Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De elektrische activiteit van cellen in weefsels door elektrofysiologische technieken kan worden gecontroleerd, maar deze zijn meestal beperkt tot de analyse van afzonderlijke cellen. Aangezien een verhoging van intracellulair calcium (Ca2 +) in het cytosol wordt vaak door de elektrische activiteit veroorzaakt, of in antwoord op een groot aantal andere stimuli, dit proces kan worden gecontroleerd door de beeldvorming van cellen geladen met fluorescerende calcium-gevoelige kleurstoffen. Het is echter moeilijk om het imago van deze reactie in een afzonderlijke celtype binnen hele weefsel, omdat deze kleurstoffen worden overgenomen door alle celtypes in het weefsel. In tegenstelling, genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) kunnen worden uitgedrukt in een afzonderlijke celtype en lichten in antwoord op een verhoging van intracellulaire Ca2 +, dus de beeldvorming van Ca2 + signalering in hele bevolkingen van het toelaat individuele celtypes. Hier, wij het gebruik van de GECIs GCaMP3/6 van toepassing op de muis motorische eindplaat, een tripartiete SYNAPS tussen motorische neuronen, skeletspieren en terminal/perisynaptic cellen van Schwann. We tonen het nut van deze techniek in klassieke ex vivo weefsel preparaten. Met behulp van een optische splitter, voeren wij dual-golflengte beeldvorming van dynamische Ca2 + signalen en een statische label van de motorische eindplaat (NMJ) in een benadering die kan gemakkelijk aangepast worden aan twee cel-specifieke GECI of genetisch gecodeerde spanning controleren indicatoren (GEVI) tegelijk. Tot slot bespreken we de routines gebruikt voor het vastleggen van ruimtelijke kaarten van de intensiteit van de fluorescentie. Samen kunnen deze optische, transgene en analytische technieken worden toegepast om te bestuderen van de biologische activiteit van afzonderlijke cel subpopulaties op de NMJ in een breed scala van contexten.
Inleiding
De NMJ, zoals alle synapsen, bestaat uit drie elementen: een presynaptische terminal afgeleid van een neuron, een postsynaptisch neuron/effector cel, en een perisynaptic gliale cel1,2. Terwijl de basisaspecten van synaptische transmissie werden eerst gedemonstreerd op deze synapse3, blijven vele aspecten van dit proces onbekend, gedeeltelijk als gevolg van de expressie van de dezelfde moleculen door de verschillende cellulaire elementen van deze synapsen. Bijvoorbeeld, worden receptoren voor zowel de purine adenine nucleotide ATP en acetylcholine (ACh), die mede door motorische neuronen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de IACUC bij de Universiteit van Nevada.
1. bereiding van het pessarium en de Phrenic van de zenuwen van transgene muizen
- Aankoop transgene muizen en oligonucleotide inleidingen te genotype deze muizen.
Opmerking: De inleidingen zijn vermeld op de pagina 'Informatie' voor elk van deze muizen.- Fokken van een 3 - tot 6-maand-oude muis uiting van één exemplaar van de passende transgene/knock-in Cre-driver allel en nul kopieën van het voorwaardelijke GCaMP3/6 -al....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verschillende voorbeelden van fluorescentie intensiteit veranderingen, gemedieerd door verhogingen van intracellulaire Ca2 + binnen de gedefinieerde celtypes van het NMJ, tonen het nut van deze aanpak. Deze resultaten worden gepresenteerd als ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten, waarmee de locatie van de reagerende cellen, alsmede de intensiteit van hun antwoorden, zodat voor de beoordeling van hoeveel cellen reageren en hoeveel elke cel reageert op een bepaalde stimu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij bieden hier enkele voorbeelden van het meten van Ca2 + reacties in specifieke cellen in intact neuromusculaire weefsel met behulp van GECI-uiten muizen. Om deze experimenten uitvoeren, is het absoluut noodzakelijk niet te verwonden de phrenic zenuw tijdens de dissectie. Naar image Ca2 + antwoorden in de cellen van Schwann op lage of hoge kracht (dat wil zeggen, 20 X of 60 X), moet het BHC of µ-conotoxin naar Blokverplaatsing gebruiken. Voor de beeldvorming van de spaarstand van Ca2.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) GM103554 en GM110767 aan (T.W.G.) en van het National Center for onderzoeksmiddelen 5P20RR018751 en het National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (voor G.W.H.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Myf5-Cre muizen | Jax | #007893 | Drijft spiercelexpressie zo vroeg als E136 |
| Wnt1-Cre muizen | Jax | #003829 | Drijft expressie naar alle Schwann-cellen bij E13 maar niet P209 |
| Sox10-Cre muizen | Jax | #025807 | Drijft Schwann-celexpressie op oudere leeftijden |
| Conditionele GCaMP3 muizen | Jax | #029043 | Expresseert GCaMP3 op celspecifieke wijze |
| Conditionele GCaMP6f muizen | Jax | #024105 | Expresseert GCaMP6f op celspecifieke wijze |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-on) | Hit2Lead | #5102862 | Blokkeert skeletspiermyosine maar niet neurotransmissie6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labelt acetylcholinereceptorclusters op NMJ |
| µ-conotoxine GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blokkeert Nav1.4 spanningsafhankelijke natriumkanaal8 |
| Silicone Dielectric Gel; ook bekend als Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel.9KG | Maakt de immobilisatie van het diafragma mogelijk door middel van minutien-pins |
| Minutien-pins (0,1 mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobiliseert diafragma op siliconen dielectric gel |
| Eclipse FN1 rechtopstaande microscoop | Nikon | MBA74100 | Maakt staging en observatie van specimen mogelijk |
| Basisplatform voor vaste microscoop met handmatige XY-microscoopvertaler | Autom8 | MXMScr | Maakt beweging van specimen mogelijk |
| Handmatige micromanipulator | Narishige | M-152 | Houdt opname- en stimulatie-elektroden vast |
| Micro-elektrode versterker | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Maakt scherpe elektrode intracellulaire elektrofysiologische opname mogelijk |
| Micro-elektrode laag-ruis data-acquisitiesysteem | Molecular Devices | Digidata 1550 | Maakt elektrofysiologische data-acquisitie mogelijk |
| Micro-elektrode data-analysesysteem | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Voert elektrofysiologische data-analyse uit |
| Vierkantgolfstimulator | Grass | S48 | Stimuleert zenuw om spier te exciteren |
| Stimulatie-isolatie-eenheid | Grass | PSIU6 | Vermindert stimulatie-artefacten |
| Borosilicaat filamenten, 1,0 mm buitendiameter, 0,5 mm binnendiameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impaleert en neemt zenuw-geïnduceerde spierpotentiëlen op |
| Borosilicaat filamenten, 1,5 mm buitendiameter, 1,17 mm binnendiameter | Sutter | BF150-117-15 | Verlengd en gebruikt voor zuigelektrode |
| Micropipet-trekker | Sutter | P-97 | Trekt en bereidt opname-elektroden |
| 1200x1200 pixel, achterverlichte cMOS-camera | Photometrics | Prime 95b | Gevoelige camera die hoge resolutie, hoge snelheid beeldvorming mogelijk maakt |
| Lichtbron | Lumencor | Spectra X | Zorgt voor verlichting vanaf LEDs voor fluorescentieobservatie |
| Oneindig gecorrigeerde fluorescente water-immersieobjectieven, W.D. 2 mm | Nikon | CFI60 | Biedt lange werkafstanden voor visualisatie van specimen |
| Vezeloptische verlichter met halogeenlamp | Sumita | LS-DWL-N | Zorgt voor verlichting voor brightfield-observatie |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projecteert 1 paar dual-wavelength beelden gescheiden door een dichroisch naar een enkele camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 en 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Maakt dubbele bandbeeldvorming mogelijk |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25x36 | Dichroische spiegel die lichtbundels scheidt om dual-wavelength beeldvorming mogelijk te maken |
| Beeldvorming data-acquisitiesysteem | Nikon | NIS Elements - MQS31000 | Maakt beeldvorming data-acquisitie mogelijk |
| Golflengte controle module | Nikon | MQS41220 | Module voor beeldvorming data-acquisitie |
| Emissie splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module voor beeldvorming data-acquisitie |
| Beeldvorming data-analysesysteem | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Maakt analyse van fluorescentie-intensiteit en andere beeldvormingsgegevens mogelijk |
Referenties
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple func....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
