Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Samenvatting

De elektrische activiteit van cellen in weefsels door elektrofysiologische technieken kan worden gecontroleerd, maar deze zijn meestal beperkt tot de analyse van afzonderlijke cellen. Aangezien een verhoging van intracellulair calcium (Ca^{2 +}) in het cytosol wordt vaak door de elektrische activiteit veroorzaakt, of in antwoord op een groot aantal andere stimuli, dit proces kan worden gecontroleerd door de beeldvorming van cellen geladen met fluorescerende calcium-gevoelige kleurstoffen.  Het is echter moeilijk om het imago van deze reactie in een afzonderlijke celtype binnen hele weefsel, omdat deze kleurstoffen worden overgenomen door alle celtypes in het weefsel. In tegenstelling, genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) kunnen worden uitgedrukt in een afzonderlijke celtype en lichten in antwoord op een verhoging van intracellulaire Ca^{2 +}, dus de beeldvorming van Ca^{2 +} signalering in hele bevolkingen van het toelaat individuele celtypes. Hier, wij het gebruik van de GECIs GCaMP3/6 van toepassing op de muis motorische eindplaat, een tripartiete SYNAPS tussen motorische neuronen, skeletspieren en terminal/perisynaptic cellen van Schwann. We tonen het nut van deze techniek in klassieke ex vivo weefsel preparaten. Met behulp van een optische splitter, voeren wij dual-golflengte beeldvorming van dynamische Ca^{2 +} signalen en een statische label van de motorische eindplaat (NMJ) in een benadering die kan gemakkelijk aangepast worden aan twee cel-specifieke GECI of genetisch gecodeerde spanning controleren indicatoren (GEVI) tegelijk. Tot slot bespreken we de routines gebruikt voor het vastleggen van ruimtelijke kaarten van de intensiteit van de fluorescentie. Samen kunnen deze optische, transgene en analytische technieken worden toegepast om te bestuderen van de biologische activiteit van afzonderlijke cel subpopulaties op de NMJ in een breed scala van contexten.

Inleiding

De NMJ, zoals alle synapsen, bestaat uit drie elementen: een presynaptische terminal afgeleid van een neuron, een postsynaptisch neuron/effector cel, en een perisynaptic gliale cel^1,2. Terwijl de basisaspecten van synaptische transmissie werden eerst gedemonstreerd op deze synapse³, blijven vele aspecten van dit proces onbekend, gedeeltelijk als gevolg van de expressie van de dezelfde moleculen door de verschillende cellulaire elementen van deze synapsen. Bijvoorbeeld, worden receptoren voor zowel de purine adenine nucleotide ATP en acetylcholine (ACh), die mede door motorische neuronen bij de gewervelde NMJ zijn vrijgegeven, uitgedrukt door spieren, cellen van Schwann en motorische neuronen, dus de interpretatie van een complicerende functioneel effect uitgeoefend door deze stoffen (b.v., zender release of reactie, spier strijdkrachtgeneratie)⁴. Bovendien, hoewel de tripartiete componenten van de NMJ eenvoudig zijn in vergelijking met, bijvoorbeeld neuronen in het centrale zenuwstelsel die vaak meerdere synaptic ingangen vertonen, of motorische neuronen, spiercellen, of cellen van Schwann in reactie op stimuli op basis verschillen op hun intrinsieke heterogeniteit (bijvoorbeeldembryonale afleiding, vezel subtype, morfologie) is onduidelijk. Om elk van deze kwesties, zou het voordelig voor het gelijktijdig het bijhouden van de reactie van veel cellen binnen één synaptic element, evenals spoor, op hetzelfde moment, een dergelijk antwoord op een van de andere afzonderlijke elementen. Conventionele strategieën door middel van chemische kleurstoffen te meten calcium signalering niet kunnen deze twee doelen, bereiken omdat Bad-toegepast kleurstof in beslag door meerdere celtypen na toepassing aan weefsel genomen wordt, en intracellulair geladen kleurstof kan alleen worden gebruikt om te visualiseren individuele of kleine cohorten van cellen. Hier, met behulp van transgene muizen uiting van GECIs ontworpen voor de meting van de cel-specifieke calcium signalering, samen met specifieke imaging en software tools⁵, we tonen de eerste van deze twee algemene doelstellingen en bespreken hoe de toevoeging van nieuwe transgene hulpmiddelen zou helpen met het bereiken van de tweede. Deze techniek zal zitten nuttig voor iedereen die geïnteresseerd is in het bijhouden van calcium dynamics of andere cellulaire gebeurtenissen waarneembare signalering via gen gecodeerde optische sensoren in meerdere cel populaties op hetzelfde moment.

Protocol

Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de IACUC bij de Universiteit van Nevada.

1. bereiding van het pessarium en de Phrenic van de zenuwen van transgene muizen

1. Aankoop transgene muizen en oligonucleotide inleidingen te genotype deze muizen.
   Opmerking: De inleidingen zijn vermeld op de pagina 'Informatie' voor elk van deze muizen.
   1. Fokken van een 3 - tot 6-maand-oude muis uiting van één exemplaar van de passende transgene/knock-in Cre-driver allel en nul kopieën van het voorwaardelijke GCaMP3/6 -allel met een tweede muis van dezelfde leeftijd uiting geven aan een of twee exemplaren van de voorwaardelijke GCaMP3 / 6 -allel en nul kopieën van het Cre-driver-allel.
   2. Genotype de pups en mark degene die zowel Cre en voorwaardelijke GCaMP3/6 allelen — deze zullen voortaan worden genoemd dubbel-transgene muizen (bijvoorbeeld Myf5-Cre, voorwaardelijke GCaMP3)⁶.
      Opmerking: Op deze manier alle gegevens zal ontlenen muizen uiting van één exemplaar van de Cre zowel voorwaardelijke GCaMP3/6 allelen. Dit is vooral belangrijk als in andere mutant muizen (b.v., uitsparingen) toe te voegen aan deze kruizen.
2. Wanneer de dubbele-transgene muizen zijn van de juiste leeftijd (bv, postnatale dag 0 of 5 [P0 of P5] of volwassen), de muizen gewoon door het onthoofden van hen met een schaar (voor muizen jonger dan P10) of door ze te plaatsen in een zaal van de inademing Isofluraan euthanaseren — wanneer ze zijn niet langer inspelen op de staart met een paar pincet te knijpen, ze zijn klaar voor offer.
3. Het dier offeren door onthoofding met een schaar.
4. Sectie dwars over het gehele dier net onder de lever en net boven het hart en de longen met een iridectomy schaar.
5. Ontleden weg de lever, het hart en de longen, voorzichtig om een lengte van de phrenic zenuw die voldoende lang is om te worden getrokken in het een zuiging-elektrode (d.w.z., 1-2 cm).
   Opmerking: De linker phrenic zenuw kan worden geïdentificeerd als een wit stukje weefsel waarmee u invoert van de mediale gedeelte van het linker diafragma. Het moet niet worden verminderd bij het verwijderen van de longen. De juiste phrenic zenuw loopt in een stuk van de fascia die ook bevat de superieure vena cava en dunner en witter dan de vena cava. Samen, doordringen ze allebei het recht mediale middenrif.
6. Verder de ribbenkast en de wervelkolom, met uitzondering van de dunne rand rond het middenrif te verwijderen.
7. Plaats het middenrif en de phrenic zenuw monster in een microfuge buis met Krebs-Ringer-oplossing met 1 µg/mL 594-αBTX voor 10 min in het donker.
   Opmerking: Deze concentratie van 594-αBTX etiketten ACh-receptoren (AChRs) zonder hun functie (persoonlijke observatie) blokkeren.

2. stimulatie en opname van de spier-actie-mogelijkheden

1. Met behulp van minutien pinnen, het middenrif immobiliseren door vastzetten op een 6-cm schotel bedekt met diëlektrische siliconengel en gevuld met ~ 8 mL zuurstofrijk Krebs-Ringer-oplossing en plaatst u deze op het podium van de Microscoop. Perfuse het middenrif met meer Krebs-Ringer-oplossing (8 mL/min) voor 30 min.
   Opmerking: Dit rinses van de niet-afhankelijke 594-αBTX, evenals equilibrates van het weefsel na dissectie.
2. Het maken van een zuignap elektrode volgens de gevestigde methoden⁷.
   1. Op 4 X vergroting, met behulp van een micromanipulator, de zuig elektrode overgaan in de linker phrenic zenuw en afzuigen door te trekken uit het vat van een 5 mL-spuit verbonden met de slang die is gekoppeld aan de zuiging elektrode.
      Opmerking: Als u met succes tekenen in de zuig elektrode, de phrenic zenuw is strak. Zet de stimulator aan en stimuleren de phrenic zenuw door flipping de handmatige schakelaar 1 x.
   2. Zorg ervoor dat het middenrif in reactie op de 1-Hz-stimulatie contracten door visueel onderzoek van het met helderveld verlichting. Als dat niet het geval is, de kruisspanning door te draaien aan de knop spanning stapsgewijs om een puls-supramaximal, die door een visueel onderzoek van de spiercontractie kan worden geverifieerd. Als nog niet zichtbaar, de zenuw blazen met de spuit en proberen te trekken het opnieuw door het toepassen van zuiging.
3. Uitschakelen van de perfusie en de spier-specifieke myosin remmer BHC⁶ of de spanning-gated natrium kanaal antagonist µ-conotoxin⁸ toevoegen om een eindconcentratie van 100 µM.
   1. Om 100 µM BHC, Pipetteer 4 µL van 200 mM voorraad in DMSO en predilute het in 1 mL Krebs-Ringer-oplossing.
   2. 1 mL van Krebs-Ringer-oplossing verwijderen uit de schotel.
   3. De prediluted BHC, aan het gerecht toevoegen.
      Opmerking: Deze predilution voorkomt dat de inductie door onverdund DMSO van een niet-voorbijgaande fluorescerende antistofrespons uiting van GCaMP3 cellen.
   4. 30 min wachten en schakel vervolgens, op de perfusie van verse Krebs-Ringer-oplossing voor een ander 20-30 min.
4. De opname-elektrode voor te bereiden.
   1. Dragen handschoenen, een filamented borosilicaatglas met een buitendiameter (OD) van 1 mm en een binnendiameter (ID) van 0,4 mm plaats in een micropipet trekker en draai de wijzerplaten om klem het naar de gewenste positie. Sluit de deur van de trekker.
   2. De volgende instelling met behulp van een P-97 puller, program: warmte op 900, trek op 120, snelheid op 75, tijdstip 250, druk op 500, en geen extra lussen.
      Opmerking: Resistance (R) is gemeten met behulp van de besturingselementen van de software van de versterker: de data acquisitie software bevestigt weerstand door het oplossen van de formule V = IR. De controller software passeert een bekende stroom (I) (meestal 1 nA) door de elektrode en meet de verandering in spanning (V), zodat wij voor R. op te lossen
   3. Voor embryonale pessarium, ervoor zorgen dat de weerstand in de buurt van 60 MΩ en voor oudere pessarium, 10-20 MΩ. De opname-elektrode met 3 M KCl laden.
5. Op 10 X vergroting, verlaagt u de elektrode in de spier, met behulp van een tweede micromanipulator aan de andere kant van het werkgebied als een stimulerende elektrode.
6. Met behulp van elektrofysiologische data acquisitie software, wachten totdat de rustpotentiaal membraan van 0 in-65 verandert mV of lager.
7. Stimuleren van 1 Hz en controleer of de aanwezigheid van een actiepotentiaal spier door te controleren voor een groot potentieel, dat een bescheiden overschrijding vertoont (potentieel dat boven 0 stijgt mV wanneer bij-65 begint mV of lager). Verwar niet stimulatie artefact met een actiepotentiaal.
   Opmerking: Potentials zijn aanzienlijk langer in duur (~ 5 ms) dan stimulatie artefacten.

3. beeldvorming van de fluorescentie van het monster

1. Op 20 X vergroting, de eindplaat band in het midden van de spier te vinden door te zoeken naar 594-αBTX-label NMJs onder groen/geel licht excitatie (550 nm). Overschakelen naar de blauwe lichte excitatie (470 nm) naar afbeelding Ca^{2 +} antwoorden in de spier, motor neuron of cellen van Schwann.
2. Indien gewenst, instellen de afbeelding splitter met bandpass filters en een dichroïde single-rand-filter voor de beeldvorming van de dual-golflengte.
3. Oog op de berekening van de maximale fluorescentie (Fmax) tentoongesteld door GCaMP3/6-uiten weefsel, toevoegen u 12 µL van 3 M kaliumchloride (KCl) aan de middenrif preparaten⁶.
   1. Experimenten met de brightness-balk op de lookup tabel bar ingesteld op 110% van het niveau waarop het weefsel GCaMP3/6-uiten verzadiging op 20 X vergroting, vertoont zonder weggooien in reactie op KCl uitvoeren.
4. Een snelle gebeurtenissen registreren bij 20 kaders per seconde om niet missen.
5. Met 1-45 s van 20-40 Hz van zenuwstimulatie stimuleren door het leveren van een trein van impulsen met behulp van de zuiging elektrode of farmacologische agonisten toevoegen door Bad toepassing of door perfusie en dynamische fluorescerende Ca^{2 +} antwoorden in één cel subtype verzamelen samen met het statische 594-αBTX NMJ signaal.
   Opmerking: Als weefsel-specifieke rode of far-red GECI of GEVI muizen beschikbaar voor gebruik op de NMJ komen, ze kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van twee dynamische signalen als gevolg van twee verschillende cellulaire elementen op de NMJ.
6. Wanneer de imaging of elektrofysiologische experimenten worden voltooid omdat de gewenste resultaten zijn bereikt, perfuse van water door de linies perfusie en zuigen water 2 x - 3 x door de zuigkracht elektrode om ervoor te zorgen dat zouten niet doen opbouwen.

4. uitvoer en analyse van de gegevens door een standaarddeviatie kaart van fluorescentie intensiteit (SD_iu16)

1. Record beeldsequenties opgenomen als 16-bits TIFF-stapels en laad ze in de gewenste beeldvorming gegevens analysesysteem voor analyse.
2. Selecteer afbeeldingsstapel van belang in de software van de 8d bestandsmenu, en klik om te laden.
   1. Zodra de video is geladen, scannen door de tijd om te identificeren van een sectie die geen cellulaire fluorescerende activiteit.
      Opmerking: Deze regio zal worden gebruikt om een monster van de achtergrond.
   2. Houd SHIFT ingedrukt en klik om het tekenen van een regio van belang (ROI) vak in het gebied aangewezen als het voorbeeldgebied achtergrond.
   3. Na het maken van het vak, druk op de SPATIEBALK voor het genereren van een perceel van achtergrond activiteit wijzigen.
   4. Met de rechtermuisknop op het spoor en de diverse optie de optie voorleggen Dump ROI tekstnotatie te maken van het spoor als een xy-coördinaat tekstbestand.
3. Terug naar de video van belang, scan opnieuw ter identificatie van de regio van de tijd waar de activiteit van belang plaatsvindt.
   1. Selecteer de regio van deze tijd met de middelste muisknop in het gele vak.
   2. Klik met de rechtermuisknop op de video en selecteer Stapel OPS en vervolgens Stat kaart optie 5.
      Opmerking: Dit zal genereren een standaarddeviatie-kaart (SD kaart) in het linker venster.
   3. Klik op de SD-kaart en vervolgens druk op de ] sleutel 19 x toepassen de gewenste kleur warmte-kaart.
   4. Met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer STM laden en opslaan, die de optie Opslaan als TIFF-stm te redden van de SD-kaart zal presenteren.
   5. Dan, druk op de [ sleutel 19 x terug te keren naar een kleurplan grijswaarden.
   6. Druk op C en vervolgens op D om dichtheid toewijzing hulpmiddelen. Gebruik de linker muisknop en muisknop in het midden, pas de drempel tot alle fluorescerende activiteit wordt weergegeven in de SD-kaart.
   7. Druk op C om de dichtheid tools met behoud van de drempel-instellingen te sluiten.
   8. Met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer STM deeltjes en dan Vinden PTCLS.
      Opmerking: Dit zal identificeren van afzonderlijke cellen uiten van fluorescerende activiteit.
   9. Nogmaals met de rechtermuisknop op de SD-kaart en selecteer Maken Particle ROIs.
      Opmerking: Dit zal de geselecteerde cellen op de oorspronkelijke video van belang superponeren.
   10. Houd SHIFT ingedrukten klik met de rechtermuisknop op een van de nu vastgestelde deeltje ROIs op de oorspronkelijke video.
   11. Selecteer ROI Marker en maatregel Int in ROI.
       Opmerking: Dit zal individuele fluorescerende activiteit percelen genereren voor elke geïdentificeerde ROI in de video van belang. Deze kunnen worden gered door met de rechtermuisknop op een van deze en selecteren Assorted, gevolgd door Dump ROI als tekst.
4. Raadpleeg voor gedetailleerde logica ten grondslag liggen aan deze operaties, de bron code bestand⁹.

Resultaten

Verschillende voorbeelden van fluorescentie intensiteit veranderingen, gemedieerd door verhogingen van intracellulaire Ca^{2 +} binnen de gedefinieerde celtypes van het NMJ, tonen het nut van deze aanpak. Deze resultaten worden gepresenteerd als ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten, waarmee de locatie van de reagerende cellen, alsmede de intensiteit van hun antwoorden, zodat voor de beoordeling van hoeveel cellen reageren en hoeveel elke cel reageert op een bepaalde stimu...

Discussie

Wij bieden hier enkele voorbeelden van het meten van Ca^{2 +} reacties in specifieke cellen in intact neuromusculaire weefsel met behulp van GECI-uiten muizen. Om deze experimenten uitvoeren, is het absoluut noodzakelijk niet te verwonden de phrenic zenuw tijdens de dissectie. Naar image Ca^{2 +} antwoorden in de cellen van Schwann op lage of hoge kracht (dat wil zeggen, 20 X of 60 X), moet het BHC of µ-conotoxin naar Blokverplaatsing gebruiken. Voor de beeldvorming van de spaarstand van Ca^2...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Myf5-Cre muizen	Jax	#007893	Drijft spiercelexpressie zo vroeg als E136
Wnt1-Cre muizen	Jax	#003829	Drijft expressie naar alle  Schwann-cellen bij E13 maar niet P209
Sox10-Cre muizen	Jax	#025807	Drijft Schwann-celexpressie op oudere leeftijden
Conditionele GCaMP3 muizen	Jax	#029043	Expresseert GCaMP3 op celspecifieke wijze
Conditionele GCaMP6f muizen	Jax	#024105	Expresseert GCaMP6f op celspecifieke wijze
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-on)	Hit2Lead	#5102862	Blokkeert skeletspiermyosine maar niet neurotransmissie6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labelt acetylcholinereceptorclusters op NMJ
µ-conotoxine GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blokkeert Nav1.4 spanningsafhankelijke natriumkanaal8
Silicone Dielectric Gel; ook bekend als Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel.9KG	Maakt de immobilisatie van het diafragma mogelijk door middel van minutien-pins
Minutien-pins (0,1 mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobiliseert diafragma op siliconen dielectric gel
Eclipse FN1 rechtopstaande microscoop	Nikon	MBA74100	Maakt staging en observatie van specimen mogelijk
Basisplatform voor vaste microscoop met handmatige XY-microscoopvertaler	Autom8	MXMScr	Maakt beweging van specimen mogelijk
Handmatige micromanipulator	Narishige	M-152	Houdt opname- en stimulatie-elektroden  vast
Micro-elektrode versterker	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Maakt scherpe elektrode intracellulaire elektrofysiologische opname mogelijk
Micro-elektrode laag-ruis data-acquisitiesysteem	Molecular Devices	Digidata 1550	Maakt elektrofysiologische data-acquisitie mogelijk
Micro-elektrode data-analysesysteem	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Voert elektrofysiologische data-analyse uit
Vierkantgolfstimulator	Grass	S48	Stimuleert zenuw om spier te exciteren
Stimulatie-isolatie-eenheid	Grass	PSIU6	Vermindert  stimulatie-artefacten
Borosilicaat filamenten, 1,0 mm buitendiameter, 0,5 mm binnendiameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impaleert en neemt zenuw-geïnduceerde spierpotentiëlen op
Borosilicaat filamenten, 1,5 mm buitendiameter, 1,17 mm binnendiameter	Sutter	BF150-117-15	Verlengd en gebruikt voor zuigelektrode
Micropipet-trekker	Sutter	P-97	Trekt en bereidt opname-elektroden
1200x1200 pixel, achterverlichte cMOS-camera	Photometrics	Prime 95b	Gevoelige camera die hoge resolutie, hoge snelheid beeldvorming mogelijk maakt
Lichtbron	Lumencor	Spectra X	Zorgt voor verlichting vanaf LEDs voor fluorescentieobservatie
Oneindig gecorrigeerde fluorescente water-immersieobjectieven, W.D. 2 mm	Nikon	CFI60	Biedt lange werkafstanden voor visualisatie van specimen
Vezeloptische verlichter met halogeenlamp	Sumita	LS-DWL-N	Zorgt voor verlichting voor brightfield-observatie
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projecteert 1 paar dual-wavelength beelden gescheiden door een dichroisch naar een enkele camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 en 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Maakt dubbele bandbeeldvorming mogelijk
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroische spiegel die lichtbundels scheidt om dual-wavelength beeldvorming mogelijk te maken
Beeldvorming data-acquisitiesysteem	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Maakt beeldvorming data-acquisitie mogelijk
Golflengte controle module	Nikon	MQS41220	Module voor beeldvorming data-acquisitie
Emissie splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module voor beeldvorming data-acquisitie
Beeldvorming data-analysesysteem	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Maakt analyse van fluorescentie-intensiteit en andere beeldvormingsgegevens mogelijk