Visuele klassieke conditionering in hout mieren

Summary

Presenteren we een protocol voor de klassieke conditionering van wervelende mieren waarmee onderzoekers te bestuderen van visueel leren en geheugen vorming op een niveau van analyse niet mogelijk met vrij bewegende personen.

Abstract

Verschillende soorten insecten geworden modelsystemen voor het bestuderen van de vorming van het leren en geheugen. Hoewel vele studies gericht op vrij bewegende dieren, studies uitvoering van klassieke conditionering paradigma's met wervelende insecten zijn belangrijk voor het onderzoek naar de exacte signalen die individuen leren en de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan leren en Geheugenvorming. Hier presenteren we een protocol voor het oproepen van visueel associative leren in hout mieren door middel van klassieke conditionering. In dit paradigma, zijn mieren benut en gepresenteerd met een visuele cue (een blauw karton), de voorwaardelijke prikkel (CS), gecombineerd met een appetitive suiker beloning, de onvoorwaardelijke stimulus (VS). Mieren uitvoeren een Maxilla-Labium extensie Reflex (MaLER), de onvoorwaardelijke reactie (UR), die kan worden gebruikt als een uitlezing voor leren. Opleiding bestaat uit 10 proeven, gescheiden door een 5 minuten durende intertrial interval (ITI). Mieren zijn ook getest op geheugen retentie 10 minuten of 1 uur na de training. Dit protocol heeft de potentie om onderzoekers te analyseren, in een nauwkeurige en gecontroleerde manier, de details van visuele Geheugenvorming en de neurale basis van leren en geheugen vorming in hout mieren.

Introduction

Insecten zijn uitvoerig gebruikt als model voor het bestuderen van leren en geheugen vorming¹. Een bijzonder succesvol ader van onderzoek omvat het gebruik van klassieke conditionering van ingetogen dieren, waardoor nauwkeurige controle over de signalen worden geleerd en vergunningen van onderzoekers te onderzoeken van de neurale mechanismen die onderbouwing van leren en geheugen. De meerderheid van de studies hebben gericht op de appetitive klassieke conditionering van de honingbij werknemers, Apis mellifera. De honingbij werknemers zijn opgeleid om een CS koppelen aan een Amerikaanse die de UR oproept. In dit paradigma, oorspronkelijk ontwikkeld door Takeda² en Bitterman et al. ³de UR is de Proboscis extensie Reflex (PER), de VS is suiker en de CS is een geur. Bijen leer van de associatie tussen het CS en de VS en een lange-termijn geheugen van deze vereniging kunnen vormen.

De oorspronkelijke paradigma met behulp van de PER als de UR is gebruikt om het ontrafelen van de zenuwbanen onderbouwing olfactorische leren in bijen⁴. Gewijzigd op verschillende manieren om te leren van verschillende sensorische stimuli, met inbegrip van visuele stimuli^5,6,7, op te nemen van de aversieve leren met behulp van de onderdrukking van de PER⁸ of de extensie van Sting testen Reflex (SER)⁹ als de UR, en om te leren in andere soorten, zoals hommels¹⁰ en fruitvliegjes¹¹testen. Hoewel Geheugenvorming met verschillende modaliteiten is onderzocht door middel van klassieke conditionering, visueel leren is nog steeds moeilijk te observeren met behulp van deze aanpak, zelfs bij soorten die tonen een hoge mate van visuele leervermogen tijdens het foerageren, zoals honingbijen.

Recente studies hebben een soortgelijke benadering toegepast op insecten die niet een proboscis, zoals sprinkhanen, die vervullen de Palp Opening reactie (POR)^{12 hoeft}, en mieren, die het uitvoeren van de Maxilla-Labium extensie Reflex (MaLER)¹³. Dit is reeds gebleken dat fase-specifieke leren vaardigheden die overeenkomen met de fase-specifieke voeding strategieën van de twee verschillende woestijnsprinkhaan fenotypen, het kudde-instinct en de solitarious vormen, opnieuw de tenuitvoerlegging van de gedachte dat Geheugenvorming moet overeenkomen met ecologische behoeften¹⁴. Bovendien, studies over olfactorische leren in mieren heeft aangetoond gelijkenissen tussen mieren en honingbijen in Geheugenvorming en retentie, met lange-termijn geheugen bewaren, 72 uur na de training, afhankelijk zijn van eiwit synthese¹⁵.

Deze aanpassingen van het oorspronkelijke paradigma hadden leren en geheugen vorming worden bestudeerd met veel modaliteiten en in verschillende soorten van model. Dit is essentieel voor het identificeren van mechanismen voor geheugen vorming common voor de insecten, maar ook voor het identificeren van de verschillen die overeenkomen met de bijzondere ecologie van het leren en geheugen in verschillende soorten. Het belangrijkste doel van het protocol die we hier beschrijven is bedoeld als een manier om uit te voeren van de experimenten van de klassieke conditionering met behulp van een visuele voorwaardelijke stimuli met een wijd bestudeerde ant-soorten, Formica rufa. Het wordt uitgegeven door onze studie van visueel leren in hout mieren¹⁶, die is ook een aanpassing van visuele klassieke conditionering paradigma's.

Protocol

1. behoud van de Formica rufa kolonies

Opmerking: De houten mier (Formica rufa, L.) koloniën gebruikt voor deze studie werden verzameld uit de Ashdown Forest, Sussex, UK (N 51 4.680, E 0 1.800). Binnen het Verenigd Koninkrijk, moeten F. rufa kolonies worden verzameld tussen juli en augustus. Een goed deel van het nest verwijderd moet worden, met inbegrip van verscheidene honderden werknemers en brood, om ervoor te zorgen de kolonie is opgelopen en actief voor langere tijd (tot één jaar). Toestemming moet worden gevraagd van de betrokken instanties vóór nest verwijderen.

1. Huis van de houten mier kolonies in een breed vak (ongeveer 135 x 70 cm x 35 cm) met muren bedekt met polytetrafluorethyleen (PTFE) hars (bvFluon) om te voorkomen dat mieren ontsnappen, bij 21 ° C, onder een licht: 12 van de 12-h-h donker cyclus.
   1. Sacharose (333 g/L) en water geven door de mieren, met behulp van water dispensers. Om ervoor te zorgen dat de mieren dieet is rijk aan eiwitten, voeden de kolonie met bevroren krekels 2 x per week. Het nest spuiten met water, wordt elke dag te houden vochtig.
   2. Ter verbetering van de hygiënische omstandigheden van de kolonie, het toevoegen van dennen hars wanneer dat nodig is; Pine hars vermindert parasitism in hout mier kolonies¹⁷. Plaats een kleine container (ongeveer 15 cm in diameter en 5 cm diep) binnen het nest zodat mieren dode kolonie-leden naar het wegschrijven kunnen.
2. Het houden van mieren onder de bovengenoemde voorwaarden voor ten minste 2 weken na het verzamelen voordat u probeert alle experimenten. Verwijder de sacharose uit het nest om te verhongeren de mieren 2 d voorafgaand aan de experimenten, waardoor hun motivatie.

2. te selecteren en het aanwenden van mieren

Opmerking: Voor het aanwenden van mieren, een op maat gemaakte houder nodig. Dit figuur kan worden geconstrueerd met behulp van modellering klei en een karton met een snee openen aan het horizontaal. De bovenkant van het karton moet gedeeltelijk worden bedekt met wax, insect pins worden gehecht tijdens de vaststelling van het toelaat. Voorzichtige behandeling is noodzakelijk voor elke stap van dit protocol (met inbegrip van onderhoud, transport en experiment), maar in het bijzonder wanneer het aanwenden van mieren, om te vermijden dat ze tot hoge stressniveaus voorafgaand aan de opleiding.

1. Schakel de mieren die gemotiveerd zijn om te eten, plaatst u een dia met een daling van sacharose (200 g/L) in een klein vakje (ongeveer 14 x 8 cm x 5 cm) met muren bedekt met PTF hars ter voorkoming van ontsnapping. Selecteer geen mieren die hout of dood mieren uit het nest dragen. In plaats daarvan nemen mieren die van de muren van het nest kruipen, omdat deze meer kans om te worden foragers probeert te verlaten het nest om eten te zoeken.
2. Plaats elke mier in het vak en wachten om te zien als het voedt op de daling van de sucrose. Als dat zo is, deze overbrengen onmiddellijk naar een andere lege vak om te voorkomen dat verzadiging.
3. Elke mier overbrengen in een aparte buis. Elke buis in de vriezer voor 1-2 min of in crushed ijs voor maximaal 5 min, plaatsen om te immobiliseren van de mier.
4. Plaats de geïmmobiliseerdet mier in de houder, via de cut op het karton, door het gewricht tussen de kop en de thorax. Zorgen dat de antennes blijven aan de zijkant van het hoofd, met behulp van insect pins ingebed in de wax laag op de top van het karton.
5. Gebruik een op maat gemaakte verwarmingselement Wax het puntje van een insect pin aan het hoofd van de mier, parallel aan het karton. Tijdens deze procedure, ken niet touch de antennes met het verwarmingselement draad om te voorkomen dat schade aan hen.
6. Nadat de was droogt, verwijdert u het insect spelden die houden van de antennes en verwijder voorzichtig de mier van de houder.
7. Repareren van het insect pins houden de mier in een modellering klei cilinder en moeilijke situatie een op maat gemaakte kunststof houder eronder, ervoor te zorgen de mier onderhoudt een typische staande houding, en dat het hele lichaam is vrij om te bewegen met uitzondering van het hoofd.
8. Houd de wervelende mieren in duisternis voor ten minste 2 uur voorafgaand aan de opleiding.

3. opleiding en testen

1. Set-up en geconditioneerde stimulus unconditioned stimulus
   1. Uitvoering van de experimenten in een witte acryl box (50 x 50 x 50 cm), open aan de voorkant om toegang te verschaffen voor de experimentator. Opnemen van de mier gedrag met een camera.
      1. Plaats de camera met een macrolens direct boven de mier, door een gat in de bovenkant van het vak.
      2. Verklein vreemde visuele aanknopingspunten en door de kamer te houden in de duisternis met uitzondering van een lichtbron rechtstreeks naar de top van de acryl box (twee 26-W licht).
   2. Gebruiken als een visuele cue (de CS) een koboltblauw (spectrum in Figuur S1) kartonnen rechthoek (60 x 45 mm) verbonden in het midden met een naald, verbonden met een injectiespuit (2 mL) waarmee de VS (sacharose 200 g/L) handmatig wordt geleverd aan de mier (figuur 1A en 1B ).
      Nota: De sacharoseoplossing kan worden gemaakt met een witte suiker, mits deze geen kleur en geur wanneer opgelost in water.
   3. Twee soorten opleiding parallel, paren en ongepaarde (Zie de uitleg hieronder), in een willekeurige volgorde te verrichten.
      Opmerking: In deze studie, we hebben niet aandacht besteden aan de aard van de visuele cue. Alleen de associatie tussen de cue en de beloning werden in aanmerking genomen. Kleur en vorm zijn niet getest, en het is waarschijnlijk dat een CS met andere functies vergelijkbare resultaten zou geven. Toch was de blauwe kleur pakte omdat mieren uit het hetzelfde geslacht is gebleken te zijn gevoelig voor golflengtes die betrekking hebben op de blauwe kleur¹⁸.
2. Gepaarde opleiding
   Opmerking: In gepaarde opleiding, het CS en de VS worden gepresenteerd in elk proces, die zijn gekoppeld aan elkaar (Figuur 1 c).
   1. Start de opname van de mieren 10 s vóór de presentatie van de CS om ervoor te zorgen dat mieren niet spontaan MaLER voorafgaand aan de indiening presteren. Als mieren MaLER tijdens deze periode uitvoert, uitstel van het proces voor een paar seconden. Als een mier toont dit gedrag voortdurend, het uitsluiten van de analyse.
   2. Verplaatsen van de spuit + CS tegenover de mier voor ~ 10 s, met het puntje van de naald gehouden tussen de ant's gezicht en een maximum van 5 mm boven en aan elke kant. Gedurende deze tijd, het puntje van de naald zo dicht mogelijk naar de ant's hoofd maar verplaatsen zonder het aanraken van de antenne (figuur 1B).
      Opmerking: Motie was inbegrepen bij de presentatie van het CS, omdat het heeft aangetoond een rol te spelen in visueel associative leren in honingbijen⁶.
   3. Het toepassen van druk om te ademen een druppel van sacharose uit de spuit tip en breng de druppel van sacharose naast de antennes en de monddelen dat de mier te detecteren de sacharose. Toestaan dat de mier te voeden voor ongeveer 5 s.
      Nota: Het bedrag van sacharose mieren verbruikt in elk afzonderlijk experiment werd niet gecontroleerd in deze experimenten. De daling van sacharose op welke mieren dierenvoeder groot genoeg dient te laten vrij feed voor ongeveer 5 s.
   4. Herhaal deze procedure 10 x, met een ITI van 5 min.
      Opmerking: In deze experimenten, mieren waren altijd wendde zich tot het recht, met hun rechteroog dicht bij de open zijde van de acryl box. Daarom benaderde de CS altijd de mieren van hun rechterkant. Hoewel dit doet niets af aan leren, kunnen deze experimenten worden uitgevoerd door te draaien aan de helft van de mieren naar links en de helft naar rechts, om te voorkomen dat een mogelijk lateralization effect.
3. Ongepaarde opleiding
   Opmerking: Deze opleiding bestaat voorlegde aan de mieren de CS of de VS afzonderlijk, deze twee prikkels worden, dus los van elkaar na verloop van tijd (Figuur 1 d).
   1. Start de opname van de mieren 10 s voor elk afzonderlijk experiment.
   2. De CS op dezelfde manier zoals in gepaarde opleiding aanwezig, maar niet de sacharose bezorgen aan de mier.
   3. Na 2,5 min, leveren de Verenigde Staten rechtstreeks aan de monddelen (ook raken de antennes) met behulp van een injectiespuit zonder de CS aangesloten.
   4. Beginnen met een proces van CS en herhaal deze procedure 10 x voor elk type proef, intercalating hen met een ITI van 2,5 min.
4. Testen
   Opmerking: Een test moet worden uitgevoerd alleen 1 x, ofwel 10 min of 1 h na de laatste proef van de opleiding; een test die de mier wordt gepresenteerd met de CS maar niet met de VS kan leiden tot het uitsterven van de associatief geheugen eerder gevormd.
   1. Start de opname van de mieren 10 s vóór de test.
   2. De CS voorleggen de mier voor ongeveer 10 s.
   3. Zorg ervoor dat de mier nog steeds gemotiveerd te voeden door het leveren van sacharose na de test.

4. de gegevensverzameling en analyse

1. Opnemen van de mier gedrag, above, 10 s voor elk afzonderlijk experiment en tijdens de presentaties van het CS en de VS. Zorg ervoor dat alle proeven en tests worden geregistreerd voor posterieure analyse.
2. Met behulp van de opnames gemaakt tijdens opleiding en testen, score de mieren reacties tijdens de 10 s van CS presentatie.
3. Scheiden van de mieren reacties tijdens de presentatie van de CS in drie types van gedrag, afhankelijk van de uitbreiding en de beweging van de monddelen: volledig uittrekbaar met beweging (FEM) als voeding, volledig uittrekbaar zonder beweging (FE) of gedeeltelijke uitbreiding (PE) van de maxilla-labium of maxillaire ook (figuur 2A - 2D). Groep voor analyse, allerlei MaLER als één antwoord (figuur 2E).
4. Een mier die deed geen diervoeders in elke proef en test uitsluiten.
   Opmerking: Voor analyse, een statistische toets waarin rekening wordt gehouden met de individuele mieren wordt aanbevolen, waardoor administratieve verwerking van variabiliteit binnen individuen. Bij de indeling mieren reacties tijdens de training op een binaire manier (1 voor positieve reacties en 0 voor geen antwoord), is logistische regressie met gemengde gevolgen aan te raden^16,19. Voor het vergelijken van het aandeel van de mieren reageert in elke opleiding proef of test, een G-test of Fisher's exacte is aanbevolen, afhankelijk van het aantal mieren geanalyseerde^16,20.

Results

Tijdens de klassieke conditionering experimenten, moet de CS geen een spontane reactie bij de dieren veroorzaken. In de experimenten die wij hebben uitgevoerd, slechts 3% - 4% van de mieren uitgevoerd MaLER in reactie op de visuele cue op de eerste proef, voorafgaand aan de opleiding. Mieren die werden in een gepaarde opleiding steeds meer MaLER uitgevoerd in reactie op de CS (figuur 3A; logistische regressie, N = 51, vrijheidsgraden (df) = 507, z = 5.949, p < 0,01). Het percentage van de gepaarde mieren die op de CS reageren plateaued ongeveer 50% uit vanaf de derde proef. Integendeel, ongepaarde mieren toonde geen significante toename van de MaLER tijdens de training (figuur 3B; logistische regressie, N = 29, df = 287, z = 0.758, p = 0,45). Het voorkomen van MaLER in reactie op de visuele aanwijzing was aanzienlijk hoger tijdens gekoppeld dan ongepaarde opleiding (logistische regressie, N = 80, df = 796, z =-5.306, p < 0.01), dat was het geval voor elke proef behalve de eerste (tabel 1).

Voor de behandeling van hun korte en middellange termijn geheugen¹⁵, de mieren waren getest 10 min, of 1 h na de laatste opleiding proces. Voor beide tests was het aandeel van de mieren MaLER uitvoeren in reactie op de CS aanzienlijk hoger als ze had ondergaan gepaarde in plaats van ongepaarde opleiding (Figuur 3 c en 3D; Tabel 1).

Tijdens de opleiding, individuele mieren bleek aanzienlijke variatie in het aantal en de soort MaLER dat ze weergegeven (figuur 4A en 4B). Slechts 14% van de gepaarde mieren reageerde op elke proef uit de tweede of derde proef verder, terwijl de meeste mieren afgewisseld tussen proeven waarin zij antwoordden en waarin ze niet. Op deze opleiding proeven waarin mieren gereageerd, de mate waarin zij uitgebreid en verhuisd van hun monddelen gevarieerd. Dus we MaLER verdeeld in drie verschillende typen: FEM, FE of PE. Doorgaans, mieren uitgevoerd FEM of PE vaker dan FE. Echter, slechts een paar mieren uitgevoerd consequent hetzelfde type reactie; in de meeste gevallen toonde mieren weinig samenhang op het soort MaLER dat ze uitgevoerd (Figuur 4).

Figuur 1 : Experimentele opstelling en opleidingsplan. (A) Fix de mier met wax om een insect pins op een modellering aangesloten klei cilinder (oranje) en plaats een op maat gemaakte houder eronder toe te staan een naturalistische standpunt. Plaats deze in een witte acryl box verlicht door twee lichtbronnen, direct onder een camera. Gebruiken als de geconditioneerde stimulus (CS) een karton (blauw vierkantje) aangesloten op de spuit die de unconditioned stimulus (VS), een beloning van suiker levert. De inzet toont een vergrote weergave van een mier in de houder. (B) de tip van de spuit-naald wordt zo dicht mogelijk verplaatst naar de ant's hoofd maar zonder het aanraken van de antennes, zoals in dit schema. Trein mieren door middel van hetzij een (C) gekoppeld of (D) ongepaarde opleiding. Dit cijfer is gewijzigd van Fernandes et al. ¹⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : De Maxilla-Labium extensie respons van hout mieren. Afzonderlijke frames van de video-opnames tonen mieren mond deel bewegingen tijdens de training. (A) dit paneel toont geen reactie. (B) dit paneel toont een volledig uittrekbaar (FE) van de maxilla-labium die eindigt in de glossa. (C) dit paneel toont een gedeeltelijke uittrekbaar (PE) met alleen de maxillaire palpus zichtbaar. (D) dit paneel toont een gedeeltelijke uitbreiding (PE) van de maxilla-labium structuren. (E) mieren in gepaarde opleiding (N = 51) uitvoeren van een volledige uitbreiding met beweging (FEM; donker bruin), een FE (midden bruin) of een PE (lichtbruin). Dit cijfer is gewijzigd van Fernandes et al. ¹⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Hout mieren formulier associatieve herinneringen van een visuele cue gecombineerd met een suiker-beloning. (A) het percentage van de gepaarde mieren (N = 51) uitvoeren van MaLER naar aanleiding van de CS-presentatie aanzienlijk verhoogd in de gehele opleiding. (B) het percentage van de mieren MaLER uitvoeren niet verhogen aanzienlijk in de gehele ongepaarde opleiding (N = 29). Mieren werden getest (C) 10 minuten (gepaarde: N = 15; ongepaarde: N = 15) of (D) 1 uur (gepaarde: N = 15; ongepaarde: N = 14) na de laatste opleiding proces. Het percentage van de mieren reageren op de CS tijdens en na de gepaarde of ongepaarde training zijn vertegenwoordigd in bruin of grijs, respectievelijk. De drie soorten MaLER zijn vertegenwoordigd in het donker (FEM), medium (FE) en licht (PE) tonen. Dit cijfer is gewijzigd van Fernandes et al. ¹⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Individuele prestaties van mieren tijdens training. Deze panelen tonen de individuele prestaties van (A) gepaarde mieren en (B) de ongepaarde mieren. De drie soorten MaLER zijn vertegenwoordigd in het donker (FEM), medium (FE), en licht (PE) bruin of grijs. Dit cijfer is gewijzigd van Fernandes et al. ¹⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Proef	N	DF	G (gecorrigeerd)	P
1	80	NB	NB	> 0.1
2	80	1	3.86	< 0,05
3	80	1	8.41	< 0.01
4	80	1	6.63	< 0.01
5	80	1	8.41	< 0.01
6	80	1	7.5	< 0.01
7	80	1	10.69	< 0.01
8	80	1	11.76	< 0.01
9	80	1	17.13	< 0.01
10	80	1	17.13	< 0.01
10 min	59	1	5.5	< 0,05
1 h	59	1	4.42	< 0,05

Tabel 1: vergelijking van de MaLER reacties op de CS tussen mieren die had ondergaan gekoppeld en ongepaarde opleiding, voor elke proef en test Het aantal mieren (N), vrijheidsgraden (df), G-test van onafhankelijkheid (G) en p-waarde worden weergegeven. De eerste proef werd geanalyseerd met een Fisher's exacte test. Deze tabel is gewijzigd van Fernandes et al. ¹⁶.

Discussion

Klassieke conditionering is een van de meest gevestigde paradigma's te bestuderen van leren en geheugen. Het protocol dat wij hier gepresenteerd is een aanpassing van het paradigma ontworpen voor honing honingbij werknemers^2,3 en vervolgens gebruikt in combinatie met verschillende andere soorten, zoals hommels, fruitvliegjes, die ook PER te als een uitlezing gebruiken voor het leren van^{10 ,11}, en sprinkhanen en mieren, die gebruik maken van POR en MaLER, respectievelijk^12,13. Met dit protocol, is het mogelijk om te trainen wervelende hout mieren om te leren van de associatie tussen een visuele cue en een beloning van suiker en analyseren van het behoud van deze korte - (10 min) en de middellange termijn (1 uur) geheugen¹⁶.

In elke gedrags experiment is het noodzakelijk rekening te houden met kritische stappen die de variabiliteit in de dieren reacties kunnen minimaliseren. In het protocol hier gepresenteerd, zijn verschillende maatregelen genomen om te minimaliseren van variabiliteit vóór en tijdens de training. De kolonie moet worden uitgehongerd voor ten minste twee dagen vóór het begin van experimenten, en mieren moeten worden geselecteerd op basis van hun bereidheid om te eten van een daling van de suiker in het vak bedrijf. Selecteren van mieren op deze manier is bedoeld om het maximaliseren van de kans op opleiding mieren die gemotiveerd zijn om te voeden. Zorgvuldige behandeling is ook een belangrijke overweging, omdat het helpen kan om stress niveaus, die verstoort leren als het te intens²¹. Te dien einde moeten de mieren worden verdoofd met koude verblijven roerloos terwijl wordt aangewend, omdat iedere beweging (voor ontsnappen) tijdens deze procedure zou een bron van stress. Bovendien moet het contact tussen de mier en de was minimaal, vermijden van contact tussen de antennes en heet kaarsvet of draad, die schade kan veroorzaken. Hoewel deze waarnemingen hebben niet formeel is geanalyseerd, leek de antennes om te gaan met een specifiek patroon tijdens het leren.

Tijdens experimenten is zorgvuldige levering van de suiker ook belangrijk om mieren gemotiveerd. Nogmaals, terwijl dit niet is geanalyseerd formeel, abrupte voedsel levering leek extra stress veroorzaken aan de mier, die op zijn beurt geleid tot een gebrek aan motivatie en leren. Bovendien de sacharose geleverd tijdens de opleiding moet worden van een verminderde concentratie (200 g/L) om te voorkomen dat verzadiging vóór het einde van de opleiding en testen. Hierdoor MaLER te zijn van een goede kandidaat onvoorwaardelijke reactie omdat, samen met een lage spontane prestaties van dit antwoord op de visuele cue, het ook doet niet verzadigen over proeven. Tot slot, in tegenstelling tot de meeste klassieke conditionering studies^{2,3,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13}, we getraind een mier op het moment tot het einde van het experiment, waarbij het in plaats tussen proeven in plaats van te verwijderen als u wilt testen een andere mier. Opleiding verschillende mieren samen leek te produceren meer variabele resultaten, die veroorzaakt door een toename van de stress en/of conflict tussen visuele informatie veroorzaakt door de volledige verandering van het landschap worden kunnen. Ter beperking van de duur van elk experiment, hebben we een 5 minuten durende ITI gebruikt in plaats van de 10-minutengemiddelden ITI gebruikt in de meeste klassieke conditionering studies¹⁶. Hoewel al deze overwegingen moeten helpen zorgen dat de mieren zijn gemotiveerd om te voeden en te leren tijdens de opleiding, worden sommige variabiliteit niet vermeden. Het is raadzaam om met behulp van de mieren die lijken te hebben normale sociale, appetitive en motoriek gedrag en exclusief mieren uit de analyse van het moment dat ze niet te voeden op de proef van een opleiding of een test.

De aard van het CS werd niet getest in deze studie. Hoewel we een blauwe visuele stimuli gebruikt hebben omdat de mieren van het zelfde geslacht zijn gevoelig voor deze golflengten¹⁸, misschien ook andere kleuren worden geleerd i.s.m. een beloning. Verdere experimenten zouden moeten volledig karakteriseren de kleuren wordt gezien en geleerd in deze set-up. Dit geldt ook voor de verschillende vormen en maten van de visuele cue. We hebben niet getest als mieren ruimtelijke resolutie voldoende zijn zou voor de visuele stimuli die hier gepresenteerd op de afstand van de mieren ogen die het werd gepresenteerd op onderscheid te maken. Hoewel hout mieren samengestelde ogen zijn beschreven in termen van grootte en aantal facetten²², om onze kennis, is hun ruimtelijke resolutie niet volledig beschreven nog. Echter is dit voor Melophorus magoti²³berekend. Een soortgelijke karakterisering van de houten mieren, of andere geteste insecten ogen zou bijdragen tot een duidelijk onderzoek naar de eigenschappen van de visuele cue wordt waargenomen en geleerd door de dieren. Bovendien, we ook beweging bij de presentatie van de visuele stimuli aan de mier, omdat het heeft aangetoond een rol te spelen in de honingbij associative leren tijdens klassieke conditionering⁶. Echter, dit was ook niet getest in deze studie en, vanwege de aard van de verschillende verkeer van vliegende insecten in vergelijking met het lopen van insecten, verschillen tussen honingbij en ant visuele klassieke conditionering kon worden waargenomen.

Op een laatste opmerking konden we onderzoeken op lange termijn geheugen bewaren omdat de mieren niet overleven wordt aangewend voor een dergelijke lange perioden na de training. Echter in latere sets van experimenten, we hebben mieren leven gehouden en gemotiveerd om te eten en te leren wanneer ingezet en liet ze 's nachts in een donkere en vochtige omgeving (het plaatsen van een vak over hen). Daarom kon dit paradigma te ontrafelen op lange termijn geheugen bewaren van hout mieren, naast korte - en middellange termijn geheugen worden gebruikt.

Met deze eenvoudige procedure van algemene klassieke conditionering paradigma's aangepast, is het mogelijk om te bestuderen van de verwerving en instandhouding van visuele herinneringen in wervelende hout mieren, die wijd in paradigma's met behulp van gratis bewegende dieren zijn bestudeerd. Dit paradigma heeft het potentieel om te worden gebruikt voor het analyseren van de neurale basis van visueel leren in een zeer goed gevestigd model voor insect navigatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluon	Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK	ACS 109; ACS 112; ACS 114	For preventing insects from scaping
Crickets	Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK	LZJ 217	Given to the ant colonies as protein source
Natural Pine Rosin/Resin	Minerals-water Ltd, Rainham, UK	500g	Given to the ant colonies for sanitation
Austerlitz Insect Pin	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	26000-40	For harnessing ants
High speed camera	Edmund Optics Inc., Barrington, USA	eo-13122M	MaLER recordings during training and testing
Macrolens	Cannon, Surrey, UK	EF 100 mm f/2.8 L Macro IS USM	MaLER recordings during training and testing
Software	IDS Imaging Development Systems GmbH	uEye64	MaLER recordings during training and testing
Blue Cardboard	john smith's at Union Store, University of Sussex	JACK-PJM41358	Constitutes de conditional stimulus
Syringe	Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK	BD Plastipak 300185case; Product Code.12369289	US and CS (attached) presentation
Needle (0.5 x 16 mm)	Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK	BD Microlance 300600; Product Code:10442204	US and CS (attached) presentation