Methodenartikel

Cell Cycle analyse in de C. elegans Germline met de Thymidine analoge EdU

DOI:

10.3791/58339

⸱

22 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een imaging gebaseerde methode wordt beschreven dat kan worden gebruikt voor het identificeren van de S-fase en analyseren van de dynamiek van de celcyclus in de C. elegans hermafrodiete germline met behulp van de thymidine analoge EdU. Deze methode vereist geen transgenen en is compatibel met immunefluorescentie kleuring.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse van de celcyclus in eukaryoten maakt vaak gebruik van chromosoom morfologie, expressie en/of lokalisatie van gene producten die nodig zijn voor de verschillende fasen van de celcyclus, of de opneming van nucleoside-analogen. Tijdens de S-fase, de polymerase van DNA integreren thymidine analogen zoals EdU of BrdU chromosomale DNA, markering van de cellen voor analyse. Voor C. elegans, de nucleoside analoge EdU wordt gevoed aan de wormen tijdens reguliere cultuur en is compatibel met immunefluorescentie technieken. De kiemcellen van C. elegans is een krachtig model-systeem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus, want het is transparant, genetisch facile en Meiotische profase en cellulaire differentiatie/geslachtscel optreden in een lineaire montage-achtige manier. Deze eigenschappen maken EdU een geweldig hulpmiddel om de studie van dynamische aspecten van mitotically fietsen cellen en germline ontwikkeling. Dit protocol wordt beschreven hoe u met succes EdU bacteriën bereiden, voeden ze met wild-type C. elegans hermafrodieten, de hermafrodiete gonaden ontleden, vlekken voor EdU opneming in DNA, vlek met antilichamen tegen diverse celcyclus detecteren en Developmental markers, beeld van de gonaden en analyseren van de resultaten. Het protocol beschrijft de variaties in de methode en de analyse voor de meting van de S-fase index, M-fase index G2 duur, celcyclus duur, tarief van Meiotische binnenkomst en tarief van Meiotische profase progressie. Deze methode kan worden aangepast om te bestuderen van de celcyclus of cel geschiedenis in andere weefsels, stadia, genetische achtergronden en fysiologische omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dierlijke ontwikkeling, honderden, duizenden, miljoenen, miljarden of zelfs miljarden celdelingen dienen te vormen van het volwassen organisme. De celcyclus, het aantal cellulaire gebeurtenissen samengesteld uit G1 (gap), S (synthese), G2 (gap), en M (mitose) definiëren de reeks van gebeurtenissen die zijn uitgevoerd elke celdeling. De celcyclus is dynamisch en best gewaardeerde in reële tijd, die kan technisch moeilijk. De technieken die in dit protocol gepresenteerd toelaten dat een om de metingen van de fasen en timing van de celcyclus van stilstaande beelden te maken.

Labelen met nucleoside analogen zoals 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) of 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) is de gouden standaard om te identificeren van de S-fase in de studies van de celcyclus dynamiek in de Caenorhabditis elegans (C. elegans) volwassene hermafrodiete germline1,2,3,4,5. Zowel de EdU als BrdU kan worden gebruikt in bijna elke genetische achtergrond, als zij niet op een genetische construct baseren zich. Visualiseren van BrdU vereist agressieve chemische behandeling om het antigeen voor anti-BrdU antilichamen tegen vlekken, die vaak onverenigbaar is met de beoordeling van andere cellulaire markers gevisualiseerd door mede kleuring met extra antilichamen bloot te stellen. Daarentegen visualiseren EdU treedt op door klik chemie milde omstandigheden en is dus compatibel met antilichaam mede kleuring6,7.

De specificiteit van het label is duidelijk, omdat kernen alleen de (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-analogen van thymidine in DNA tijdens de S-fase integreren. Visualisatie vindt plaats in vaste weefsel. De EdU-label is onzichtbaar vanzelf tot een azide-bevattende kleurstof of fluorophore reageert covalent met de alkyn in EdU door koper-gekatalyseerde Klik scheikunde8. EdU labeling bieden onmiddellijk informatie over welke kernen in de S-fase, met behulp van een korte puls van labeling. EdU kan ook dynamische informatie bieden, met behulp van puls-jacht of continu etikettering; bijvoorbeeld, in een puls-chase experiment, het etiket bij elke celdeling wordt verdund of doorgegeven als nondividing cellen vooruitgang door middel van ontwikkeling.

De C. elegans hermafrodiete germline is een krachtig modelsysteem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus. De volwassen kiemcellen is een gepolariseerde assemblagelijn met stamcellen gevonden op de distale einde gevolgd door ingang en progressie via Meiotische profase, gecoördineerd met de stadia van de geslachtscel meer proximally (Figuur 1). Proximale eind, eicellen rijpen, zijn algemeen en bevrucht en beginnen embryogenese in de baarmoeder9,10,11. De cel-diameter van ~ 20 lange regio in de buurt van de distale tip-cel, waaronder de mitotically fietsen germline stengel, voorlopercellen en Meiotische cellen in de S-fase maar niet op de cellen in Meiotische profase, heet de voorlopercellen zone2,4 , 9 , 12. de celmembranen bieden onvolledig scheiding tussen de kernen in de distale germline, maar de zone voorlopercellen ondergaan mitotische cel grotendeels zelfstandig fietsen. De duur van de mediane mitotische celcyclus germline van voorlopercellen van zone jonge volwassen hermafrodieten is ~6.5 h; G1-fase is kort of afwezig is, en onbeweeglijkheid1,2,13niet wordt nageleefd. Germline stamcel differentiatie vindt plaats via in wezen directe differentiatie en dus mist transit-sturen divisies4. Tijdens de differentiatie in de pachytene fase, ongeveer 4 van de 5 kernen eicellen niet zullen vormen, maar in plaats daarvan ondergaan apoptosis, fungeert als verpleegkundige cellen door het doneren van hun cytoplasmatische inhoud aan de ontwikkelende oöcyt12,14 , 15.

Naast labeling cellen in de S-fase met nucleoside analogen, men kan het identificeren van de cellen in de mitose en meiose met behulp van antilichaam kleuring. Kernen in de mitose zijn immunoreactive aan anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antilichaam (genaamd pH3)7,16. Kernen in meiose zijn immunoreactive naar anti-hem-3 antilichaam (een Meiotische chromosoom as eiwit)17. Kernen in de voorlopercellen zone kunnen worden geïdentificeerd door het ontbreken van HIM-3, de aanwezigheid van het nucleoplasmic van REC-818of de aanwezigheid van WAPL-1-19. WAPL-1 intensiteit is het hoogst in de somatische gonaden, hoog in de zone van voorlopercellen, en lage tijdens de vroege Meiotische prophases19. Verschillende metingen van de celcyclus zijn mogelijk met een paar variaties in het protocol: ik) kernen in de S-fase identificeren en meten van de S-fase index; II) identificeren kernen in M-fase en meten van de M-fase-index; III) bepalen of kernen in mitotische of Meiotische S-fase werden; IV) de duur van de maatregel van G2; V) meten de duartion van G2 + M + G1 fasen; VI) maatregel het tarief van Meiotische binnenkomst; VII) schatting van de mate van Meiotische progressie.

Men kan meerdere metingen van de celcyclus van slechts een paar soorten natte-lab experimenten maken. Het onderstaande protocol beschrijft een 30 min pulse labelen door C. elegans volwassen hermafrodieten vervoederen EdU label bacteriën en co labeling cellen van de M-fase door kleuring met anti-pH3 antilichaam en voorlopercellen zone cellen door kleuring met anti-WAPL-1 antilichaam. Alleen de wijzigingen in de duur van de EdU feed (stap 2.5), soort antilichamen (stap 5), en analyses (stap 8.3) zijn vereist voor de extra metingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van EdU-geëtiketteerden bacteriën

  1. Een starter cultuur van MG1693 groeien. Escherichia coli MG1693 (E. coli) draagt een mutatie in thyA.
    1. Streak uit E. coli MG1693 uit een bevroren glycerol voorraad op een 120 mm lysogenie Bouillon (LB) agar petrischaal. Cultuur bij 37 ° C's nachts.
    2. Inoculeer uit twee afzonderlijke E. coli MG1693 kolonies in tweeën dupliceren vloeibare pond cultuur bij 37 ° C gedurende ~ 16 h 4 mL tubes.
      Opmerking: MG1693 groeit prima in de LB zonder aan te vullen met thymine of thymidine.
  2. E. coli MG1693 in minimale media aangevuld met EdU groeien.
    1. Autoclaaf een conische kolf van 500 mL.
    2. Steriele techniek gebruiken toe 5 mL 20% glucose, 50 μl van 10 mg/mL van thiamine, 120 μL van 5 mM thymidine, 100 μl van 1 M MgSO4, 200 μl van 10 mM EdU, 100 mL M9 buffer en 4 mL vers geteelde overnachting MG1693 cultuur.
      Opmerking: De uiteindelijke concentratie van EdU is 20 μM in deze cultuur1,7. Deze concentratie leidt tot DNA schade en celcyclus arrestatie als rechtstreeks toegepast op zoogdiercellen in cultuur20. Echter, slechts een fractie van deze EdU is opgenomen in de E. coli en dus beschikbaar voor C. elegans. Er is geen bewijs van celcyclus aanhoudingsbevel en geen verandering in de grootte van de voorvader zone of M-fase index na EdU behandeling van jonge volwassen hermafrodieten.
    3. Cultuur 's nachts, maar niet langer dan 24 uur bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
  3. Concentreer je EdU-geëtiketteerden E. coli en M9 agar petrischalen toepassen.
    1. Vooraf cool een tafelblad centrifuge tot 4 ° C.
    2. Steriele techniek gebruiken om over te brengen van de cultuur in 2-4 steriele 50 mL conische buizen.
    3. Centrifugeer de culturen bij 3000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten aan de EdU-geëtiketteerden E. colipellet.
      Opmerking: Dispose van EdU-bevattende supernatans volgens de richtlijnen van de lokale en institutionele.
    4. Resuspendeer de pellets met 4 mL verse M9. Gebruik een steriele 1 mL pipet tip of een serologische steriele 5 mL-pipet. Resuspending van de pellets kan enkele minuten duren.
    5. Gebruik van de dezelfde Pipetteer toepassen en verspreiden van ~ 8 druppels geresuspendeerde EdU-geëtiketteerden E. coli MG1693 naar het midden van de kamertemperatuur 60 mm M9 agar petrischalen. Één partij levert ~ 16 gerechten.
    6. Laat de gerechten te drogen voor enkele uren of 's nachts bij kamertemperatuur, dan verzegelen van elk gerecht met een strook van laboratorium film. Gerechten kunnen worden opgeslagen bij 15 ° C ~ 2 weken en bij 4 ° C ~ 2 maanden. Gebruik dezelfde batch van EdU gerechten voor elke set van experimenten.

2. feeding EdU aan C. elegans

  1. Synchroniseren bevolking door getimede ei leggen, alkalische hypochloriet behandeling gevolgd door broedeieren in S-medium met cholesterol, of door het plukken van de juiste fase21. Groeien de dieren naar gewenste werkgebied (hier, 24 h post-L4) op Nematode groeimedium bezaaid met E. coli OP50 bij 20 ° C.
    Opmerking: Bereiden 50 – 100 dieren per experiment, zoals sommige niet goed kan ontleden, en anderen zullen verloren gaan tijdens het wassen en over te dragen.
  2. Laat de EdU gerechten opwarmen tot 20 ° C (of de temperatuur die nodig zijn voor het experiment).
  3. Wassen van de dieren uit NGM gerechten, gebruikmakend van de M9 of -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1,5 mL-buis. Toestaan dat de dieren te kort te regelen door de zwaartekracht of een korte spin in een microcentrifuge.
  4. Verwijder het supernatant en wassen van de dieren 1 – 2 keer met ~ 1 mL M9 of PBS. Verwijder het supernatant.
  5. Gebruiken een glazen pipet van Pasteur voor het overbrengen van de dieren in een kleine druppel M9 of PBS in het midden van het EdU-gazon. Wacht een paar minuten voor de vloeistof te worden geabsorbeerd en Incubeer bij 20 ° C gedurende 30 minuten (voor directe meting van de S-fase) of meer (voor het meten van geschiedenis van de S-fase), zo nodig.
    Opmerking: EdU signaal is aantoonbaar in germline kernen na zo weinig als 15 min van EdU1voeding.
  6. De wormen afwassen de EdU-schotel met ~ 2 mL M9 of PBS in een glas ontrafeling van de schotel.

3. dissectie en fixatie van C. elegans Germline

Opmerking: Dit protocol voor de dissectie, fixatie en antilichaam kleuring van de C. elegans hermafrodiete germline is bijna identiek aan die gepubliceerd door Gervaise en Arur (2016)22, behalve dat de 1 mL glazen buizen kunnen worden gecentrifugeerd om te versnellen wassen stappen en een uitgesponnen glazen pipet van Pasteur kan worden gebruikt om de vloeistof van 1 mL glazen buizen effectiever.

  1. Wassen en ontleden van C. elegans germlines.
    1. Toestaan dat de dieren om af te wikkelen naar de onderkant van de ontleden schotel, swirl voor het verzamelen van de dieren in het centrum, en een lange Pipet van Pasteur kunt verwijderen van PBS. Was 1 – 2 keer met ~ 2 mL PBS.
    2. Voeg 2 mL PBS en 4 μL van 100 mM levamisole te immobiliseren van de dieren. Swirl de schotel opnieuw uit om te verzamelen van de dieren in het midden van de schotel.
      Opmerking: Immobilisatie kan enkele seconden tot enkele minuten duren. Volledige immobilisatie is niet nodig voor succesvolle dissectie. Sommige mensen hebben betere succes wanneer dieren ontrafeling van onvolledig geïmmobiliseerd.
    3. Ontleden van de dieren met een paar 25G 5/8" naalden door te snijden op het hoofd (ongeveer tussen de twee faryngaal bollen) of de staart. Wees voorzichtig niet te snijden van de lus van de kiemcellen. Darm en germline moeten "pop uit" van de lichaamsholte toe te schrijven aan interne druk, maar blijven aangesloten. Dit protocol komt overeen met eerder gepubliceerde Gervaise en Arur (2016)22.
      Opmerking: Houd de dissectie tijd aan ~ 5 min, zeker niet meer dan 15 min. langere tijden van de dissectie kunnen resulteren in het verlies van antilichaam kleuring signaal (Sudhir Nayak, persoonlijke mededeling) en verhongering in PBS van invloed kan zijn op de Fysiologie van de dieren. Leren om te ontleden snel en nauwkeurig kan enige praktijk nemen.
    4. Indien nodig, swirl voor het verzamelen van de ontleed dieren in het midden, en een lange Pipet van Pasteur kunt verwijderen van zo veel PBS mogelijk.
  2. Positiebepaling en uitdrogen van weefsels
    1. Voeg 2 mL 3% paraformaldehyde (PFA) in PBS oplossing. Betrekking hebben op de schotel losjes met laboratorium film en winkel op een bankje of in een lade voor 10 min.
      Opmerking: Ontdooien PFA oplossing in een 37 ° C water bad en vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur voordat de ontrafeling van de germlines.
      Let op: PFA oplossing is matig toxische waarschijnlijk kankerverwekkend te worden ingedeeld en een teratogen. Dampen uitstoten van paraformaldehyde oplossingen zijn licht ontvlambaar. Nitril handschoenen dragen. Verdun PFA van 16% tot 3% in een chemische zuurkast. Als u werkt buiten de zuurkast, houden alle containers bedekt.
    2. Overbrengen in de gonaden zorgvuldig een schone 5 mL glazen centrifugebuis.
    3. Voeg ~ 3 mL PBSTw (PBS met 0,1% Tween-20) naar de schotel die de gonaden om te helpen met het ophalen van de resterende gonaden en Verdun de PFA-oplossing.
    4. Spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min. jongere of kleinere dieren moeten langer spin keer dan oudere of grotere dieren.
    5. Met behulp van een lange glazen pipet, overbrengen in het supernatant ongewenste materiële bekerglas voor uiteindelijke negeren in ongewenste materiële fles in de chemische kap.
    6. Voeg toe 2 mL hoogwaardig methanol vooraf gekoeld worden tot-20 ° C. Dekking van de centrifugebuis strak met laboratorium film.
      Opmerking: Gebruik van verse hoogwaardige "gold label" methanol is essentieel voor goede morfologie met bepaalde antilichamen.
      Let op: Methanol is een ontvlambare vloeistof en damp, dat giftig bij inslikken, ingeademd of toegestaan om contact met de huid. Draag handschoenen en passende persoonlijke beschermingsmiddelen. Gebruik een vriezer die geschikt is voor kleine hoeveelheden van springstoffen.
    7. Winkel in de vriezer-20 ° C gedurende 1 uur, zelfs 's nachts of zelfs enkele maanden.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. het hydrateren van Germlines

  1. Vul de glazen centrifugebuis naar boven met PBSTw te verdunnen van de methanol en hydrateren van de geslachtsklieren. Spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min.
  2. Met behulp van een lange glazen pipet van Pasteur, overbrengen in het supernatant ongewenste materiële bekerglas voor uiteindelijke negeren in ongewenste materiële fles in de chemische kap.
  3. De geslachtsklieren 3 keer met ~ 5 mL PBSTw, spinnen neer in een klinische centrifuge op 870 x g gedurende ~ 1 min. telkens wassen. Verwijder het supernatant.
  4. Spoel een kleine 1 mL borosilicaatglas buis en een lange glazen pipet van Pasteur met PBSTw.
  5. Voeg ~ 700 l PBSTw en gebruik van de lange glazen pipet van Pasteur de gonaden overbrengen naar de kleine buis. Gebruik een paar extra druppels van PBSTw om ervoor te zorgen dat alle geslachtsklieren worden overgedragen.
  6. Spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min. met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.
    Opmerking: Als antistofdetectie niet nodig is, gaat u naar stap 6.

5. het opsporen van antigenen met antistoffen

  1. Verdun de primaire antilichamen in het serum van de 30% in PBS. In het huidige voorbeeld, anti-WAPL-1 antilichaam is verdunde 1:2,000 en anti-pH3 antilichaam is verdunde 1:500. Centrifugeer vers ontdooid serum voor 10 minuten in een microfuge bij 20.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van de deeltjes. Gebruik de bovendrijvende substantie, die kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor meerdere dagen. Gebruik de juiste serum ter vervanging van het ontvangende organisme van secundaire antilichamen (geit serum wordt hier gebruikt). Een optionele blokkerende stap kan worden toegevoegd voordat het prestatiemeteritembestand van primaire antilichamen.
  2. 100 μl van verdunde primair antilichaam toepassen op elk klein glazen buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
    Opmerking: Incubatie tijden variëren door antilichaam. Voor sommige antilichamen is 2 h bij kamertemperatuur voldoende. Langere incubations (bv., overnachting) zijn mogelijk, maar de achtergrond kan verhogen.
  3. Vul de buizen om top met PBSTw en spin naar beneden in een klinische centrifuge op 870 x g voor ~ 1 min.
  4. Wassen van de geslachtsklieren 3 keer gebruik ~ 1 mL PBSTw. Incubate voor ~ 5 min per wasbeurt zodat overtollige primair antilichaam te verspreiden in wassen. Met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.
  5. Verdun de secundaire antilichamen in het serum van 30% geit in PBS. In het huidige voorbeeld worden geit-anti-konijn-594 en geit-anti-muis-647 elk verdund op 1:400.
    Opmerking: Selecteer secundaire antilichamen zorgvuldig om ervoor te zorgen dat kleurstoffen zijn verschillend van de kleurstof in de EdU-kit. In het huidige voorbeeld bevatte de EdU kit een 488 nm excitatie kleurstof.
  6. 100 μl van verdunde secundair antilichaam toepassen op elk klein glazen buis. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur 2 h.
    Opmerking: Incubatie tijden variëren door antilichaam. Voor sommige secundaire antilichamen volstaat 1 uur bij kamertemperatuur. Langere incubations (bv., overnachting) zijn mogelijk, maar de achtergrond kan verhogen.
  7. Wassen van de geslachtsklieren 3 keer gebruik ~ 1 mL PBSTw. Incubate voor ~ 5 min per wasbeurt zodat overtollige secundair antilichaam te verspreiden in wassen. Met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.
    Opmerking: Gonaden kunnen worden opgeslagen in 100 μl van PBS na deze stap, indien nodig, hoewel dit signaal kan beperken. PBS verwijderen voordat u verdergaat.

6. Voer de reactie van de EdU-Klik om te detecteren EdU

Opmerking: Het uitvoeren van de EdU is klik reactie vóór het antilichaam kleuring stappen (uitvoeren van stap 6 vóór stap 5) mogelijk, afhankelijk van de antilichamen gebruikt7. Echter de reagentia Klik op bepaalde antigenen storen (bv., REC-8 antilichaam is gevoelig voor fixatie en permeabilization). De hier aangegeven volgorde levert heldere antilichaam kleuring met de REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3 vlag en CYE-1 antilichamen gebruikt, onder anderen.

  1. Bereid de klik EdU cocktail8 vers door het volgende toe te voegen aan een schone 1,5 mL-buis. De volgorde van toevoegingen is belangrijk. Beschermen tegen licht en onderhouden alle reagentia op ijs. Dit recept levert genoeg voor één monster (100 μl); Vermenigvuldig het recept zo nodig.
    1. Voeg 2 mL ultrazuiver water aan de buffer additief. Dit maakt 10 x buffer toevoegingsmiddel, die moeten worden verdund tot 1 x onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken.
    2. 8,5 μl van 10 x buffer aan 76.5 μL van ultrazuiver water toevoegen. Meng goed.
    3. Voeg 4 l 100 mM CuSO4 (kan worden aangeduid als onderdeel E). Meng goed.
    4. 0,25 μL van de 488 nm kleurstof Azide toevoegen. Het moet worden ontdooid bij kamertemperatuur, zoals haar oplosmiddel, dimethylsulfoxide, solide bij 4 ° C. is Meng goed en beschermen tegen licht.
    5. Mix 9 μL van ultrazuiver water met 1 μL van de buffer additief in de dop van de tube. Pipetteer van het GLB te voegen aan de resterende cocktail, en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag.
  2. Het uitvoeren van de EdU Klik op reactie.
    1. ~ 100 μl van klik EdU cocktail aan de gonaden in de kleine buis toevoegen. Bedek met laboratorium film en incubeer gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Een keer wassen met 100 μl van reactie spoelen buffer.
    3. Wassen van de geslachtsklieren 4 keer gebruiken ~ 1 mL PBSTw. Incubate voor ~ 15 min per wasbeurt om overtollige EdU cocktail Components wilt verspreiden in wassen. Met behulp van een uitgesponnen lange glazen pipet van Pasteur, verwijderen van zo veel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de geslachtsklieren. Laat niet meer dan 50 μl.

7. de vlekken van DNA en bereiden van dia 's

  1. 1 druppel (~ 25 μL) antifade montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, gebruikt voor het visualiseren van DNA) toevoegen aan de geslachtsklieren. Wacht een paar minuten zodat het kan regelen en meng met de geslachtsklieren.
    Opmerking: Afwisselend, een verdunning van de 1:1,000 van de DAPI (uit een voorraad van de 0,1 mg/mL) in PBS kan worden toegepast voor 5 min, gevolgd door 20 μL van 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) in 90% glycerol, of een ander antifade montage medium.
  2. Een grote 2,5% agarose pad op een microscoopglaasje standaard glas voor te bereiden.
  3. Gebruik een nieuwe schone stofvrije lange glazen pipet van Pasteur de gonaden overbrengen naar de agarose pad. Houd alle vloeistof en gonaden in de smalle onderkant van de pipet om te minimaliseren van het verlies van de geslachtsklieren.
    Opmerking: Gonaden vast aan kleine glazen buis of in lange glazen pipet van Pasteur kan worden "gered" door spoelen met PBSTw, het verzamelen van de vloeistof in een ontleden schotel en plukken van individuele dieren in de dia verschijnt met een wimper.
  4. Gebruik een wimper (of een lus van dun haar) vastgelijmd aan een tandenstoker aan de gonaden over de agarose pad verdelen en de stofdeeltjes te verwijderen.
  5. Breng een dekglaasje van rechthoekige glazen aan. Lagere langzaam van de ene kant om te voorkomen dat luchtbellen. Gebruik een weefsel te verwijderen overtollige oplossing waardoor het dekglaasje aan vrij bewegen.
    Opmerking: Kies coverslips die overeenkomen met de Microscoop die zal worden gebruikt. #1 en #1.5 coverslips werken goed.
  6. Laat de dia's te regelen en licht 's nachts drogen bij kamertemperatuur of 4 ° C. Dit helpt om iets plat de geslachtsklieren. Dia's moeten worden bewaard bij 4 ° C.
  7. Optioneel: Seal de randen van de dia met nagellak, of een andere dia sealer. Afdichten van de hoeken eerst, dan de zijkanten, voorkomt het dekglaasje aan verschuiven.

8. confocal beeldvorming en analyse

  1. Beeld de distale gonaden met een draaiende schijf confocal fluorescente microscoop is voorzien van een hoge energie-lichtbron, plan-apochromatische doelstellingen en een hoog rendement Microscoop camera. De opnamen met 1 μm of strengere afstand tussen z-stacks. Neem nota van laser energie, gevoeligheid en blootstelling tijd voor alle zenders.
    1. Gebruikt u het volgende: 405 nm laser lijn excitatie met een 485 nm (W60) emissie filter voor DAPI, 488 nm laser lijn excitatie met een 527 nm (W55) emissie filter voor EdU, 561 nm laser lijn excitatie met een 615 nm (W70) emissie filter voor WAPL-1 en een 640 nm laser lijn excita ning met een 705 nm (W90) emissie filter voor pH3.
      Opmerking: Signaal intensiteit en de intensiteit van de achtergrond zal verschillen. Ook zullen de vereiste blootstelling tijden variëren, eventueel tot 10-fold.
  2. Gebruik de cel teller plug-in23 in Fiji24,25 te handmatig tellen elke kern. Label elke individuele nucleus volgens de aanwezigheid en de afwezigheid van pH3 EdU en WAPL-1. Gebruik de klassen van kernen beschreven in tabel 1 en Figuur 2, dit alles van de hieronder beschreven berekeningen zal vergemakkelijken.
    Opmerking: Geschoolde experimentalisten kunnen nauwkeurig alle kernen in een 3D-beeld zonder dubbele telling of ontbrekende alle kernen rekenen. Afwisselend, men kan rekenen elke nucleus in elke z-vlak, en de merken-naar-cellen R script3 kan worden gebruikt voor het verwijderen van vermenigvuldigen-geteld kernen.
  3. Bereken cel aantallen en de frequentie van de bovenstaande punten afhankelijk van het soort meting van de celcyclus nodig. De soorten kernen worden gedefinieerd in tabel 1 en Figuur 2. De berekeningen zijn samengevat in tabel 2.
    1. (Variatie ik) Ter identificatie van de kernen in de S-fase, voederen van de dieren EdU gedurende 30 minuten. Alle kernen EdU label weergeven zijn S-fase kernen. Als u wilt berekenen, neem de som A en C-kernen, Zie tabel 1 en Figuur 2.
      Opmerking: Alle EdU label kernen zijn In een 30 min EdU puls in wild-type volwassen hermafrodieten, samen met een label met voorlopercellen zone markeringen1.
    2. Voor het meten van de zone van voorlopercellen, vlek met een voorlopercellen zone teller zoals REC-8 of WAPL-1 antilichaam. De voorlopercellen zone wordt gedefinieerd als alle nucleoplasmic REC-818 of WAPL-1 immunoreactive germline kernen. Als u wilt berekenen, som van alle WAPL-1 immunoreactive kernen (A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
      Opmerking: WAPL-1 is het ook etiketten met de DTC en somatische gonaden kernen die niet moeten worden meegeteld. Somatische kernen zijn gemakkelijk te herkennen door intensieve WAPL-1 signaal, standpunt enigszins buiten de kiemcellen, en een "gebakken-ei"-morfologie van de kernen.
    3. Voor het meten van de S-fase-index, een 30 min EdU experiment uitvoeren en co label met REC-8 of WAPL-1 antilichaam. De S-fase-index wordt gedefinieerd als het percentage van de voorvader zone die is in de S-fase. Als u wilt berekenen, tellen alle kernen van de S-fase, en vervolgens delen door het totale aantal voorlopercellen zone kernen (A + C / A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
    4. (Variatie II) Ter identificatie van de kernen in M-fase, vlek met pH3 antilichaam. Elke pH3 immunoreactive kernen zijn kernen van de M-fase. Dit werkt ongeacht de duur van de EdU feed. Als u wilt berekenen, nemen de som van A en B-kernen, Zie tabel 1 en Figuur 2.
      Opmerking: WAPL-1 is het ook etiketten met de DTC en somatische gonaden kernen die niet moeten worden meegeteld. Somatische kernen zijn gemakkelijk te herkennen door intensieve WAPL-1 signaal, standpunt enigszins buiten de kiemcellen, en een "gebakken-ei"-morfologie van de kernen.
    5. Voor het meten van de M-fase-index, label samen met pH3 en REC-8 of WAPL-1-antistoffen. De M-fase-index wordt gedefinieerd als het percentage van de voorvader-zone die zich in M-fase. Als u wilt berekenen, tellen alle kernen van de M-fase en vervolgens delen door het totale aantal voorlopercellen zone kernen (A + B / A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
    6. (Variatie III) Kernen in mitotische en Meiotische S-fase label zowel met EdU. Om te vertellen van de twee bevolkingsgroepen uit elkaar, bepalen of de S-fase werd gevolgd door mitose of door meiose. Om te bepalen of kernen in mitotische of Meiotische S-fase, EdU-feed voor 4 h en co label voor pH3 (een marker van de M-fase) en HIM-3 (een eiwit van de as Meiotische chromosoom) van de antilichaam kleuring. Opnemen van de kernen die zowel de EdU als de pH3 weergegeven (type A, Zie tabel 1 en Figuur 2) als mitotische S-fase terwijl kernen die zowel de EdU als de HIM-3 weergegeven (type E, Zie tabel 1 en Figuur 2) als Meiotische S-fase.
    7. (Variatie IV) Berekenen van de duur van G2-fase.
      Opmerking: G2-fase scheidt S-fase van de M-fase. Hoewel geen markering is gemeld aan etiket G2 in de kiemcellen van C. elegans , kunt een berekenen van de duur van G2-fase door het combineren van gegevens uit verschillende experimenten die M-fase (op het moment van de dissectie) en de S-fase (vanaf verschillende h vóór label dissectie). Een cel waarin zowel de M-fase en de S-fase markers G2-fase afgerond in de loop van het experiment. Een cel waarin alleen de M-fase markering en niet de S-fase markering was niet in de S-fase tijdens het experiment.
      1. Voor het berekenen van de duur van de G2-fase, EdU-feed voor 2 h en co label met pH3 antilichaam. Enige kernen die label met pH3 (dit zijn in M-fase ten tijde van de dissectie) voor de aanwezigheid van EdU (deze waren in de S-fase tijdens de 2 h EdU etiket voorafgaand aan dissectie) onderzoeken. Berekenen van de Fractie van de kernen van de M-fase die G2-fase afgerond (A / A + B, Zie tabel 1 en Figuur 2).
      2. Herhaal dit experiment met een 3U EdU-label, en opnieuw met een 4 h EdU label (en optioneel een 5U EdU-label). Plot de procent van pH3 positieve kernen die EdU positief over de y-as en de duur van EdU-label op de x-as, zoals weergegeven in figuur 3A.
      3. Het berekenen van de mediane duur van G2-fase door het aansluiten van de punten op de grafiek en bepalen waar de lijn kruist 50%, zoals getoond in figuur 3A.
      4. Berekenen de maximale duur van G2-fase door het aansluiten van de punten op de grafiek en bepalen waar kruist de lijn 99%, zoals getoond in figuur 3A.
    8. (Variatie V) Bereken de duraion van G2 + M + G1.
      Opmerking: In de C. elegans germline, G1-fase is ongewoon korte. Hoewel geen markering is gemeld aan het label G1 in het C. elegans germline, kan een schatten van de duur van de som van de G1, G2 en M-fase en vergelijk deze tijd met de tijd van de G2-fase hierboven beschreven. De maximale duur van G2 + M + G1 is naar schatting van het percentage van alle voorlopercellen zone kernen (WAPL-1 immunoreactive) dat EdU negatieve (S-fase niet ondergaan) blijven na EdU labeling voor enkele uren.
      1. Voor het berekenen van de duur van G2 + M + G1, EdU-feed voor 2 h en co label met REC-8 of WAPL-1 antilichaam. Bepalen van de Fractie van de voorvader zone die S-fase gedurende deze tijd onderging (A + C / A + B + C + D, Zie tabel 1 en Figuur 2).
      2. Herhaal dit experiment met een 3U EdU-label, en opnieuw met een 4 h EdU label (en optioneel een 5U EdU-label). Plot de procent van REC-8 of WAPL-1 positieve kernen die EdU positief over de y-as en de duur van EdU-label op de x-as, zoals weergegeven in figuur 3B.
      3. Berekenen de maximale duur van G2 + M + G1 door het aansluiten van de punten op de grafiek en vinden waar kruist de lijn 99%, zoals getoond in figuur 3B.
        Opmerking: Het is mogelijk om uit te voeren van de experimenten voor de duur van de G2 en G2 + M + G1 als een enkele set van 2, 3, 4 en 5 h EdU experimenten door mede labelen met zowel konijn-anti-WAPL-1 en muis-anti-pH3 antilichamen.
    9. (Variatie VI) Om te identificeren van de kernen die gerepliceerd in de zone van voorlopercellen maar hebben sinds ingevoerde meiose, voederen van de dieren EdU voor 10u en co label met REC-8 of WAPL-1-antistoffen. Alle kernen weergeven EdU label waren in de S-fase tijdens die 10 h. Alle kernen die niet nucleoplasmic REC-8 of WAPL-1 kleuring weergegeven waren in meiose. Gewoon tellen de kernen met EdU etikettering die niet weergeven labelen met de voorlopercellen zone markering (E, Zie tabel 1).
      Opmerking: Omgekeerd als gonaden voor de Meiotische profase marker HIM-3 met anti-HIM-3 antilichamen zijn bevlekt, tellen het aantal kernen met EdU labeling die zijn ook positief voor HIM-3.
    10. Voor het berekenen van het tarief van Meiotische binnenkomst, het bovenstaande experiment met een 5 h, 10 h en 15 h etiket van EdU uitvoeren Plot het aantal kernen die meiose ingevoerd via de y-as en de duur van het EdU-label op de x-as, zoals in Figuur 3 c. Gebruik vervolgens een eenvoudige lineaire regressie voor de berekening van de helling (kernen ingevoerd meiose per h) uit y = mx + b.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het gebruik van een lineaire regressie om te bereken het percentage van Meiotische vermelding. Het zou onjuist zijn om simpelweg verdelen van het aantal kernen die meiose ingevoerd door de duur van het EdU-label, want het y-snijpunt niet nul is.
    11. (Variatie VII) Meet het tarief van Meiotische progressie.
      Opmerking: Aangezien EdU covalent in DNA is opgenomen, kan het worden gebruikt voor het bijhouden van een bevolking van cellen tot differentiatie. De cellen die onderging S-fase in de zone van voorlopercellen behouden de EdU-label als ze aangaan van meiose, vooruitgang door middel van meiose, en ondergaan oögenese. Een puls-chase experiment met EdU kan worden gebruikt voor het meten van de snelheid van Meiotische progressie.
      1. EdU-geëtiketteerden bacteriën voeden de dieren gedurende 4 uur (de "pulse"). De dieren op labelloze OP50 bacteriën voor 48 h (de "jacht"), overdragen dan ontleden en co label met een voorvader zone teller zoals REC-8 of WAPL-1 (of een marker Meiotische profase zoals HIM-3) indien gewenst.
      2. Wanneer imaging, kijk voor de positie van de meest proximale EdU-geëtiketteerden kern. Het tarief van Meiotische progressie is de afstand (in de diameters van de cel aan het einde van de zone van voorlopercellen) reisde door de meest proximale EdU label nucleus tijdens de achtervolging 48u.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien DNA-synthese te nemen EdU vereist is, kan men concluderen dat EdU-geëtiketteerden kernen S-fase onderging tijdens het venster van de tijd van de EdU-labeling. Men kan de kernen dat label in een 30 min vervoederen EdU bacteriën aangeduid als kernen in de S-fase ten tijde van de dissectie interpreteren. Kernen die label in een meer continu EdU experiment voeding kunnen vroeg in het venster van de tijd en sinds de linker S-fase hebt gelabeld, of kunnen hebben met het label in het l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorbereiding van EdU-geëtiketteerden bacteriën (stap 1) is van cruciaal belang voor dit protocol, en het eerste punt voor het oplossen van problemen. De jonge volwassen hermafrodieten wild-type etiket zeer betrouwbaar in een 4 h EdU-pulse, waardoor dit een nuttige controle voor elke nieuwe partij van EdU-geëtiketteerden bacteriën. Bovendien zal intact EdU-geëtiketteerden bacteriën die worden ingevoerd door de darm (in oudere dieren of bepaalde farynx/grinder defecte mutanten) label met klik chemie en worden weergegeven ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan de E. coli voorraad center voor MG1693; Wormbase; de Caenorhabditis genetica centrum dat wordt gefinancierd door de nationale instituten van gezondheid Office van onderzoek infrastructuur programma's (P40OD010440) voor stammen; Zach Pincus voor statistisch advies; Aiping Feng voor reagentia; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar en John Brenner voor opleiding, advies, ondersteuning en nuttige discussie; en de Kornfeld en Schedl labs voor feedback over dit manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 aan KK, R01 GM100756 naar TS] en een National Science Foundation predoctoraal fellowship [DGE-1143954 en DGE-1745038 naar ZK]. De National Institutes of Health noch de National Science Foundation had een rol in het ontwerp van de studie, verzameling, analyse en interpretatie van gegevens, en geen schriftelijk het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411groeit prima in standaard ongesupplementeerd LB
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitThermo Fisher ScientificC10337
5-Ethynyl-2’-deoxyuridineSigma900584-50MGof gebruik EdU in de kit
GlucoseSigmaD9434-500GD-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1)SigmaT4625-5GReagent Grade
ThymidineSigmaT1895-1GBioReagent
Magnesium sulfate heptahydrateSigmaM1880-1KGMgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrousFisherBP332-500GNa2HPO4
Potassium Phosphate, monobasicSigmaP5379-500GKH2PO4
Ammonium ChlorideSigmaA4514-500GNH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological AgarUS BiologicalC13071058
Calcium Chloride dihydrateSigmaC3881-500GCaCl
LB Broth (Miller)SigmaL3522-1KGGebruikt bij 25g/L
LevamisoleSigmaL9756-5G0.241g/10ml
Phosphate buffered salineCalbiochem Omnipur6506zelfgemaakte PBS werkt net zo goed
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampulesElectron Microscopy Sciences1571010ml ampullen
100% methanolThermo Fisher ScientificA454-1LGold-label methanol is cruciaal voor de juiste morfologie met bepaalde antilichamen
Goat SerumGibco16210-072Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002Lot G3048-179A02, gebruikt bij 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10Millipore05-806Lot#2680533, gebruikt bij 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lot 1256147, gebruikt bij 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lot 1511347, gebruikt bij 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200mounting medium zonder DAPI kan in plaats daarvan worden gebruikt, gevolgd door een aparte DAPI-incubatie
Nail polishWet n WildDTC450Belke heldere nagellak zou moeten werken
S-mediumvariouszie wormbook.org voor protocol
M9 buffervariouszie wormbook.org voor protocol
M9 agarvariouszelfde recept als M9 buffer, maar voeg 1,7% agar toe
Nematode Growth Mediumvariouszie wormbook.org voor protocol
Dissecting watch glassCarolina Biological42300
Parafilm laboratory filmPechiney Plastic PackagingPM-9964 inch brede laboratoriumfilm
Petri dishes60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubesMidSci Avant2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needlesBD PrecisionGlide305122
5ml glass centrifuge tubePyrex
Borosilicate glass tubes 1ml
Glass slides
No 1 coverslips 22 x 40 mmNo 1.5 mag ook werken
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical CentrifugeIEC428met 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscopeZeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lensZeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal systemPerkinElmerNikon spinning disc confocal systeem werkt ook heel goed, zoals beschreven hier: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107(2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985(2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EdU incorporatieS fase indexM fase indexG2 duurimmunofluorescentiekleuringdissectie van gonadenclick chemieFiji cell counter

Gerelateerde artikelen