Methodenartikel

Een anaërobe Biosensor Assay voor het opsporen van kwik en Cadmium

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58324

⸱

17 december 2018

 ,  , 
1Department of Biology, University of Ottawa

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van een anaërobe geheel cellen microbiële biosensor te evalueren van hoe verschillende milieu variabelen beïnvloeden de biodisponibiliteit van Hg en Cd voor bacteriën in een zuurstofvrije omgeving.

Samenvatting

Kwik (Hg) biologische beschikbaarheid aan microben is een belangrijke stap naar giftige Hg biomagnificatie in voedsel webs. Cadmium (Cd) transformaties en biologische beschikbaarheid aan bacteriën bepalen het bedrag dat zich in het hoofdvoedsel gewassen ophopen zal. De biodisponibiliteit van deze metalen is afhankelijk van hun soortvorming in oplossing, maar meer in het bijzonder onder zuurstofvrije omstandigheden waar Hg is gemethyleerd aan giftige monomethylmercury (MeHg) en Cd aanhoudt in de rizosfeer. Hele cellen microbiële biosensoren geven een kwantificeerbare signaal als een metaal het cytosol binnenkomt en daarom nuttige tools zijn voor het evalueren van metalen biologische beschikbaarheid. Helaas hebben de meeste biosensing inspanningen tot nu toe is beperkt tot IME omgevingen als gevolg van de beperkte capaciteit van bestaande verslaggever eiwitten te laten functioneren in de afwezigheid van zuurstof. In dit onderzoek presenteren wij onze inspanning om te ontwikkelen en optimaliseren van een geheel-cel biosensor assay staat werking anaëroob dat metalen onder zuurstofvrije omstandigheden in quasi-real-time en binnen enkele uren detecteren kan. We beschrijven hoe de biosensor kan helpen beoordelen hoe chemische variabelen relevant zijn voor het milieu fietsen van metalen beïnvloeden hun biologische beschikbaarheid. Het volgende protocol bevat methoden ter (1) voorbereiding van Hg en Cd normen onder zuurstofvrije omstandigheden, (2) de biosensor bij gebrek aan zuurstof, (3) ontwerp voorbereiden en uitvoeren van een experiment om te bepalen hoe een aantal variabele beïnvloedt Hg of Cd biologische beschikbaarheid, en (4) te kwantificeren en te interpreteren biosensor gegevens. Wij tonen de lineaire bereiken van de biosensoren en bieden voorbeelden laten zien van de methode kunnen onderscheid maken tussen metalen biologische beschikbaarheid en toxiciteit door gebruik te maken van metal-afleidbare zowel constitutieve stammen.

Inleiding

Kwik (Hg) is een wereldwijde verontreinigende stof en de biologische beschikbaarheid aan Hg methylerend microben is de eerste stap naar de biomagnificatie via voedsel webs en mogelijk neurotoxische effecten in mens en natuur1. Er wordt op dit moment gedacht dat microbiële methylation van Hg is een intracellulair proces dat vereist: i) de soorten Hg als biologisch beschikbare2,3,4,5,6,7 en ii) voor de cel te kunnen fysiologisch methylerend Hg8,9,10. Cadmium (Cd) bioaccumulates in organismen, maar doet niet biomagnifies in foodwebs en wordt veel gebruikt in industriële en commerciële processen die vaak acute blootstelling in mensen en het milieu11 veroorzaken. Hoewel microben verschillende spelen een belangrijke rol in het lot van Hg in het milieu spelen, richten de meeste studies over Cd geochemie en ecotoxicologie op microbiële eukaryoten12. Consumptie van landbouwproducten (bijvoorbeeld rijst) is de belangrijkste bron van directe blootstelling aan cadmium; in dit geval de biodisponibiliteit van Cd naar microben van de rhizosfeer rechtstreeks van invloed op de hoeveelheid planten kunnen accumuleren13.

HG vervoer trajecten zijn complex en eventueel betrekken een actief transport stap14. Wanneer een vervoerder is betrokken, recent werk voorgesteld dat HgII een Zn gebruiktII of MnII transporter7,15,16,17. Overwegende dat de CdII is veronderstelde om per ongeluk worden vervoerd in het cytosol via divalente metalen vervoer wegen (vooral MnII of ZnII), mechanismen van CdII vervoer binnen de cellen blijven speculatieve en geen Cd-specifieke vervoer traject geweest geïdentificeerde13,18. Ongeacht de aard van de betrokken vervoerders, drie mechanistische factoren bepalen uiteindelijk het vermogen van metalen tot het invoeren van een cel: i) de metalen soortvorming in oplossing2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) de biophysiochemical eigenschappen van de celmembraan17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, en iii) de mogelijkheid voor het metaal tot een vervoer site7,32. CD en Hg zijn waarschijnlijk niet bestaat als vrije ionen microbiële fysiologisch relevante omstandigheden vanwege hun hoge affiniteit voor opgeloste organische materie (DOM), chelaat verontreinigingen (bijvoorbeeld EDTA), of zwavel wordt33, verminderd 34,35 (CdII kan bestaan als een vrije ion of formulier ion-paren in de afwezigheid van deze liganden). Er is een gebrek aan efficiënte methoden in om te bepalen hoe deze metalen soorten biologisch beschikbaar onder omstandigheden met betrekking tot hun lot in het milieu. Bijvoorbeeld, Hg is gemethyleerd onder anaërobe omstandigheden14, en zowel cadmium en Hg zijn zachte metalen (of klasse B kationen), vereisen dat hun soortvorming onder omstandigheden die de integriteit van verminderde zwavel groepen behouden worden onderzocht.

Microbiële biosensoren zijn bacteriële cellen die een kwantificeerbare signaal in reactie op de intracellulaire concentraties van metaal, in dit geval Hg of Cd uitstoten. Als zodanig zijn ze ideaal hulpmiddelen om te begrijpen hoe metalen Voer een cel36, mits de blootstellingsvoorwaarden zijn zorgvuldig gecontroleerd voor. HG biosensoren bevatten doorgaans gene fusies tussen de regelgevende circuits van de mer-operon (inclusief genen coderend voor de transcriptie regulator MerRas evenals de operator en de promotor voor regio's van het operon), query's en rapporten genen (b.v., Lux, gfp, lac genen). Als kwik in het cytoplasma aanwezig is, zal het binden aan MerR, resulterend in de transcriptie van de rapportage genen en de daaropvolgende signaal productie19,37. Specifieke Cd biosensoren zijn meestal ontworpen met behulp van de cadC, cadAC, zntA of zntR gecodeerd transcriptie regelgevers38, maar het is vermeldenswaard dat MerR een lagere, maar meetbare affiniteit met Cd5 heeft. Als gevolg van aërobe beperking van de meeste gebruikte luminescent of TL verslaggever eiwitten, totdat onlangs microbiële biosensoren bleef niet bieden inzicht in de biotransformatie van metalen onder zuurstofvrije omstandigheden. Dit maakt anaërobe opsporing van metalen biobeschikbaarheid zeer moeilijk over een scala van omstandigheden relevant zijn voor hun verspreiding in het milieu, specifiek in het bijzijn van de redox gevoelige liganden (bijvoorbeeld sulfide en thiolen)4, 5 , 39.

Ter verzachting van de methodologische horde van beeldvorming bij gebrek aan zuurstof, Drepper et al. leven (2007) hebben een flavin gebaseerde fluorescente proteïne (FbFp) ontwikkeld, gebaseerd op lichte zuurstof-spanning domein SB2 eiwit van P. putida. Deze eiwit-familie vermag fluoresceren bij gebrek aan zuurstof40. Voortbouwend op de werkzaamheden van Drepper et al., ontworpen ons lab een anaërobe biosensor waardoor voor de studie van Hg biobeschikbaarheid IME en zuurstofvrije omstandigheden en over een breed scala aan zoutgehalte 17. In het huidige document beschrijven we hoe te bereiden en gebruiken van de biosensor om te testen omgevingsvariabelen invloed op Hg of Cd biologische beschikbaarheid. Hoewel we de biosensor ontwikkeld voor HgII, kozen we voor het uitvoeren van experimenten met CdII als een middel om te trekken de aandacht van de lezer op het feit dat biosensoren reageert ook op meerdere stressoren die zijn waarschijnlijk mede in milieu matrices; in dit geval CdII werd onderzocht omdat het is bekend om te binden aan de transcriptionele regelgever MerR5. Hier, laten we representatieve kalibratie en functionele lineaire bereiken met betrekking tot beide metaal. Ook geven wij een voorbeeld wanneer de biosensor de resultaten zijn overtuigend (MgII en MnII over Hg biologische beschikbaarheid) en onduidelijk (ZnII over Hg biologische beschikbaarheid).

Protocol

1. groei Media en blootstelling Media voorbereiding

  1. 250 mL groeimediummaken:
    Opmerking: Wanneer de spoorelementen #1 oplossing en sporenelementen #2 oplossing zijn al voorbereid, wip voor trede 1.1.5.
    1. Bereiden van sporenelementen #1 oplossing in een schone maatkolf (200 mL) bevat de laatste molarities van 1.5 x 10-3 M Na2MoO4, 6,5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3en 0,1 M NaOH.
      Let op: Sterke basen (NaOH) zijn bijtende. Maak zeker wanneer het gewicht van de reagentia om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke molarity de belangrijkste sporenelementen vertegenwoordigt; Mo, Se en B.
    2. Onder een steriel veld filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm polyethersulfon spuit filter in een fles van de schoon/steriele kunststof/polytetrafluorethyleen (PTFE).
    3. Bereiden van sporenelementen #2 oplossing in een schone maatkolf (200 mL) bevat de laatste molarities van 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl 2, en 0,1 M H2zo4.
      Let op: Sterke zuren (H2SO4) corrosief. Maak zeker wanneer het gewicht van de reagentia om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke molarity de belangrijkste sporenelementen vertegenwoordigt; MN, Zn, Co, en Ni.
    4. Onder een steriel veld filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm polyethersulfon spuit filter in een schone fles.
    5. Onder een steriel veld in een schoon/steriele glazen fles (250 mL minimum); Voeg 200 mL ultrazuiver water, 42.5 mL M9 minimale zouten (5 x; Zie Tabel of Materials), 2,5 mL 125 µL van 2 M MgSO4, 2 M Glucose, 1200 µL van 0,6 M Thiamine HCl uit een bevroren (-20 ˚C) hoeveelheid, 1,25 mL 4 M NaNO3 , 770 µL van 0.075 M L-leucine / L-isoleucine / valine oplossing, 250 µL sporenelementen #1250 µL van spoorelement #2en 250 µL van 0,01 M EDTA natrium zout.
      Opmerking: Alle reagentia in stap 1.1.5 moeten bereid zijn prior en filter gesteriliseerd met behulp van een filter van 0,22 µm polyethersulfon spuit. Ultrazuiver water kan gesteriliseerd worden met behulp van een autoclaaf.
    6. Neem de glazen fles nu met de oplossing van stap 1.1.5., losjes kapje en het doorlopen van de anaërobe kamer lucht sluis.
    7. Voeg in de anaërobe kamer, 15 µL van 0.225 M FeSO4 in 0,2 M H2zodat4, PET fles strak, en schud totdat alle witte precipitaten verdwijnen.
      Opmerking: Alle reagentia in stap 1.1.7 moeten bereid zijn prior en filter gesteriliseerd met behulp van een filter van 0,22 µm polyethersulfon spuit. De 0.225 M FeSO4 opslaan in 0,2 M H2dus4 in de anaërobe kamer.
    8. Verwijder de dop van de fles, wacht 1 minuut voor lucht te wisselen, vervangt de dop van de fles, en dan goed schudden. Herhaal deze stap eenmaal.
    9. Fast GLB strak op de fles, verwijderen van anaërobe kameren fles in de koelkast (4 ˚C) bewaren tot gebruik.
    10. Groeimedium moet eenmaal per week worden vernieuwd door 1.1.5 tot en met 1.1.9 stappen te herhalen.
  2. Te maken van 100 mL van blootstelling medium in 2 x 50 mL conische steriele polypropyleen centrifuge buizen:
    Opmerking: Wij raden dat blootstelling medium worden voorbereid op de dag van de bepaling van de blootstelling tot een minimum beperken van het risico van besmetting, maar het kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen in de koelkast.
    1. In de anaërobe kamer, aan elke 50 mL centrifugebuis 42 mL toevoegen van anaërobe ultrazuiver water, 350 µL van 1 M natrium Beta-Gylcerophosphate van een hoeveelheid bevroren (-20 ˚C), 2 mL 1 M WIPES gratis zo zuur, 50 μl van 1 M (NH4)24 , 125 μL van 2 M Glucose, 300 μL van 2,5 M KOH en 200 μL van 2,5 M NaOH.
      Opmerking: Alle reagentia in stap 1.2.1 moeten bereid zijn prior en filter gesteriliseerd met behulp van een filter van 0,22 µm polyethersulfon spuit. Ultrazuiver water kan zijn warmte gesteriliseerd met een autoclaaf. 2.5 M NaOH en 2.5 M NaOH moeten worden opgeslagen in plastic/PTFE flessen. Alle reagentia genoemd moeten worden opgeslagen in de anaërobe kamer behalve natrium Beta-Gylcerophosphate, die moet worden opgeslagen in een diepvriezer (-20 ˚C). In het algemeen, is het goede gewoonte geven alle plastic of glas onderdelen en containers voor meerdere dagen in de anaërobe kamer om ervoor te zorgen dat er geen sporen van zuurstof blijven.
    2. De 50 mL centrifuge buizen van het GLB, goed schudden en verwijderen van een aliquoot deel van 10 mL voor het meten van de pH. De gemeten pH van deze media blootstelling moet altijd 7,00 ± 0,02 op 25 ˚Cmeten. Als de pH niet binnen dit bereik meet, passen de hoeveelheid toegevoegde 2,5 M KOH om te corrigeren voor dit.
      Opmerking: Nooit Titreer de oplossing om te corrigeren voor de pH met een pH-sonde. pH-sondes vormen een bron van verontreiniging zijn voor de blootstelling medium. De pH moet altijd een product van de toegevoegde reagentia in stap 1.2.1.
  3. Bereiden van een stamoplossing van 5-10 mM NaNO3 en laat in anaërobe kamer moet worden gebruikt tijdens de tijd van de bepaling van de blootstelling.
    Opmerking: Het is gemakkelijker om een meer geconcentreerde primaire NaNO3 standaard in tegenstelling tot het maken van een 5-10 mM NaNO3 primaire standaard verdunnen.

2. voorbereiding van kwik en Cadmium normen.

  1. Voorbereiding van een 4-8 µM kwik (HgII) oplossing in 0,2 M H2SO4.
    1. Bereid een Hg2 + door het maken van een millimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 of HgSO4 oplossing in 0,2 M H2SO4.
      Let op: Kwik is bijzonder giftig en H2dus4 corrosief is. Werken in fume hoods met alle vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Verdun in een fles van PTFE, standaard van 2.1.1. in 0,2 M H2SO4 te verkrijgen van een concentratie binnen het bereik van 4-8 µM Hg2 +.
      Opmerking: Het zuur gebruikt moet p.a. H2dus4.
    3. De concentratie van de Hg uit 2.1.2 moet worden gevalideerd met behulp van een kwik-analyzer (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Andere methoden voor het valideren van de concentratie van de Hg kunnen worden gebruikt.
  2. Voorbereiding van een 10 µM CdII oplossing in 10 mM H2SO4.
    1. Bereiden van een primaire standaard voor CdCl2 (10-50 mM bereik voor het nauwkeurig wegen van poeder) in 0,1 M H2SO4.
    2. In een aantal seriële verdunningen schoon zure gespoeld 20 ml borosilicaatglas flesjes met zwarte fenolische schroefdoppen met PTFE geconfronteerd rubber voering, verdunnen van de standaard van 2.2.1 tot 10 µM Cd2 +. Zorg ervoor dat de concentratie van H2dus4 in elke latere seriële verdunning 10 mM blijft.

3. voorbereiding van de Biosensor anaërobe blootstelling Assay

  1. Plaat de kwik afleidbare biosensor (E. coli NEB5α herbergen van PUC57merR-PpFbFp) en de constitutively uitgedrukt biosensor (E. coli NEB5α PUC19Balch-PpFbFp herbergen) van-80 ˚C cryostock op lysogenie Bouillon platen met 120 mg/mL ampicilline. Zie ons eerder gepubliceerde werk voor meer informatie over de productie van deze biosensoren17.
  2. Op 4:30-5 PM, een cultuur in LB (+ amp) 10 mL beënten en 's nachts groeien.
    Opmerking: Vanaf een plaat het duurt 2 dagen ter voorbereiding van de anaërobe cultuur voor de bepaling van de blootstelling (dat wil zeggen, een cultuur begon op maandag middag (4:30-5 PM) zal klaar zijn voor de bepaling van de blootstelling op rond het middaguur op woensdag). De volgende stappen zijn de vereiste microbiologische technieken nodig om de culturen voor te bereiden op de dag van de bepaling van de blootstelling.
    1. Neem een kolonie van de cultuur van de plaat en voeg tot 10 mL lysogenie Bouillon (LB) met 21 µL van een stamoplossing van 100 mg/mL ampicilline natrium zout (eindconcentratie is 210 mg/mL versterker) in een steriele cultuur buis.
    2. Plaats van de cultuur in een broedstoof/shaker en 's nachts groeien op +37 ˚C met schudden van 220 toeren per minuut.
  3. De volgende ochtend om 9-10u, resuspendeer de cultuur en anaëroob groeien gedurende de dag (20% entmateriaal).
    1. De cultuur van de incubator (stap 3.2.1) en het groeimedium (stap 1.1.9) in de anaërobe kamerbrengen.
    2. Voeg 8 mL verse groeimedium en ampicilline (210 μg/mL) in een steriele Balch-buis.
    3. 2 mL van de overnachting volwassen cultuur en overdracht in een 2 mL Microcentrifuge buis verzamelen. Centrifugeer bij 10.000 RCF stap gedurende 90 seconden, dump supernatant en resuspendeer in 2 mL verse groeimedium. Voeg de geresuspendeerde cultuur aan de Balch buis met 8 mL verse groeimedium en ampicilline.
    4. Plaats een rubberstop met steriele techniek, zorgvuldig op de Balch buis. Verwijderen uit de anaërobe kamer en plaatsen in een broedstoof/shaker en groeien anaëroob tot 3-5 PM bij +37 ˚C met schudden van 220 toeren per minuut.
  4. Tussen 3 en 5 PM, een 1% anaërobe entmateriaal in verse groeimedium uitvoert en 's nachts groeien.
    1. Breng de Balch buis (stap 3.3.4) in de anaërobe kamer samen met groeimedium. Voeg 100 µL van de cultuur tot 10 mL van de verse groeimedium (1% entmateriaal) met amp (210 mg/mL amp) in een steriele Balch-buis.
    2. Plaats een rubberstop met steriele techniek, zorgvuldig op de Balch buis. Verwijderen uit de anaërobe kamer, plaats in een broedstoof/shaker en 's nachts groeien op +37 ˚C met schudden van 220 toeren per minuut.
  5. Tussen 9 en 10u, resuspendeer de cultuur te groeien anaëroob gedurende de dag (20% entmateriaal).
    1. De cultuur van de incubator (stap 3.4.1) en het groeimedium (stap 1.1.9) in de anaërobe kamerbrengen.
    2. Voeg 8 mL groeimedium en ampicilline (210 mg/mL amp) in een steriele Balch-buis.
    3. 2 m van de overnachting volwassen cultuur en overdracht in een 2 mL Microcentrifuge buis verzamelen. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 90 seconden, dump supernatant en resuspendeer in 2 mL verse groeimedium. Voeg de geresuspendeerde cultuur aan de Balch buis met 8 mL verse groeimedium en ampicilline.
    4. Plaats een rubberstop met steriele techniek, zorgvuldig op de Balch buis. Verwijder uit kamer en plaatsen in een broedstoof/shaker en groeien anaëroob +37 ˚C met schudden van 220 toeren per minuut.
  6. Monitoren van de groei van de cultuur met behulp van een spectrofotometer (stap 3.5.4) totdat een OD600 voor 0.6 is bereikt. Moet vortex cultuur vóór elke OD lezen.
    Opmerking: Deze stap duurt 3-4 uur, en de blootstelling medium (stap 1.2) moet worden voorbereid tijdens dit keer, alsmede de bepaling van de blootstelling (stap 4.1).
  7. De groei stoppen wanneer de cultuur een OD600 voor 0.6 (±0.1) (3-4 uur verwacht groei bereikt).
    1. Buis in de anaërobe kamer (stap 3.6) en overdracht cultuur brengen door 2 x 2 mL Microcentrifuge buizen. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 90 seconden, dump supernatant en resuspendeer in 2 x 2 mL verse blootstelling medium.
    2. Herhaalstap wassen 3.7.1. eenmaal om te verwijderen van elk spoor van het groeimedium.
  8. Combineer beide buizen van de microcentrifuge van de cultuur van de cel (stap 3.7) in een 7 mL PTFE standaard flesje te verkrijgen Biosensor voorraad moet worden gebruikt in het Blootstelling Assay (stap 4).
    Opmerking: Zorg ervoor dat de Biosensor voorraad Meng grondig nog zachtjes heen en weer waarbij vóór gebruik. De methode kan hier worden onderbroken voor maximaal een uur.

4. bedwelming Assay

  1. Het ontwerpen van een lay-out van de plaat.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u alle pipetting waarden die zijn berekend en voorraden voorbereid voordat u start de blootstelling assay. Hoe goed ontwerp een experiment en wat besturingselementen aan het opnemen wordt toegelicht in de tekst. Bovendien, moet het experiment niet worden gestart als er zuurstof in de anaërobe zaal aangegeven op de anaërobe monitor.
    1. De indeling van de plaat volgens een 96 goed sjabloon ontwerpen. Voor het uitvoeren van experimenten in technische replicatieonderzoeken van 3, zal dit zorgen voor 32 verschillende behandelingen, die best wordt vertegenwoordigd door een 4 x 8 raster om in te stellen op flesjes (Zie Figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: een 96 goed plaat (links) en een bijbehorende 4 x 8 raster met PTFE flesjes (rechts) om te worden overgebracht naar de tafelzilver. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Opmerking: Wanneer testen voor de rol van een variabele op Hg opname met de kwik afleidbare biosensor; twee behandelingen nodig zijn voor elke variabele: de behandeling (biosensor + Hg + variabele + nitraat) en de behandeling leeg (biosensor + variabele + nitraat). Bij het testen voor de rol van een variabele op de Fysiologie van de cel met behulp van de constitutieve biosensor, twee behandelingen nodig zijn voor elke variabele: de behandeling (biosensor + Hg + variabele + nitraat) en lege () behandeling biosensor + variabele + Hg). Kwik kan worden vervangen door Cadmium. HG of Cd zal de variabele worden bij het uitvoeren van een kalibratiekromme. De constitutieve en afleidbare biosensoren hoeft niet te worden uitgevoerd op hetzelfde moment (in dezelfde plaat-indeling). Een voorbeeld van de sjabloon voor de lay-out van de plaat en bijbehorende 4 x 8 raster bij het testen van een concentratiebereik van magnesium (variabele) wordt gegeven in tabel 1).

123456789101112
eenHG geïnduceerde biosensor + Hg, nitraat + 0 mM MgHG geïnduceerde biosensor, nitraat + 0 mM MgConstitutieve biosensor + Hg, nitraat + 0 mM MgConstitutieve biosensor Hg + 0 mM Mg
bHG geïnduceerde biosensor + Hg nitraat + 0,1 mM MgHG geïnduceerde biosensor, nitraat + 0,1 mM MgConstitutieve biosensor + Hg nitraat + 0,1 mM MgConstitutieve biosensor Hg + 0,1 mM Mg
cHG geïnduceerde biosensor + Hg, nitraat + 1 mM MgHG geïnduceerde biosensor, nitraat + 1 mM MgConstitutieve biosensor + Hg, nitraat + 1 mM MgConstitutieve biosensor Hg + 1 mM Mg
dHG geïnduceerde biosensor + Hg, nitraat + 10 mM MgHG geïnduceerde biosensor, nitraat + 10 mM MgConstitutieve biosensor + Hg, nitraat + 10 mM MgConstitutieve biosensor Hg + 10 mM Mg
e

Tabel 1: Een voorbeeld plaat lay-out voor het gebruik van de biosensor testen Hg biologische beschikbaarheid (5 nM) over een helling van Magnesium (0-10 mM)

  1. Het 4 x 8 raster volgens de assay plaat lay-out instellen
    1. 7 mL PTFE standaard flesjes in de lade plaatsen.
      Opmerking: Moet PTFE flesjes zuur gewassen/warmte vóór gebruik gesteriliseerd. Flesjes moeten alleen worden behandeld door het manipuleren van de buitenkant van de flacon.
    2. Voeg aan elke flacon, de blootstelling medium volume dat overeenkomt met elke behandeling.
      Opmerking: In een belichting met een totaal volume van 2.000 µL (2 mL), de toegevoegde blootstelling medium worden: blootstelling medium µL = 2.000 µL- behandeling (lege) µL. (bijvoorbeeld blootstelling middellange µL = 2.000 – 100 µL (biosensor) – 40 µL (nitraat) – 100 µL (Hg ) – 100 µL (variabele (bijvoorbeeld MgSO4)) = 1660 µL). Zorg dat het volume van de geteste variabele toegevoegd 5% (100 µL) van het uiteindelijke volume niet overschrijdt.
    3. Toevoegen aan elke flacon, de bijbehorende volume van de oplossing van de chemische variabele worden getest volgens de lay-out van de plaat.
    4. Vanaf stap 1.3, door nitraat aan elke flacon toevoegen zodat de eindconcentratie 200 µM (40-80 µL is). Deze stap constitutieve biosensor behandelinglege cellen uit te sluiten.
    5. Toevoegen vanaf stap 2.1 of 2.2, Hg (5 nM bij het testen voor een variabele) of Cd (300 nM bij het testen voor een variabele) naar de flesjes volgens de lay-out van de plaat. Deze stap voor kwik afleidbare biosensor behandeling vormstukkenuit te sluiten.
      1. Bij het gebruik van Hg, de balans van de 4-8 µM en schud goed. Verdun de oplossing in het blootstelling medium in een flesje PTFE 7 mL tot 100-250 nM te maken van een werkende Hg oplossing. Deze werkoplossing toevoegen aan de vereiste flesjes Hg. In dit geval een ijkkromme van Hg variërend van 0 tot 12,5 nM.
        Opmerking: Bij het testen van een variabele effect op Hg of Cd biobeschikbaarheid, zorg ervoor dat de [Hg] of [Cd] over alle behandelingen constant blijft. Als Hg of Cd toe te voegen, moet u een pipet tip gebruiken, maar raak nooit het medium van de blootstelling in de flesjes.
  2. Schudden in een baanbeweging handmatig.
    Opmerking: Het experiment kan worden gepauzeerd nu afhankelijk van de benodigde tijd voor Hg of Cd voor al in oplossing. Als meer dan een uur verliet plaats PTFE caps op de PTFE flesjes om verdamping/verontreiniging te voorkomen.
  3. Zachtjes Pipetteer Biosensor voorraad heen en weer teneinde homogeniteit te waarborgen. Voeg 100 µL van Biosensor voorraad aan elke flacon. Schud orbitally handmatig.
  4. Bereiden de afleesapparaat om op te warmen om te lezen de volgende criteria voldoen: temperatuur, 37˚C, kinetische uitvoeren voor 10 uur met leest elke 2,5-5 minuten met het schudden van de orbitale tussendoor leest en fluorescentie metingen met een fluorescentie excitatie van 440 nm en een emissie van 500 nm.
  5. Pipetteer 200 µL van elke PTFE flesjes in het 4 x 8 raster in de overeenkomstige putjes van de 96 goed plaat (zwart, 96-Wells Clear-onder niet-bindende oppervlakte Microplates). Pipetteer 5 keer vóór de overbrenging van elke 200 µL heen en weer.
    Opmerking: In plaats van het teruggooien het uiteinde van de pipet, laat het uiteinde van de pipet in de PTFE flesje om pipetting vooruitgang bij te houden.
  6. Plaatst de 96 goed plaat in de lade van de afleesapparaat, dan plaats het deksel op de 96 goed plaat en begint met de bepaling.

5. kwantificeren van de gegevens

  1. De fluorescentie van elke behandeling op elk tijdstip moet worden gecorrigeerd voor elke individuele goed geluid en gewist aan de behandeling leeg.
    1. De fluorescentie voor elk punt van de tijd (t) van elke behandeling (T) moet vertaald worden naar de account voor de eerste fluorescentie (t0) voor het eerst punt van elk putje, dan gemiddeld over de 3 behandelingen worden gerepliceerd (r1- r3 ). Dit gemiddelde behandeling moet vervolgens worden gewist op de gemiddelde behandeling leeg (TB) vertaald op dezelfde wijze (vergelijking 1).

Fluorescentie (t) = gemiddelde(Tr1(t) - Tr1()t0), Tr2(t) – Tr2 ()t0), Tr3(t) - Tr3()t0)) – gemiddelde(TB R1 (t) - TBr1()t0), TBr2(t)- TBr2( ) t0 ), TBr3(t) - TBr3()t0)) (1)

Opmerking: Dit moet worden gemaakt als een werkbladfunctie. Goede verspreiding van fout moet ook worden berekend voor elk punt van de tijd.

  1. Grafiek van de gecorrigeerde fluorescentie van elke behandeling als een functie van de tijd

figure-protocol-2
Figuur 2: fluorescentie gegevens als een functie van de tijd gecorrigeerd. Fluorescentie gemeten als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) uitgestoten door E. coli NEB5α herbergen van de pUC57merR-Pp (afleidbare stam) na verloop van tijd met de toevoeging van HgII (0-12,5 nM) onder anaërobe omstandigheden. Fluorescentie was dat het gemiddelde van 3 technische repliceert op 37 ˚C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Opmerking: Er is geen 0 nM Hg waarde in de grafiek, en alle andere Hg concentraties hebben zijn gewist op de 0 nM Hg als een behandeling leeg. Daarom 0 nM Hg vertegenwoordigt de x-as en positieve fluorescentie vertegenwoordigt fluorescentie van Hg gegeven een willekeurige variabele. Het is optioneel om geen lege de fluorescentie op deze manier, maar de fluorescerende bochten geeft misleidende fluorescentie bochten als de variabele getest achtergrond fluorescentie heeft (dat wil zeggen, opgelost organisch materiaal zelf fluoresceren en als er geen behandeling leeg met alleen cellen en de opgeloste organische stof, toenemende concentratie van de opgeloste organische stof zal het fluorescent signaal).

  1. De piek van de fluorescentie te kwantificeren. Een meetbare fluorescentie piek zal doorgaans optreden na 2,5-4 uur, vertegenwoordigt de energie verbruikt van de consumptie van alle 200 µM nitraat als een accepteerder terminal elektron. Deze piek moet worden gekwantificeerd en vertegenwoordigt de waarde van de laatste fluorescentie van dat specifieke behandeling.
    Opmerking: In het geval geen fluorescentie piek wordt waargenomen (dat wil zeggen, geen Hg biologische beschikbaarheid), de fluorescentie van behandeling op het punt van de tijd van de piek van de fluorescentie van het besturingselement (dat wil zeggen, geen toegevoegde variabele of 5nM Hg) moeten worden gekwantificeerd. Als alternatief, als er fluorescentie inductie in de behandeling, maar fluorescentie niet een welomschreven piek tot leidt, er is waarschijnlijk besmetting van een hogere affiniteit elektron acceptor zoals O2 en maatregelen moeten worden genomen om sporen van te verwijderen zuurstof uit alle oplossingen en het experiment moet opnieuw worden uitgevoerd.

Resultaten

Zodra de pieken van de fluorescentie is gekwantificeerd volgens stap 5.3, het resultaat van de fluorescentie pieken kan worden opgenomen in een grafiek volgens de variabele concentratie illustreren hoe die variabele beïnvloedt de relatieve biologische beschikbaarheid van Hg of Cd. Bijvoorbeeld, zal ijkkromme van fluorescentie over [HgII] uit Figuur 2 figuur 3Agepresenteerde afleidbare gegevens opleveren. Voor HgII kalibratie, de curve zal altijd bevatten 3 componenten voor de Hg-afleidbare stam; de reactie van een drempel van ongeveer 1-2 nM HgII voor fluorescentie signaal productie is lineair evenredig aan [HgII], de lineaire reeks waar 5 nM HgII zullen op een betrouwbare manier altijd in het midden van dat bereik en een plateau waar toenemende [HgII] zal niet langer fluorescentie signaal. Geen verandering in de productie van het signaal op de constitutieve stam toont dat toxiciteit van [HgII] geen afbreuk doet aan de productie van het signaal. Voor CdII in figuur 3Bzijn er altijd 2 componenten voor de afleidbare stam; een lineaire reeks waar 200-300 nM CdII zal op een betrouwbare manier altijd in het midden van het lineaire bereik en een plateau. Een afname van de fluorescentie signaal met toenemende [CdII] blijkt dat hogere concentraties van de Cd giftig voor de cellen zijn en een daling in de productie van afleidbare fluorescentie na het plateau op 1000 nM CdIIkunnen uitleggen. Dus, bij het testen van Hg of Cd biologische beschikbaarheid met betrekking tot een omgevingsvariabele, raden we u aan 5 nM voor HgII en 300 nM voor CdII.

In sommige gevallen signaal productie kan goed worden toegeschreven aan Hg of Cd biobeschikbaarheid, maar in andere gevallen signaal productie kan worden beïnvloed door de variatie in de fysiologische status van de host biosensor cel (bijvoorbeeld het metaal van belang of milieu-omstandigheden getest zijn giftig). In figuur 4A, 5 nM Hg biobeschikbaarheid werd getest over een helling van Zn (0-10 µM). In zowel Hg-afleidbare en constitutieve stammen is er een vergelijkbare daling in signaal met toenemende concentraties van Zn. Daarom kan niet een discrimineren of het signaal uit verminderde biobeschikbaarheid voortvloeit of een gevolg van Zn toxiciteit is. In figuur 4B en 4 C, 5nM Hg biobeschikbaarheid werd getest over een helling van MgII (0-10 mM) en MnII (0-10 µM). Toenemende MgII en MnII concentraties daalde het signaal van de fluorescentie van de afleidbare stam. Aan de andere kant, de constitutieve spanning bleek niet dat een afname van de fluorescentie met toenemende MgII en MnII concentraties (MgII en MnII gunstig zijn voor de cellen in de productie van de FbFp, zoals blijkt uit een toename van de fluorescentie-signaal). Dit toont aan dat de cellen levensvatbaar zijn en de daling van de fluorescentie van de Hg-afleidbare stam het gevolg is van een afname van de biologische beschikbaarheid van Hg. Deze gegevens benadrukt hoe belangrijk het is dat alle biosensor testen om ook constitutieve metingen van algemene cel geschiktheid.

figure-results-1
Figuur 3: lineaire reeksen van de biosensor met kwik en Cadmium. Maximale fluorescentie gemeten als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± 1 standaarddeviatie uitgestoten door E. coli NEB5α herbergen van de pUC57merR-Pp (Hg-afleidbare) en pUC19Balch-Pp (Constitutive) met de toevoeging van A) HgII (0-15 nM) en B) CdII (0-1000 nM) onder anaërobe omstandigheden. Fluorescentie was dat het gemiddelde van 3 technische repliceert op 37 ˚C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 4: voorbeeld van een twijfelachtig resultaat met zink en een overtuigend resultaat met Magnesium en mangaan. Maximale fluorescentie gemeten als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± 1 standaarddeviatie uitgestoten door E. coli NEB5α herbergen van de pUC57merR-Pp (Hg-afleidbare) en pUC19Balch-Pp (Constitutive) met de toevoeging van A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), en C) MnII (0-10 µM) onder anaërobe omstandigheden. [HgII] is ingesteld op 5 nM voor alle behandelingen en fluorescentie was het gemiddelde van 3 technische wordt gerepliceerd op 37 ˚C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Microbiële biosensoren zijn nuttige hulpmiddelen om te identificeren van de mechanismen waarmee metalen zijn interactie met microben. Hier beschrijven we een methode die Hg anaëroob kan kwantificerenII en CdII biologische beschikbaarheid tot een gram-negatieve gastheercel (E. coli) en geven een meetbaar resultaat binnen een paar uur. Een van de belangrijkste troeven van dit protocol is dat het mogelijk uitgebreide controle van metalen soortvorming in het blootstelling medium maakt door het vermijden van sterke bindende liganden of componenten die tot metalen neerslag leiden kunnen. Metaal speciatie is gemodelleerd en getest in dit medium van de blootstelling met behulp van de PHREEQC17, maar andere metaal speciatie-software kan worden ingezet. In het geval van geen toegevoegde liganden, Hg soortvorming verwachting aanwezig te zijn als 97% Hg(OH),2 en 3% Hg (NH3)22 +, terwijl Cd soortvorming zullen presenteren als 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +en 16% CdSO4. Met behulp van een eenvoudige thermodynamische modellering software, kan de gebruiker blootstelling media ontwerpen en testen voor de biodisponibiliteit van het metaal van belang. Daarnaast de gastheercel biosensor (E. coli NEB5α) haalbaar is over een brede waaier van pH (5-8.5) en concentratie van de NaCl (0-0,55 M)17.

Methylation van HG is een anaerobe proces, en het protocol geschetst in deze studie hoeft niet een vereiste voor zuurstof, waardoor meer accurate beschrijving van anaërobe metabolisme op metalen biologische beschikbaarheid. Dit is belangrijk omdat de aanwezigheid van zuurstof gen expressie profielen48,49 verandert , en vandaar, potentieel vervoer trajecten; Deze methode stelt daarom een voordeel ten opzichte van momenteel bestaand aërobe alternatieven. De constructie van de biosensing hier gepresenteerde potentieel kan worden gebruikt met andere anaërobe hosts die relevant meer voor kwik methylering (bijv. Geobacter, Desulfovibrio), maar misschien zijn kunnen minder hanteerbare dan E. coli. Een van de huidige beperking van de hier gepresenteerde benadering is dat onze limiet van detectie pM niveaus, in tegenstelling tot bestaande aërobe systemen4,-19,37nog niet heeft bereikt. Het is echter belangrijk op te merken dat om deze lage detectiegrenzen verschillende stappen dienen te worden genomen44: ik) ligand toevoeging is vereist om ervoor te zorgen dat Hg in de oplossing blijft en niet op de microbiële celwand (Hg zullen onomkeerbaar gebonden doet adsorberen naar een cel oppervlakte thiolen voorkomen zijn biologische beschikbaarheid25,27; Zie de reactie van de drempel voor Hg in figuur 3A), ii) wijzigingen van de celdichtheid, of iii) wijzigen van de genetische constructie tot vervoer proteïnen van de mer-operon (namelijk merT en merP), toenemende Hg flux binnen de cel50,51. Deze wijzigingen zou heilzaam bij de opsporing van de lage concentraties van Hg, maar niet noodzakelijkerwijs ideaal bij de beoordeling van de milieu relevante situaties. Overwegende dat eerdere cadmium biosensoren bestaan voornamelijk als een "proof of principe", werden ze ontworpen in complexe media die niet toestaan de onderzoeker te beoordelen van de rol van soortvorming op biologische beschikbaarheid41,42, 43 , 44.

De biosensor is een ongelooflijk nuttig hulpmiddel bij het bepalen van de mechanismen waarin metalen soorten biologisch beschikbaar zijn. Omdat het ontvangende organisme niet een Hg-methylator is, kan het uitsluitend gebruikt voor het ontwikkelen van een model voor hoe Hg gram-negatieve bacteriën en niet een definitieve reden voor hoe Hg-methylators Hg verwerven kan invoeren. Er bestaan andere methoden voor de bepaling van de biologische beschikbaarheid Hg, zoals methylering, als een resultaat van opname of het gebruik van een massabalans aanpak10,15,20,45,,46. Dat gezegd zijnde, biedt de hier voorgestelde methode het voordeel van quasi real time-gegevens van de biologische beschikbaarheid in levensvatbare cellen. Wij adviseren niet dat deze methode worden gebruikt om de totale Hg of Cd niveaus in een milieu matrix te kwantificeren. Ondanks het voorgestelde gebruik van biosensoren om metalen concentraties in het milieu36, zijn veel meer beschikbaar standaardmethoden beschikbaar zoals ICP-MS, FAAS (p.a. Cd) of koude damp-atomaire absorptie spectroscopie (voor Hg analyse). De biosensor kan echter worden gebruikt om te bepalen als een bepaald milieu matrix heeft het potentieel om te verbeteren of belemmeren van biologische beschikbaarheid; Dit wordt bereikt door het uitvoeren van de Standaardextra.

De pH van de media blootstelling mag worden gewijzigd om overal binnen de waaier van 5 en 8,5, mits de MOPS vrije zure (buffer) wordt uitgewisseld met een alternatieve vrij zuur van een buffer met de desbetreffende pKa (zie lijst van passende buffers (Ferreira et al. (2015) 47) en aangepast met KOH aan de juiste pH-waarde bij het maken van de media van de blootstelling. Bovendien, de methode is niet beperkt tot Hg en Cd, maar kan worden uitgebreid tot andere metalen met behulp van andere regelgevers van de transcriptie.

De bepaling van de blootstelling kan worden gewijzigd om te verkennen van de invloed van andere elektronen acceptoren zoals O2 en fumaraat op Hg of Cd biologische beschikbaarheid. Kleine wijzigingen in de methode te gebruiken zowel O2 en fumaraat als elektronen acceptoren zijn beschikbaar op aanvraag.

Kortom, we willen graag de volgende punten: ik) is het absoluut noodzakelijk dat de concentraties van Cd of Hg voorraden zijn bekend in stap 2, zoals deze wordt gebruikt voor het kalibreren van de biosensor. II) op de dag van de blootstelling, de groei van cellen moet worden gestopt bij een OD-600 voor 0.6 (± 0,1) en dat de zorg wordt genomen bij de resuspending van de celculturen, als de biosensor is gekalibreerd om de celdichtheid van deze. III) ten slotte, het is belangrijk dat het medium blootstelling minutieus op de dag van de blootstelling geschiedt. Om ervoor te zorgen het succes van het protocol, meerdere culturen tegelijk (te omzeilen de mogelijkheid van groei storing) moeten worden gekweekt en het groeimedium moet wekelijks worden vernieuwd (om te omzeilen de metastabiliteit van de media en de eventuele verontreiniging). Ook opgemerkt moet worden dat biologische replicatieonderzoeken (meerdere celculturen) variabiliteit kenbaar te maken wanneer het gaat om het signaal van de productie. Hoewel de fluorescerende reacties van cultuur tot cultuur variëren kunnen, moeten de fluorescerende trends in reactie op een gegeven variabele blijven hetzelfde tijdens talrijke biologische replicatieonderzoeken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedank opmerkingen van twee Anoniem reviewers als ook leden van de Poulain Lab voor inzichtelijke discussie over de ontwikkeling van de anaërobe biosensor. Deze studie wordt gefinancierd door een Early onderzoeker Award van de provincie Ontario en de toekenning van een ontdekking en een aanvulling van de versneller van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada op A.J.P..

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
7 ml standaardvial, afgeronde binnenkantDelta Scientific200-007-2034 aanbevolen
Vial tray, 21 mm openingenDelta Scientific730-20014 voor (4 x 8 raster)
24 mm sluitingDelta Scientific600-024-0132 aanbevolen
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50CorningCorning 3931
Corning 96- wel clear-bottom nonbinding surface microplateCorningCorning 3651
Anaërobe kamer (handschoenenkast)De lucht in de anaërobe kamer moet zijn (97 % N2 ± 2 % en 3 % H2 ± 2 %)
Palladium katalysatorConverteert O2 naar H2O in de anaërobe kamer. Niet vereist maar aanbevolen.
Microplate reader
450 (±10) nM filter voor de microplate reader
500 (±10) nM filter voor de microplate reader
Anaërobe kweekvial (balch buizen) + rubberen stoppen
SpectrofotometerAangepast voor anaërobe kweekbuizen
MA-3000 (kwikanalysator)
pH sondeElke pH sonde werkt
50 mL conische steriele polypropyleen centrifugebuizen.
0.22 µm polyethersulfone spuitfilter + spuit
Steriele/schone glazen flessenVoor groeimedia en standaarden
Steriele/schone kunststof of PTFE flessenVoor alkalische oplossingen (NaOH/KOH)
Reagentia poeders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicilline natriumzout, Difco M9 Minimale Zouten, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA natriumzout, FeSO4, Natrium Beta-Gylcerofosfaat, Mops vrije zuur, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Steriele Milli-Q waterAutoclaved of filter gesteriliseerd is prima.
Lysogenie Broth
Analytische kwaliteit H2SO4

Referenties

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001(2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078(2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

KwikdetectieCadmiumdetectieAnoxische conditiesWhole-cell biosensorMetaalbiobeschikbaarheidSpectrofotometer OD600FluorescentiemetingPTFE-vialAnaërobe kamer
Een anaërobe Biosensor Assay voor het opsporen van kwik en Cadmium
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.