben beperkt apicale domeinen waar F-actine werd verrijkt, en nucleaire T kleuring was duidelijk. De notochordal plaat rostrally uitgebreid in de WT maar was kort en onregelmatig in de mutant. De gegevens bleek dat F-actine organisatie abnormale in de verschillende lagen van de kiem van de mutant embryo's met inbegrip van de axiale mesoderm⁸. WMIF was dus instrumentale de gebreken in het knooppunt en de vorming van de notochordal plaat in Strip1 mutant embryo's te bestuderen.

Figuur 1 . De gebreken in het knooppunt morfogenese in Strip1 mutant muis embryo's scanning elektronen microscopie onthult. (Boven) SEM analyses van WT en Strip1 mutant ventrale embryonale knooppunten en notochordal platen (Noto)⁸. Een voorbeeld van een lage vergroting afbeelding van een embryo WT wordt weergegeven aan de linkerkant. (Onder) Hogere vergrotingen van het midden van de knooppunten weergegeven bovenop onthullen de lange monocilia projecteren vanuit het knooppunt cellen. Anterieure is in alle panelen. Schaal bars: 30 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 . Hele mount immunofluorescentie toont de abnormale knooppunt en de notochordal plaat op cellulair niveau in mutant embryo's van Strip1 . (Boven) Ventrale 3D rendering (Volocity software) van WMIF naar WT en Strip1 mutant embryo's met behulp van een combinatie van fluorescentie-geconjugeerde phalloidin (F-actine, rood) en T antilichaam (groen) vlekken. (Onder) Meer voorbeelden van de kleuring hierboven te richten op het knooppunt met hogere zoom en met inbegrip van de DAPI afgebeeld. Anterieure is in alle panelen. Schaal bars: 30 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In dit werk, laten we zien hoe SEM en WMIF te visualiseren de muis embryonale knooppunt en de notochordal plaat uit te voeren. De geringe omvang van de embryo's gastrulating muis ~ E7.5 en de aanwezigheid van deze structuren op het oppervlak maken ze ideaal om te studeren met behulp van de technieken beschreven^2,7,8. De beschikbaarheid van goede antilichamen, zoals markeringen, T en cilia, geeft uitstekende 3D-informatie met behulp van WMIF op de structuur, de organisatie en de vorming van deze essentiële embryonale organisatoren⁸.

Omdat de opbrengsten van muis embryonale ontwikkeling in een zeer snel tempo en het knooppunt en de notochordal plaat alleen Transient aanwezig op het oppervlak van het embryo zijn, is timing essentieel voor het succes van deze experimenten^2,3. 2-4 Somiet embryo's zijn bijvoorbeeld goed voor SEM analyse van een volwassen knooppunt put met lange cilia. In veel vroegere of latere embryo's (bijvoorbeeld 12 uur vóór of na), het knooppunt mogelijk niet aanwezig op het oppervlak. WMIF is een beetje meer flexibel in dit verband maar de structuren zelf zijn ook voorbijgaande tijdens de ontwikkeling en de timing in dit geval hangt de onderzoekers belangen.

De zuiverheid van de reagentia is ook essentieel voor het succes van deze technieken, met name in de ultrastructuur indringende door SEM. Tiny onzuiverheden die aan de embryo's meestal vasthouden leiden tot enorme artefacten.

We hebben twee verschillende methoden van embryo fixatie voor SEM een getest met behulp van halve Karnovsky van fixeer (2,5% Glutaaraldehyde, 2% paraformaldehyde en 0,1 M cacodylate buffer) en een eenvoudiger 2,5% Glutaaraldehyde in 1 x PBS. Wij verkiezen de Glutaaraldehyde en PBS fixeerspray zoals beschreven in stap 1 te gebruiken, echter wij en anderen hebben ook de halve Karnovsky-fixeerspray met succes gebruikt voor SEM.

We hebben ook twee methoden voor het drogen van de embryo's voor SEM vergeleken en vond geen verschil in de kwaliteit van het monster met behulp van een kritisch punt droger of HMDS zoals beschreven in stap 1 en gerapporteerd elders¹⁴.

Voor stap 2, we getest insluiten van de embryo's nadat de definitieve wassen stappen in 1% lage smeltende agarose gemonteerd op een 35 mm glazen-bodem schotel en vervolgens topping het met ~ 10 µL van montage medium. Dit verzonken methode werkt en behoudt de oorspronkelijke 3D-structuur van het embryo en bijbehorende structuren; een multiphoton Microscoop is echter vereist om het imago van het model, omdat een regelmatige confocal microscoop kan niet zo diep in de intact embryo's bereiken (~ 1 mm).

Wij zijn van mening dat met behulp van deze twee technieken geeft aanvullende informatie over de structuur van het knooppunt en de notochordal plaat tijdens normale ontwikkeling en mutanten die gebreken in de vorming van deze structuren vertonen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)	Carl Roth	3840
Anti-T antibody	R&D Systems	AF2058
Critical Point Dryer	Blazers Union	CPD 020
DAPI	AppliChem	A4099,0005
Glutardialdehyde solution 25%	Merck	1042390250
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	AppliChem	A4974,0500
SEM coating unit PS3	Agar Aids for Electron Microscopy	PS3
SEM microscope Quantum FEG 250	ThermoFisher Scientific (FEI)	Quantum FEG 250