Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58355

⸱

17 augustus 2018

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Samenvatting

De analyse van de cel of cel-ziekteverwekker interactie in vivo is een belangrijk instrument om te begrijpen de dynamiek van de immune reactie op de infectie. Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) kan de waarneming van cel interacties in diepe weefsel in levende dieren, terwijl het minimaliseren van de photobleaching gegenereerd tijdens Beeldacquisitie. Tot op heden zijn verschillende modellen voor 2P-GODT van lymfoïde en niet-lymfoïde organen beschreven. Beeldvorming van de ademhalingsorganen blijft echter een uitdaging als gevolg van de beweging die is gekoppeld aan de ademhaling cyclus van het dier.

Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren in vivo immuun cel interacties in de luchtpijp van muizen geïnfecteerd met influenza-virus met behulp van 2 P-GODT. Hiervoor ontwikkelden we een aangepaste imaging platform, waaronder de chirurgische blootstelling en intubatie van de luchtpijp, gevolgd door de overname van dynamische beelden van neutrofielen en dendritische cellen (DC) in de mucosal epitheel. Bovendien, gedetailleerde we de stappen die nodig zijn voor het uitvoeren van influenza intranasale infectie en stroom cytometrische analyse van immuuncellen in de luchtpijp. Ten slotte, geanalyseerd wij neutrofiele en beweeglijkheid van de DC, evenals hun interacties in de loop van een film. Dit protocol zorgt voor de generatie van stabiel en helder 4D beelden nodig zijn voor de beoordeling van cel-cel-interacties in de luchtpijp.

Inleiding

Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) is een effectieve techniek voor real-time imaging van cel naar cel interacties zoals die in hun natuurlijke omgeving1plaatsvinden. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het mogelijk de studie van cellulaire processen op een groter model diepte (500 µm tot 1 mm maakt) in vergelijking met andere traditionele beeldvormende technieken2. Op hetzelfde moment minimaliseert het gebruik van twee lage-energie fotonen gegenereerd door de twee-foton laser de foto-weefselschade meestal gekoppeld aan de afbeelding acquisitie proces2. Tijdens het laatste decennium is 2P-GODT toegepast om te bestuderen van de verschillende types van cel-cel-interacties in de verschillende disciplines-3,-4,5. Deze studies zijn met name relevant zijn voor het onderzoeken van immune cellen, die worden gekenmerkt door hun hoge dynamiek en de vorming van prominente contacten na de signalen gegenereerd door andere cellen en het milieu. 2P-GODT is ook toegepast om te bestuderen van de interacties tussen pathogene en host6. Inderdaad, het is eerder aangetoond dat sommige ziekteverwekkers veranderen als kunnen het type en de duur van de contacten tussen immune cellen, belemmeren, dientengevolge, de immuunrespons7.

De mucosa van de luchtwegen is de eerste site die de immuunrespons tegen lucht ziekteverwekkers zich gegenereerd8. Daarom, in vivo analyse van pathogene agens-gastheer interacties in dit weefsel is kritiek te begrijpen van de inleiding van de afweermechanismen van de host tijdens de infectie. 2P-GODT van de luchtwegen is echter uitdagende voornamelijk te wijten aan de artefacten geproduceerd door de ademhaling cyclus van het dier, dat het proces van Beeldacquisitie compromissen. Onlangs, verschillende chirurgische modellen zijn beschreven voor imaging lymfkliertest luchtpijp9,10,11,12 en longen13,14,15, 16. De tracheale 2P-GODT modellen vertegenwoordigen een uitstekende set-up om te visualiseren van de beginfase van de immune reactie in de bovenste luchtwegen, terwijl de Long-longblaasjes 2P-GODT modellen zijn meer geschikt voor het bestuderen van de late fase van infecties. De ontwikkelde longen modellen presenteren een beperking die zijn gekoppeld aan de aanwezigheid van lucht gevulde longblaasjes, waardoor de optische penetratie van de laser worden beperkt en maak de mucosal laag van de intrapulmonary airways ontoegankelijk voor in vivo imaging17 . De structuur van de luchtpijp, gevormd door een continue epitheel, vergemakkelijkt daarentegen Beeldacquisitie.

Hier presenteren we een protocol dat een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn bevat voor het uitvoeren van de besmetting van de griep, chirurgische voorbereiding van de dieren, en 2P-GODT van de luchtpijp. Daarnaast beschrijven we een specifieke experimentele opstelling voor de visualisatie van neutrofielen en dendritische cellen (DC), twee soorten van immuun cellen die een belangrijke rol als bemiddelaars van het afweermechanisme tegen influenza virus18,19 spelen . Ten slotte, beschrijven we een procedure voor het analyseren van neutrofiele-DC interacties. Deze contacten is gebleken moduleren DC activering en vervolgens bij de immuunrespons tegen ziekteverwekkers20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures waarbij muizen werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de Zwitserse federale Veterinair Bureau en de dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de lokale dierenarts autoriteiten.

1. influenza infecties van CD11c-YFP muizen

  1. Bioveiligheid
    Opmerking: De muis aangepast stam van influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) was gegroeid in bevruchte eieren, gezuiverd en getitreerd zoals eerder beschreven21. Al de stappen waarbij besmette dieren of biologische monsters werden uitgevoerd onder een bioveiligheid kabinet volgens bioveiligheidsniveau (BSL) 2 voorwaarden.
    1. Reinig de bioveiligheid kast met een 70% ethanol oplossing vóór en na de ingreep van de infectie.
    2. Gooi alle afvalstoffen geproduceerd tijdens deze procedure richtsnoeren voor goede die bioveiligheid (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Gooi afval in de autoclaaf opslaglocaties en verontreinigde vloeistoffen in plastic zakjes gevuld met 70% ethanol oplossing of medische ontsmettingsmiddel.
  2. Intranasale besmetting van de griep
    OPMERKING: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 op de achtergrond van een C57BL/6J werden gebruikt in deze studie. Muizen werden onderhouden in de specifieke pathogenen vrije faciliteit in het Institute for Research in biomedische ontwikkelingen.
    1. Plaats een maximum van 5 leeftijd en geslacht-zoekwoorden (zes tot acht weken oude) CD11c-YFP muizen per kooi. Wacht ten minste twee dagen voor muizen acclimatisatie aan huisvesting voordat de infectie-procedure.
    2. Ontdooi PR8 voorraad en maak de corresponderende verdunning met koude 1 x Dulbecco van fosfaat buffer saline zonder calciumchloride en magnesiumchloride (PBS bewerkt) te verkrijgen van een eindconcentratie van 200 plaque vormende eenheden (FPU) in 30 µL. Houd virus verdunning op het ijs tijdens de hele procedure.
      Opmerking: titratie van elke batch van influenzavirus voorafgaand aan het gebruik ervan wordt aanbevolen om de dosis van een precieze infectie.
    3. Injecteren van een dosis van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) intraperitoneally (i.p.) met behulp van een 26 G naald 1 mL spuit.
    4. Wacht totdat de muis is volledig narcose (volledig verlies van restarmen zowel pedaal terugtrekking reflex). Diepe anesthesie is noodzakelijk voor een optimale infectie, omdat niet-volledige narcose muizen zal slikken of royement van het virus entmateriaal, leiden tot variaties in de dosis van de infectie.
    5. Plaats de narcose muis in een liggende positie. Verzamelen 15 µL van virus entmateriaal. Plaats het uiteinde van de pipet dicht bij de muis linker neusgat en afzien van het virale entmateriaal druppel voor druppel. Zoals druppels moeten worden ingeademd, ze niet Pipetteer rechtstreeks in de holte van de neus.
    6. 2 – 5 min wachten en plaats het uiteinde van de pipet met de resterende 15 µL van virus entmateriaal in het rechter neusgat.
      Opmerking: Om te voorkomen dat verstikking, afzien klein druppels in ongeveer 20 s intervallen.
    7. Controleer dat de muis goed ademt en plaatst u deze in een kooi in de laterale decubitus. Toezicht op de ademhaling en anesthesie herstel muis (ongeveer 60 min na inductie).
      Opmerking: Het is mogelijk om te infecteren meer dan 1 muis op hetzelfde moment. In dit geval, beheren van virale entmateriaal in het linker neusgat van alle muizen in een reeks, 2-5 min wachten en vervolgens beheren van het virus in het rechter neusgat. Om te voorkomen dat de variabiliteit tussen personen, niet meer dan 3 muizen te infecteren op hetzelfde moment.
    8. Diergezondheid status en gewicht verlies dagelijks controleren.
    9. Euthanaseren muizen volgens het humane eindpunt bepaald door de autoriteit richtsnoeren. De euthanasie-methode moet worden goedgekeurd door de autoriteiten van dierproeven en lokale ethische regels moet respecteren. Na twee-foton experimenten, euthanaseren muizen door toediening van een overdosis van ketamine/xylazine gevolgd door cervicale dislocatie. In alle andere experimenten, CO2 inademing als een methode voor euthanasie te gebruiken.
      Opmerking: Voor het meten van de virale titers van besmette luchtpijp, 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) assay of real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) test kan worden uitgevoerd als eerder beschreven23.
  3. Evaluatie van neutrofiele aanwerving in de luchtpijp door stroom cytometry
    Opmerking: Dit deel van het protocol is optioneel. Het programma wil evalueren neutrofiele werving in tracheale mucosa na besmetting van de griep.
    1. Besmette en niet-geïnfecteerde muizen op dag 3 na infectie (p.i.) euthanaseren CO2 inademing.
      Opmerking: Tracheale om schade te voorkomen, Vermijd het gebruik van cervicale dislocatie naar euthanaseren van dieren. Perfusie van euthanized muizen is bovendien aan te raden om te voorkomen dat besmetting van bloed neutrofiele granulocyten.
    2. Spray de muis hals met 70% ethanol oplossing en het uitvoeren van een insnijding van de huid met behulp van chirurgische schaar uit de borst aan de kin.
    3. Scheid de speekselklieren met pincet en bloot in de luchtpijp.
    4. Het ontleden van de spieren rond de luchtpijp met behulp van Tang en schaar.
      Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd zorgvuldig omdat luchtpijp kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens de procedure.
    5. Houd de luchtpijp met een tang en zorgvuldig het loskoppelen van de slokdarm door dissectie.
    6. Houd het intrathoracale deel van de luchtpijp met een tang en maak een incisie aan het begin van de bronchiale boom. Vervolgens het loskoppelen van de luchtpijp van het strottenhoofd en verwijder voorzichtig alle spieren links.
    7. Plaats het orgel in een tube van 1,5 mL met RPMI 1640 + HEPES medium (RPMI) op het ijs.
    8. Het enzym mengsel voorbereiden luchtpijp spijsvertering, met 0,26 eenheden/mL collagenase (I en II) en 0,2 mg/mL DNase ik in RPMI.
    9. Plaats de ontleed luchtpijp in een 6-well plaat met 1 mL van het mengsel van de enzymen.
    10. Snijd het orgel in kleine stukjes met de hulp van de Tang en schaar. Houd de plaat op ijs tijdens deze stap.
    11. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Gedurende deze tijd, schud de plaat elke 15 min.
    12. Stop de enzym vertering door toevoeging van 1 mL FACS wassen buffer (2 mM EDTA en 2% warmte-geïnactiveerd filter-gesteriliseerde foetale runderserum (FBS)) in PBS.
    13. Resuspendeer de oplossing met een 1 mL pipet om te helpen om te distantiëren van de gedeeltelijk onverteerd stukjes weefsel.
    14. Breng de oplossing aan een ander goed door het passeren van de inhoud door een 40 µm zeef. Vervolgens voorzichtig smash de resterende stukken van het orgel gevangen op de top van de zeef met behulp van een zuiger 2 mL spuit.
      Opmerking: Smashing luchtpijp gedeeltelijk onverteerd stukken over de zeef is een cruciale stap voor een optimale aantal cellen tijdens flow cytometrische analyse.
    15. Wash de put en de zeef met FACS wassen spoel de suspensie in een tube van 5 mL buffer gehouden op ijs.
    16. Centrifugeer de buizen bij 166 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS wassen buffer.
    17. Ga verder met het oppervlak vlekken van het antilichaam voor stroom cytometry. Kort, blokkeren Fc receptoren van de geïsoleerde cellen met behulp van een antilichaam tegen CD16/32, gevolgd door het oppervlak vlekken. Om het correct identificeren neutrofielen, de stroom cytometry paneel de volgende antistoffen moet bevatten: αLy6G, αCD11b, αCD45, evenals een levensvatbaarheid kleurstof uit te sluiten van de dode cellen.
    18. De gehele inhoud van de monsters worden uitgevoerd op een stroom cytometer en analyseren van gegevens.
      1. Om een optimale nummer van immune cellen, de eencellige schorsing met een snelheid die niet hoger dan 3000 events/s worden uitgevoerd. Dit vermindert het aantal gebeurtenissen uitgesloten tijdens de overname. Met behulp van dit protocol, moet het kunnen verkrijgen van 1 tot 2 miljoen van cellen per luchtpijp.

2. isolatie en injectie van neutrofiele granulocyten

Opmerking: In deze procedure, B6.129 (ICR)-GS (CAG-ECFP) CK6Nagy/J muizen (CK6-ECFP) waren gebruikte24. Deze dieren express GVB in alle celtypes onder de menselijke β-actine promotor. Anderzijds is het ook mogelijk met C57BL/6J muizen te isoleren van de cellen en vlek ze volgens het protocol beschreven in stap 2.6. De zuivering en manipulatie van neutrofielen kunnen het verhogen van hun status van de activering, potentieel veranderen hun migratiestromen en functionele eigenschappen.

  1. Het dier euthanaseren CO2 inademing.
  2. Verwijder zowel dijbeen en zijn verbeend en ze voorzichtig schoon met pincet.
  3. Knip bot epifyses en spoelen van het beenmerg met behulp van een spuit van 1 mL gevuld met steriel koude PBS, in een tube van 50 mL, gehouden op het ijs.
  4. Resuspendeer de cellen met een naald 18 G en filteren van de celsuspensie met een zeef 40 μm. Een keer wassen met PBS bij 110 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver koude PBS.
  5. 100% verdund Percoll 9:1 in 10 x PBS en kleurovergang oplossingen van percoll 72%, 64% en 52% met behulp van 1 x PBS te bereiden. Zorgvuldig laag 2 mL van elk van de drie verlopen in een tube van 15 mL, een vanaf het meest geconcentreerd.
    1. Voeg voorzichtig 2 mL celsuspensie van het beenmerg bovenop de hellingen en centrifuge bij 1100 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) zonder versnelling en rem.
  6. Zorgvuldig verwijderen van de band op het raakvlak tussen de 64 tot 72% en een keer wassen bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C met koude PBS. Resuspendeer de cellen in een volume van 100 μl van PBS en houd ze op het ijs. De zuiverheid van de neutrofielen verwachting hoger dan 90%.
  7. Optioneel label neutrofiele granulocyten met een cel proliferatie kit met behulp van de fabrikant-protocol. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, voeg de kleurstof toe aan de celsuspensie om een eindconcentratie van 10 μM in een volume van 1 mL en wassen (166 x g, 5 min).
  8. Concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer schatten en intraveneus 5 x 106 cellen in een maximumvolume van 100 μl in de eerder geïnfecteerd CD11c-YFP+ muizen met behulp van een 26 G naald 1 mL spuit, 12 h voor imaging te injecteren.

3. voorbereiding van de muis voor Imaging

  1. Anesthesie
    1. Anesthetize besmette CD11c-YFP+ muizen op dag 3 p.i. volgens stap 1.2.3.
    2. Zodra muizen zijn diep verdoofd, bereiden een katheter voor anesthesie opnieuw doseren.
      1. Verwijder een 30 G naald uit een spuit met pincet.
      2. Plaats de naald op een stuk van 20 cm van PE-10 medische Siliconen slang.
      3. Invoegen van een 30 G naald-spuit gevuld met ketamine/xylazine mengsel aan de andere kant van de buis.
      4. Verwijder de lucht binnenkant van de buis.
    3. Bereiden een 20 G katheter aangesloten op een buis van een insufflating machine van zuurstof te handhaven van geautomatiseerde ventilatie (figuur 1Aik). Zet deze dan op een verhouding van de adem van 130 beats per minuut (b.p.m.) met een ademhalingsvolume van 0,2 mL met behulp van een 100% zuurstof gasvoorziening.
  2. De muis voor te bereiden op de operatie
    1. Houd de muis op een specifieke aangepaste chirurgische bord (figuur 1A-ii-iii) over een verwarmde plaat of een verwarmde chirurgische bankje ingesteld bij 37 ° C voor alle tijd van de ingreep.
    2. Scheren van het haar vanaf de nek van de muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat en een ontharende room (figuur 1Bik).
    3. Plaatst u de muisaanwijzer boven de plastic muis positionele (figuur 1Aii-a), de dierlijke hoofd buiten de positionele te houden (figuur 1Bii) maken een hoek die de intubatie van de luchtpijp vergemakkelijkt.
    4. Herstellen van de voorpoten, de poten en de staart met de chirurgische tape, Bevochtig muis ogen met een gel vitamine A verrijkt en Desinfecteer de muis nek (figuur 1Bii).
  3. Chirurgie
    1. Voorbereiden van goed gesteriliseerde met autoclaaf items, namelijk, schaar, microchirurgische schaar en pincet.
    2. Een kleine incisie op de lange mediale as van de nek, ongeveer 1 cm lang, in het midden gebied tussen de bovenste borst en de lijn door het onderste punt van de onderkaak (figuur 1Biii) uitvoeren.
    3. Lateraal verplaatst de patches van de huid en de speekselklieren en visualiseren van de luchtpijp, vallen de spieren. Vervolgens ontleden de tracheale spieren zorgvuldig gebruik van de verlostang (figuur 1Biii).
    4. Intubate van de muis met een katheter en kunstmatige ventilatie (figuur 1Biv) beginnen.
      Opmerking: De katheter is samengesteld uit een externe van plastic vaneengaan, die de tracheale mucosa en een innerlijke ijzer naald beschermt. De aanwezigheid van de naald biedt de ideale oplossing uit te breiden en de luchtpijp te stabiliseren en te reguleren zijn expositie. Kunstmatige ventilatie door de katheter garandeert een goede ademhaling van de muis.
    5. Onmiddellijk beginnen de kunstmatige ventilatie aan monitor muis ademhaling.
    6. Het vaststellen van de hoogte van de katheter en oriëntatie met behulp van een chirurgische haak (figuur 1Bv) verbonden met de specifieke staaf op de chirurgische bord (figuur 1Aii-b). Bloot in de luchtpijp op dezelfde hoogte van de kin.
    7. Omcirkelen de luchtpijp met vaseline en bedek het met een paar druppels van voorverwarmde PBS te garanderen van de goede hydratatie naar het orgel (figuur 1Bvi).
    8. Monteer het dekglaasje aan op de top van de voorbereiding. Lijm voor deze stap, een dekglaasje aan op een metalen houder (figuur 1Bvii), die zal worden geschroefd aan de XYZ-vertaler (figuur 1Aii-c). Pas de XYZ-vertaler om te plaatsen het dekglaasje aan op de top van de chirurgische voorbereiding.
    9. Plaatsen van de katheter voor het beheer van de narcose intraperitoneally (figuur 1Bviii).
    10. Injecteren van 50% van de begindosis van ketamine/xylazine mengsel elke 30 min.
      Nota: Opnieuw doseren van 50% tot 25% van het oorspronkelijke mengsel van ketamine/xylazine is een veilige en geldige alternatieve25. Echter gebruiken aangezien dit protocol terminal is en een strikte immobilisatie van het dier vereist tijdens de hele procedure is, hogere doseringen te handhaven van een diep chirurgische vliegtuig van de verdoving.

4. in Vivo Time-lapse Imaging

Opmerking: Beeldacquisitie werd uitgevoerd met een rechtop twee-foton microscoop, uitgerust met twee Ti:Sa lasers, temperatuurgevoelig incubatie-kamer en een 25 X / nb 1.1 water onderdompeling doelstelling. De photomultipliers (PMT) gebruikt voor Beeldacquisitie waren ofwel hybride detectoren of hoge gevoeligheid GaAsP.

  1. Plaats de chirurgische bord met de narcose muis binnen de Microscoop incubatie kamer (pre-water verwarmd bij 37 – 38 ° C) en voeg een druppel water op het dekglaasje aan.
  2. Center en zoeken de focus op de tracheale weefsel.
  3. Instellen van de scan frequentie op 800 Hz, met 520 x 520 pixels, een beeldveld van 440 x 440 μm2 en lijn gemiddelde 1.
    1. Melodie Ti:Sa laser 830 nm tot tweede-harmonische generatie (SHG) prikkelen van collageen, met een indicatieve macht aan de bron van 150 mW. De tweede Ti:Sa laser op 920 Tune nm met 94 mW aan de bron te wekken zowel GVB en YFP.
    2. Set-up het 3D en timelapse overname modus met gelijktijdige excitatie
      Opmerking: Houd de laser bevoegdheden zo laag mogelijk om photobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren.
  4. Record fluorescentie met behulp van twee kanalen in niet-descanned modus, met een master dichroïde spiegel op 560 nm. In het set-up gebruikt in dit protocol, een tweede dichroïde spiegel splitsen het signaal op 495 nm te scheiden kanaal 1 (emissie filter 475/50) van kanaal 2 (emissie filter 525/50) (figuur 2A). Deze configuratie verzamelt SHG licht van collageen in het eerste kanaal, terwijl GVB emissie wordt verzameld in beide kanalen 1 en 2 en YFP wordt verzameld alleen in kanaal 2.
  5. Definieer een 50 micrometer langs de Z-as, met een stap grootte van 3 μm (voxel grootte 0,86 μm x 3 μm). Record beelden elke 30 s voor een totale duur van 30 min.
  6. Indien gewenst, verwerven meerdere regio's. Voordat u meer overnames, vitale functies controleren en terug verdoving via de katheter indien nodig (zie stap 3.3.10).
  7. Aan het eind van het proces van beeldvorming, euthanaseren de muis door ketamine/xylazine overdosis gevolgd door cervicale dislocatie.

5. beeld verwerking en kwantitatieve analyse van de beweeglijkheid van de neutrofiele-DC en interactie

Opmerking: In dit protocol, een gespecialiseerde imagingsoftware werd gebruikt voor het analyseren van de gegevens van de microscopie.

  1. Nadat 4D Beeldacquisitie is voltooid, overdracht van de bestanden (data en metadata) op een werkstation met voldoende rekenkracht (voorgesteld minimale systeemvereisten: 32 GB RAM, snelle Solid-state-state-drives, recente CPU, dedicated GPU gebaseerd op een massaal parallelle architectuur).
  2. Open de bestanden in de beeldbewerkingssoftware.
  3. Afspelen van de video en ervoor te zorgen dat de cellen van belang duidelijk zichtbaar zijn en dat de beeldvorming artefacten afwezig zijn.
    Opmerking: te dien einde verifiëren dat zowel de beweging van het monster en de helderheid variatie voldoende zijn beperkt. Inderdaad, deze uitdagingen voor de automatische analyse26vertegenwoordigen. Als de verplaatsing van het monster tussen aangrenzende frames overdreven is, een drift correctie methode, met bijvoorbeeld het SHG-kanaal als een vaste verwijzing wilt toepassen. Hierdoor kan beter maatregel het verkeer van de cellen in plaats van de beweging van het monster. Bovendien, in aanwezigheid van lichte achtergrond of puin, Snoei de gereconstrueerde oppervlakken gebruik volume als een parameter van de selectie.
  4. Het genereren van een specifiek kanaal co lokalisatie voor GVB+ cellen, om te scheiden van het signaal tussen het GVB en het collageen (SHG). Te dien einde duiden een gating veelhoek (figuur 2Bik) die alleen de voxels hebben van een positieve intensiteit zowel in het groene kanaal en in het blauwe kanaal selecteert.
    Opmerking: Deze procedure kan variëren naargelang de filter set van de Microscoop en de kleuring van de cellen. Het kan worden bereikt door het selecteren van alleen voxels met voldoende intensiteit in zowel de groene en de blauwe kanalen. Onder de beschikbare instrumenten, kan de "coloc"-functionaliteit worden gebruikt voor het automatisch berekenen van het kanaal van de colocalization gebaseerd op intensiteit drempelmethode. Methoden op basis van machinaal leren kunnen daarnaast worden gebruikt voor deze stap onder supervisie van een deskundige27.
  5. Detecteren en bijhouden van GVB+ cellen, met behulp van automatische oppervlakte wederopbouw en bijhouden (oppervlakte gereedschap) via de juiste co lokalisatie-kanaal.
    Opmerking: Handmatige curatie van uiteindelijke tracking fouten en uitsluiting van tracks met een duur die korter is dan een opgegeven drempelwaarde (dat wil zeggen, 150 s) mogelijk.
  6. Het genereren van een specifiek kanaal co lokalisatie voor CD11c-YFP+ cellen, om te scheiden van de signalen van het GVB en YFP. Te dien einde duiden een gating veelhoek (figuur 2Bii) die alleen de voxels hebben een positieve intensiteit in het groene kanaal, maar een lage intensiteit in het blauwe kanaal selecteert.
    Opmerking: vertegenwoordiger microfoto tonen de signalen van kanaal 1, kanaal 2 de co lokalisatie kanaal voor GVB, het kanaal van de co lokalisatie voor YFP en de combinatie van alle kanalen vindt u in figuur 2Biii.
  7. Reconstrueren van het oppervlak van de cellen van de CD11c-YFP+ en bijhouden van hun standpunt na verloop van tijd (oppervlakte gereedschap).
    Opmerking: Handmatige correctie van fouten van de uiteindelijke bijhouden is niet vereist voor deze stap. Inderdaad, als gevolg van de complexe spatio-temporele dynamiek van DC, wederopbouw van hun precieze oppervlak van 2 P-GODT gegevens is een uitdagende taak die niet kan worden bereikt met de segmentering van de beschikbare software. Onder de redenen waardoor deze taak uitdagende, toestaan dunne uitsteeksels en variaties van de helderheid niet voor het gebruik van bepaalde beeldverwerking technieken, zoals het vloeiend maken van filters of statische drempelmethode. Bovendien, in een netwerk van DC is het moeilijk te scheiden van enige cellen alleen gebaseerd op hun verschijning in 2P-GODT gegevens. Voor deze redenen, in plaats van een nauwkeurige segmentatie probeert door softwareparameters tuning, stellen wij voor om te reconstrueren van niet-nauwkeurige oppervlakken van DC. Dan, omgaan met de mogelijke fouten door middel van robuuste statistieken zoals beschreven in 5,8.
  8. Cel migratie te meten.
    1. Exporteer de klassieke migratie maatregelen voor zowel GVB+ en CD11c-YFP+ cellen. Onder deze geeft de "track snelheid betekenen" de gemiddelde trekkende snelheid van de cellen terwijl de "track rechtheid" de directionaliteit van de cellen aangeeft. Deze maatregelen kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet-bestand van de beeldbewerkingssoftware.
    2. In de geëxporteerde spreadsheet-bestanden, het berekenen van de "gecorrigeerde track rechtheid" (ook gecorrigeerde opsluiting verhouding genoemd) voor zowel GVB+ en CD11c-YFP+ cellen, die wordt gedefinieerd als "track rechtheid" vermenigvuldigd met de vierkantswortel van "track duur" gedeeld door de vierkantswortel van de video duur. Deze maatregel is robuuster dan 'rechtheid bijhouden' in het bijzijn van korte28, bijvoorbeeld afkomstig van de tracking fouten bijgehouden.
      Opmerking: alleen video's van dezelfde lengte kunnen vergeleken worden met deze maatregel.
  9. Maatregel cel interactie.
    1. Definieer een contact tussen een GVB+ -cel en de cel van een CD11c-YFP+ als hun afstand (dichtstbijzijnde voxels) minder of gelijk dan een drempel (dat wil zeggen, 2 μm is).
      Opmerking: Deze drempel moeten voldoende streng zijn om op te sporen van een contactpersoon alleen wanneer cellen in de nabijheid. Echter, wij raden te houden deze drempel groter is dan 0, idealiter N keer groter is dan de straal voxel (N > 2), omdat de grens vloeiend maken de wederopbouw van de cellen kleiner is dan de werkelijke celgrootte kunt maken.
    2. Tellen van het aantal en de duur van contacten tussen GVB+ en CD11c-YFP+ cellen. In de denkbaar software kan dit bijvoorbeeld gebeuren door het uitvoeren van een "kussen en uitgevoerd" plug in. Deze maatregelen kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet-bestand uit het tabblad Statistieken.
  10. De eerder berekende maatregelen in een statistische software importeren, genereren de percelen en statistische tests uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol om te studeren in vivo de beweeglijkheid en de interacties tussen neutrofielen en DC tijdens de besmetting van de griep in lymfkliertest luchtpijp (figuur 3A). Voor dit doel, we geïsoleerd GVB+ neutrofiele granulocyten (92% zuiverheid; Figuur 3B) vanaf CK6-ECFP overgedragen muizen en we adoptively hen in een CD11c-YFP-muis geïnfecteerd met influenza. Na dat ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk presenteert een gedetailleerd protocol voor de generatie van 4D beelden tonen van de migratie van adoptively overgedragen neutrofielen en hun interacties met DC tijdens een besmetting van de griep in de luchtpijp van de muis. De beschreven 2P-GODT-model zullen relevant zijn voor de studie van immuun cel dynamiek tijdens een infectie in de luchtwegen.

Verschillende modellen gebaseerd op de visualisatie van de dynamiek van de cel in de luchtwegen hebben onlangs ontwikkelde

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Zwitserse nationale Stichting (SNF) subsidies (176124, 145038 en 148183), de Europese Commissie Marie Curie reïntegratietoelage (612742) en de SystemsX.ch voor een subsidie voor de D.U.P. (2013/124).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gigasept instru AFSchülke & Mayr GmbH4% solution
CD11c-YFP miceJackson Laboratories008829muizen werden in eigen beheer gefokt
CK6-ECFP miceJackson Laboratories004218muizen werden in eigen beheer gefokt
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline gemodificeerd zonder Calcium Chloride en Magnesium ChlorideSigmaD8537-500ML
10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline gemodificeerd zonder Calcium Chloride en Magnesium ChlorideSigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1LBewaar bij 4°C
Ketamin LabatecLabatec Pharma7680632310024Bewaar bij RT, bewaar bij 4 °C wanneer in oplossing van ket/xyl mengsel
Rompun 2% (Xylazin)Bayer6293841.00.00Bewaar bij RT, bewaar bij 4 °C wanneer in oplossing van ket/xyl mengsel
26 G 1 mL Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak305501
30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin SpuitjesBD324826
Falcon 40 µm Cell StrainerCorning352340
2 mL SpuitjesBD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G naaldenBD304622
Introcan Safety 20 G (katheter)Braun4251652.01
6 Well Cell Culture ClusterCostar3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-018Bewaar bij 4°C
Liberase TL Research GradeRoche5401020001Bewaar bij -20 °C / collagenase (I en II) mengsel
DNAse IAmresco (VWR)0649-50KUBewaar bij -20 °C
CellTrace Violet kleurstofThermoFisher ScientificC34557Bewaar bij -20 °C
EDTASigmaEDS-500G
Fetal Bovine SerumGibco10270-106Bewaar bij -20 °C
PE-10 Micro Medical Tubing2Biological Instruments SNC#BB31695-PE/1
Surgical Plastic TapeM Plast
ViscotearsBausch & LombBewaar bij RT
PlasticineOhropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 mm RoundWarner Instruments64-0733
SomnoSuite Draagbaar Dier Anesthesie SysteemKent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (gasvormige anesthesie en verwarmingsbank)Tem Sega
SURGICAL BOARDUniversity of Bern
TrimScope II Twee-foton microscoopLaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasersCoherent Inc.
25X NA 1.05 water immersie objectiefOlympusXLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubatiekamer en temperatuurregelaarLife imaging Services
Imaris 9.1.0BitplaneImaging software
GraphPad Prism 7GraphPadStatistische software

Referenties

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Beeldvorming van het tracheaslijmvliesinteractie tussen neutrofielen en dendritische cellenflowcytometrie analysechirurgische blootstelling van de tracheaintranasale influenzainfectieisolatie van neutrofielen uit het beenmergPercoll dichtheidsgradi ntanalyse van de mobiliteit van immuuncellen
Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.