Methodenartikel

Synthese en structuurbepaling van µ-Conotoxin PIIIA-isomeren met verschillende Disulfide Connectivities

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58368

⸱

2 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Cysteïne-rijke peptides vouwen in verschillende driedimensionale structuren afhankelijk van hun verbindingen bisulfide. Gerichte synthese van individuele bisulfide isomeren is vereist wanneer de buffer oxidatie leidt niet tot de gewenste bisulfide-connectiviteit. Het protocol behandelt de selectieve synthese van peptiden 3-bisulfide-gebonden en hun structurele analyse met behulp van NMR- en MS/MS studies.

Samenvatting

Peptiden met een groot aantal cysteines zijn het meestal beïnvloed ten aanzien van de driedimensionale structuur door hun bisulfide-connectiviteit. Het is dus zeer belangrijk om te voorkomen dat ongewenste disulfide binding formatie tijdens peptide synthese, omdat het in een volledig verschillende peptide-structuur resulteren kan, en bijgevolg topicale gewijzigd. De juiste vorming van meerdere disulfide bindingen in een peptide is echter moeilijk te verkrijgen met behulp van standaardmethoden zelf vouwen zoals conventionele buffer oxidatie protocollen, omdat verschillende bisulfide connectivities kunnen worden gevormd. Dit protocol vormt een geavanceerde strategie nodig voor de gerichte synthese van meerdere bisulfide-overbrugd peptiden die kan niet worden gesynthetiseerd via buffer oxidatie in hoge kwaliteit en kwantiteit. De studie toont aan de toepassing van een afzonderlijke bescherming strategie van de groep voor de synthese van alle mogelijke 3-bisulfide-verbonden peptide isomeren van µ-conotoxin-PIIIA op een gerichte manier. De peptiden zijn bereid door Fmoc gebaseerde solid phase peptide synthese met behulp van een bescherming strategie van de groep voor gedefinieerde disulfide binding vorming. De respectieve paren van cysteines worden beschermd met trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) en tert-butyl (tBu) beschermen groepen om ervoor te zorgen dat alleen de vereiste cysteines tijdens elke stap van de oxidatie deprotected en gekoppeld. Naast de gerichte synthese, wordt een combinatie van verschillende analytische methoden gebruikt om de juiste folding en generatie van de gewenste peptide structuren te verduidelijken. De vergelijking van de verschillende 3-bisulfide-verbonden isomeren geeft aan het belang van nauwkeurige informatie en kennis van de bisulfide-connectiviteit voor de berekening van de driedimensionale structuur en interpretatie van biologische activiteit van de peptide-isomeren. De karakterisering van het analytische omvat de exacte disulfide binding opheldering via tandem massaspectrometrie (MS/MS) analyse die is uitgevoerd met gedeeltelijk verlaagde en Gealkyleerde derivaten van de intact peptide-isomeer geproduceerd door een aangepast protocol. Bovendien zijn de peptide structuren bepaald met behulp van 2D nucleaire magnetische resonantie (NMR) experimenten en de kennis die zijn verkregen uit MS/MS-analyse.

Inleiding

Het gebruik van bioactieve peptiden in farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling is zeer erkend, omdat zij krachtige en zeer selectieve compounds voor specifieke biologische doelstellingen1vertegenwoordigen. Voor hun topicale is de driedimensionale structuur echter van groot belang om uit te voeren van de relatie van structuur-activiteit studies2,3,4. Afgezien van de volgorde van het primaire aminozuur die invloed op de algehele bevleesdheid, stabiliseren bisulfide obligaties aanzienlijk de structuur van cysteïne-rijke peptides5. Meerdere bisulfide-overbrugd peptiden omvatten conotoxins zoals µ-PIIIA van de Conus purpurascens waarin zes cysteines in zijn reeks. Deze hoge cysteïne-inhoud kunt theoretisch de vorming van 15 bisulfide isomeren. De juiste bisulfide-connectiviteit is heel belangrijk voor de biologische activiteit6,7. Echter, de vraag die rijst is of er meer dan één bioactieve conformatie van nature voorkomende peptides en als zo, welke van die isomeren de hoogste biologische activiteit bezit? In het geval van µ-conotoxins, de biologische doelstellingen zijn natrium spanning-gated ionenkanalen en µ-PIIIA in het bijzonder is meest potente voor subtypen nbV1.2, nbV1.4 en nbV1.73.

De synthese van peptiden bisulfide-overbrugd kan worden bereikt met behulp van verschillende methoden. De meest geschikte methode voor de vorming van disulfide bindingen binnen een peptide is de zogenaamde oxidatieve zelf vouwen benadering. Hier wordt de lineaire voorloper van de gewenste cyclisch peptide gesynthetiseerd eerst met behulp van solid-phase peptide synthese, die immers het splijten van de polymere steun onderworpen aan oxidatie in een buffersysteem. Redox-actieve agentia zoals verminderde en geoxideerd glutathion (GSH/GSSG) worden vaak toegevoegd ter bevordering van de vorming van de disulfide bindingen. Het grootste nadeel van de buffer-ondersteund zelf vouwen is dat de disulfide bindingen niet selectief worden gevormd op een stapsgewijze manier. In vergelijking met de inheemse peptide, waarvoor vaak slechts één specifieke bisulfide isomeer wordt beschreven, is het mogelijk om talrijke andere isomeren met deze aanpak8. µ-PIIIA is reeds aangetoond dat resulteren in ten minste drie anders gevouwen isomeren op zelf in een eerdere studie3vouwen. De scheiding van dergelijke een mengsel van isomeer is nogal moeilijk als gevolg van soortgelijke retentietijden als chromatografische zuivering methoden9gebruikt. De gerichte synthese van een specifiek isomeer is dus gunstig. Specifiek producten die een isomeer met gedefinieerde bisulfide connectiviteit, een speciale strategie nodig is die de bisulfide obligaties zijn achtereenvolgens gesloten. Daarom wordt de lineaire voorloper uitvoering van verschillende beschermen groepen in de individuele cysteïne pairs gesynthetiseerd op de steun van het polymeer. Na de verwijdering, de cysteïne-paren zijn individueel en achtereenvolgens deprotected en verbonden in een oxidatie-reactie op de opbrengst van de gewenste bisulfide obligaties10,11,12,13, 14 , 15 , 16. na de synthese en de zuivering van het reactieproduct, dat is vereist ter bevestiging van de identiteit en de connectiviteit bisulfide geschikte analysemethoden. Tal van analytische methoden zijn beschikbaar voor de opheldering van de volgorde van de primaire aminozuur, bijv., MS/MS, terwijl de bepaling van de bisulfide-connectiviteit is nog steeds veel minder onderzocht. Afgezien van de complexiteit van dergelijke meerdere bisulfide-gebonden peptides, productgerelateerde onzuiverheden (bv., van bisulfide versluiering), als gevolg van monster voorbereiding en werk-up kunnen verder compliceren analyse. In dit artikel laten we zien dat het gebruik van een combinatie van verschillende analytische technieken nodig is om de identiteit van de disulfide bindingen in de µ-PIIIA-isomeren ondubbelzinnig te verduidelijken. Wij hebben chromatografische methoden gecombineerd met massaspectrometrie en verstrekt de zelfde monsters naar NMR spectroscopie. In de laser matrix-bijgewoonde desorption/ionization(MALDI) MS/MS-analyse geïdentificeerd we de disulfide bindingen met behulp van gedeeltelijke vermindering en iodoacetamide bewerking omdat top-down analyse niet mogelijk voor dit peptide is. 2D NMR experimenten werden uitgevoerd met het oog op een driedimensionale structuur van elke isomeer. Door het combineren van verschillende geavanceerde analytische methoden, is het dus mogelijk ophelderen goed de bisulfide connectiviteit en de driedimensionale structuur van complex meerdere bisulfide-gebonden peptiden7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Alle aminozuren die hierin gebruikt werden in de L-configuratie. De afkortingen van aminozuren en aminozuur derivaten waren gebruikt volgens de aanbevelingen van het Comité nomenclatuur van IUB en de IUPAC-IUB Joint Commission op Biochemical Nomenclature.

1. solid-Phase Peptide Synthese (SPPS)

Opmerking: De synthese met een solid-phase peptide synthesizer uitvoeren. Het uitvoeren van de synthese van de voorlopers van de lineaire peptide van de algemene reeks ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 met behulp van een standaardprotocol voor de 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Scheikunde. Toepassing van de volgende beschermde aminozuren: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) en zijn (Trt). Bescherm de cysteïne-paren met Trt-, Acm- of tBu-groepen volgens de beoogde bisulfide-connectiviteit.

  1. Voorbereiding
    1. Droog de Fmoc Rink-amide-hars (laden: 0,28 mmol/g) met behulp van een lyophilizer's nachts.
    2. Voer de gewenste peptide-reeks (1-lettercode) in het programma van de synthesizer. Het programma berekent het normbedrag voor elke individuele reagens en geeft aan de hoeveelheden oplosmiddel.
    3. Weeg de individuele reagentia (aminozuren, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfaat)) volgens het protocol en los ze op in dimethylformamide (DMF) om een eindconcentratie van 2,4 M (aminozuren) en 0,6 M ( HBTU), respectievelijk.
    4. Overdracht van de verschillende reagentia (aminozuren, HBTU, N-Methylmorfoline (NMM, 50% in DMF), piperidine (20% in DMF), DMF, dichloormethaan (DCM)) op de overeenkomstige vaartuigen en plaats ze in de juiste rackets van de solid-phase peptide synthesizer.
    5. 100 mg droog hars aan de reactie kolommen toevoegen en zet ze in de herrie van de synthesizer. Start de solid-phase peptide synthese.
  2. SPPS-Protocol (verstrekt door synthesizer)
    Opmerking: Het protocol is van toepassing op 100 mg hars (laden: 0,28 mmol/g) toegevoegd aan een reactie kolom voor 28 µmol schaal.
    1. Voorbereiding van de hars
      1. Spoel de hars met 2500 µL van DMF, 1400 µL van DCM en 1400 µL DMF.
      2. Spoel de hars met lucht totdat het oplosmiddel wordt verwijderd en spoelen van het hars met 2500 µL DMF.
    2. Splitsing van de bescherming van de groep Fmoc
      1. Toevoegen van 20% piperidine in DMF (1000 µL) naar de hars en wachten voor 6 min. de oplossing uit de hars te verwijderen. Herhaal stap 1.2.2.1.
      2. Spoel tweemaal met DMF (1st 4000 µL, 2nd1400 µL), spoelen van het hars met lucht totdat het oplosmiddel wordt verwijderd en spoel tweemaal met 2000 µL DMF.
    3. Koppeling reactie
      1. Meng de volgende reagentia in een aparte flesje: HBTU (450 µL 0,6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-aminozuur (420 µL, 2,4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.). Voeg het mengsel aan de hars en wacht op 13 min. verwijderen de oplossing van de hars. Herhaal stap 1.2.3.1.
      2. Wassen met 3000 µL DMF. Wassen tweemaal met 1400 µL DMF. Wassen tweemaal met 2000 µL DMF.
      3. Herhaal stap 1.2.2 en 1.2.3 volgens het aantal aminozuren in de volgorde van de peptide.
    4. Definitieve Fmoc decollete en hars wassen
      1. Toevoegen van 20% piperidine in DMF (1000 µL) naar de hars en wachten voor 6 min. de oplossing uit de hars te verwijderen. Herhaal stap 1.2.4.1.
      2. Spoel tweemaal met DMF (1st 4000 µL, 2nd 1400 µL) en spoelen van het hars met lucht. Spoel tweemaal met 2000 µL DMF, 4 keer met 1400 µL van DCM, en spoel tweemaal met lucht.
  3. Werk-up
    1. Lyophilize de hars uit de reactie kolommen overnachting na de synthese voltooid is.

2. peptide splijten van de hars (Figuur 1A)

Opmerking: Tijdens de splitsingsproducten-procedure, alle aminozuur zijketens met uitzondering van Cys(Acm) en Cys (tBu) zal worden deprotected. Het protocol is van toepassing op 100 mg hars.

  1. Combineer de gevriesdroogde hars in een tube 12 ml en afkoelen tot 0 ° C op ijs.
  2. 150 µL van een mengsel van de scavenger (bereid uit 0,75 g fenol, 0,5 mL thioanisole, 0,25 mL ethanedithiol) en 1 mL trifluorazijnzuur (TFA, 95% in water (H2O)) op het ijs aan de hars toevoegen. Laat zachtjes gedurende 3 uur bij kamertemperatuur te schudden.
  3. Filteren van het mengsel door een glasfritten en vang het filtraat in buizen individueel gevuld met ijskoude diethylether (1 mL van het mengsel van decollete per 8-10 mL diethylether). De peptide precipitaten als een witte vaste stof.
  4. Spoel de filterkoek met extra TFA (95% in H2O, ca. 1-3 mL).
  5. Sluit de buizen met de neerslag en centrifugeren (3400 x g) de schorsingen voor 1 min, giet het supernatant en wassen van de pellets met 8-10 mL ijskoud diethylether. Herhaal deze stap 3 keer.
  6. Laat de pellets permanent zonder stop voor 5 min om de resterende sporen van diethylether. Los van de pellets ruwe product in 1 mL van tert-butanol (80% in de H2O). Freeze-Dry de peptiden (-80 ° C).

3. de zuivering van de lineaire voorloper met semi-preparatieve krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)

Opmerking: De ruwe peptiden zuiveren door semi-preparatieve reversed-phase (RP) HPLC uitgerust met een C18 kolom (5 µm deeltjesgrootte, 100 Å poriegrootte, 250 x 32 mm) en een 3,6 mL injectie lus. Gebruik een kleurovergang elutie systeem van 0,1% TFA in H2O (Eluens A) en 0,1% TFA in acetonitril (acetonitril) /H2O (9:1, Eluens B). Detecteren van de pieken bij 220 nm.

  1. Ca. 70 mg van de ruwe peptide toevoegen aan een tube van 15 mL en los van de solide peptide in het volume van de HPLC monster lus (bv., 3,6 mL). Gebruik een mengsel van 0,1% TFA in acetonitril/H2O (1:1). Vortex tot volledige ontbinding en centrifuge (3400 x g) de oplossing voor 1 min.
  2. Opstellen van het monster (3,6 mL) in een 5 mL-spuit en het monster zonder eventuele luchtbellen te injecteren in de lus van de injectie. Injecteren van het HPLC-systeem. Scheiden van het mengsel van de peptide met behulp van een helling van 0-50% Eluens B meer dan 120 min op een debiet van 10 mL/min.
  3. Verzamel de breuken in individuele buizen zoals deze worden weergegeven. Na de run voltooid is, voorbereiden op geselecteerde breuken massaspectrometrie (MS) en HPLC analyse (stap 6.1-6.2). Freeze-Dry van de fracties en bewaar ze bij-20 ° C.
  4. Na MS en de HPLC analyse, combineer de zuivere breuken van lineaire peptide en voorbereiding van de monsters voor de eerste oxidatie.

4. selectieve vorming van de Disulfide bindingen

  1. 1 st oxidatie (Figuur 1B)
    Opmerking: Tijdens het peptide splijten van de hars, de Cys(Trt) zijn deprotected, wat leidt tot twee onbeschermde Cys residuen die zijn vervolgens onderworpen aan oxidatie om de eerste disulfide binding te vormen. Het volgende protocol is van toepassing op 15 mg van lineaire gezuiverde peptide (2864.5 g/mol 5.2 µmol; 1 eq.).
    1. Los van de lineaire peptide (15 mg) in een isopropanol/H2O-mengsel 105 mL (1:2; 0.05 mM pH 8,5 aangepast met natriumhydroxide (NaOH)) en laat zachtjes schudden in lucht onder basisvoorwaarden voor 12-48 h.
    2. De oxidatie reactie via HPCL-samenstelling en MS. Confirm de vorming van de eerste brug door iodoacetamide (IAA) bewerking (stap 6) volgen.
    3. Freeze-Dry van de peptide en gebruiken zonder verdere zuivering voor de 2nd -oxidatie.
  2. 2nd oxidatie (Figuur 1C)
    Opmerking: Tijdens de tweede oxidatie, de deprotection van de cysteines van Acm-beschermd en de vorming van de tweede brug worden gekatalyseerd door jodium. Het protocol is van toepassing op 15 mg van peptide na de 1st oxidatie (2862.5 g/mol 5.2 µmol; 1 eq.)
    1. Los de peptide (15 mg; eindconcentratie van 0.05 mM) in 105 mL een isopropanol/H2O/1 M zoutzuur (HCl) mengsel (80:12.5:7.5).
    2. Voeg 158 µL van een jodiumoplossing 0,1 M in methanol (MeOH) (15.7 µmol; 3 eq.) aan de oplossing. Roer de reactie bij kamertemperatuur voor 3-52 h, dwz., totdat de oxidatie is voltooid.
    3. Controleren de oxidatie reactie via HPCL-samenstelling en MS. Confirm de vorming van het tweede Zwavelbrug iodoacetamide (IAA) bewerking (stap 6).
    4. Zet de reactie stop door het toevoegen van 79 µL van een oplossing van 1 M ascorbinezuur in H2O (78,8 µmol; 15 eq.). Freeze-Dry het reactiemengsel en gebruik het poeder voor de 3rd -oxidatie.
  3. 3rd oxidatie (Figuur 1D)
    Opmerking: De laatste oxidatie leidt tot de deprotection van de cysteines tBu-beschermd en tot de vorming van de derde bisulfide-brug. Het protocol is van toepassing op 15 mg van peptide na de 2nd oxidatie (2718.3 g/mol 5.5 µmol; 1 eq.).
    1. Los de peptide (15 mg, eindconcentratie van 1 mM) in 5,5 mL TFA. Het bevat een mengsel van de straatveger bestaande uit 11.2 mg diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 eq.), 60.2 µL van anisol (0,6 mmol; 100 eq.) en 97.2 µL van trichloromethylsilane (0,8 mmol; 150 eq.). Roer het mengsel gedurende 3-5 uur bij kamertemperatuur.
    2. Controleren de oxidatie reactie via HPCL-samenstelling en MS. Confirm de vorming van de derde Zwavelbrug iodoacetamide (IAA) bewerking (stap 6).
    3. Het neerslaan van de peptide in de buizen met koude diethylether (0 ° C, 1 mL van reactie oplossing per 8-10 mL diethylether).
    4. Centrifugeer de suspensies (3400 x g 1 min), de bovendrijvende vloeistof decanteren en was de korrels herhaaldelijk (4 keer) met 8-10 mL koude diethylether (0 ° C). Laat die de pellets droog op lucht (3 min).
    5. Los van de pellets in 1 mL 80% tert-butanol (in H2O), freeze-dry van de peptide en opslaan bij-20 ° C.

5. peptide zuivering

Opmerking: De geoxideerde peptiden zuiveren door semi-preparative RP HPLC met een C18 kolom uitgerust (10 µm deeltjesgrootte, 300 Å poriegrootte, 250 x 22 mm) en een 3,6 mL injectie lus. Gebruik een kleurovergang elutie systeem van 0,1% TFA in H2O (Eluens A) en 0,1% TFA in acetonitril/H2O (9:1, Eluens B). Detecteren van de pieken bij 220 nm.

  1. 15 mg van het gevriesdroogd ruwe product uit stap 4.3.5 toevoegen aan een tube van 15 mL. Los van het ruwe product in het volume van de HPLC monster lus (bv., 3,6 mL). Gebruik een mengsel van 0,1% TFA in acetonitril/H2O (1:1). Vortex tot volledige ontbinding en centrifuge (3400 x g) de oplossing voor 1 min.
  2. Opstellen van de 3.6 mL van het mengsel in een 5 mL-spuit en het monster zonder eventuele luchtbellen te injecteren in de lus van de injectie. Start de injectie in de HPLC-systeem. Het zuiveren van het mengsel van de peptide met behulp van een helling van 0-50% Eluens B meer dan 120 min op een debiet van 10 mL/min.
  3. Verzamel de breuken in individuele buizen zoals deze worden weergegeven. Na de run voltooid is, voorbereiden op geselecteerde breuken MS en de HPLC analyse (stap 6.1-6.2). Freeze-Dry van alle fracties en bewaar ze bij-20 ° C.
  4. Na de run voltooid is, voorbereiden op geselecteerde breuken MS en de HPLC analyse (stap 6.1-6.2). Freeze-Dry van alle fracties en bewaar ze bij-20 ° C.

6. peptide Analytics

  1. Analytische HPLC
    Opmerking: Bevestigen de zuiverheid van een peptide door analytische RP-HPLC uitgerust met een C18 kolom (5 µm deeltjesgrootte, 300 Å poriegrootte, 250 x 4,6 mm) en een 500 µL injectie lus. Gebruik een kleurovergang elutie systeem van 0,1% TFA in H2O (Eluens A) en 0,1% TFA in acetonitril (Eluens B). Detecteren van de pieken bij 220 nm.
    1. Breng een monster van de peptide fracties of reactie besturingselementen in een HPLC ampul en los het op in een mengsel van 0,1% TFA in acetonitril/H2O (1:1, 300-500 µL). Plaats de ampul HPLC in de autosampler van de analytische RP-HPLC.
    2. Injecteren 250 µL van elk monster. Gebruik een kleurovergang elutie systeem van 0,1% TFA in H2O (Eluens A) en 0,1% TFA in acetonitril (Eluens B). Zuiveren van de peptide met behulp van een helling van 10-40% Eluens B meer dan 30 min op een debiet van 1,0 mL/min.
  2. De Spectrometrie van de massa van de MALDI TOF
    Opmerking: De identiteit bevestigen van een peptide door MALDI TOF (tijd van de vlucht) massaspectrometrie met behulp van α- cyano-4-hydroxycinnamic zuur als matrix.
    1. Pipetteer een zichtbaar hoeveelheid de peptide in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL en los het op in 10 µL van een 37 mM α- cyano-4-hydroxycinnamic zure oplossing in een mengsel van 0,1% TFA in H2O/acetonitril (1:1).
    2. Vortex de oplossing voor 10 s, 2 µL van het monster van toepassing op een grond stalen doel, en het monster drogen.
    3. Gebruik de modus van de reflector voor de metingen en een peptide ijkstandaard voor molaire massa onder 6000 g/mol.
  3. Iodoacetamide bewerking
    Opmerking: Zoals iodoacetamide met thiol-groepen reageert, iodoacetamide bewerking van de peptiden geeft gratis thiol-groepen. Vandaar dient de afwezigheid van vrije thiol-groepen als een controle van de reactie via MS tijdens de 1st -oxidatie.
    1. Los de peptide in 10 mM fosfaatbuffer (0.05 mM, 100 µL; pH 7,8) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Voeg 100 µL iodoacetamide in 10 mM fosfaatbuffer (4 mM) aan de oplossing van de peptide en de reactie gedurende 2 uur zachtjes te schudden bij kamertemperatuur in het donker. Freeze-Dry het reactiemengsel en opslaan bij-20 ° C.
    2. Gebruik een C18-concentratie filter pipette uiteinde en conditie van de tip met 10 µL van 0%, 80% (3 keer), 50% (3 keer) en 30% (3 keer) (3 keer) acetonitril in H2O (+ 0,1% TFA).
    3. Los het voorbeeld uit stap 6.3.1 in 1 µL van 0,1% TFA in H2O en de oplossing aan het uiteinde van de pipet filter toevoegen. Pipetteer zorgvuldig op en neer zodat de peptide aan de kraal bindt. Verwijder de H2O uit het uiteinde van de pipet en spoelen van het filter pipette uiteinde met 10 µL van 0,1% TFA in H2O.
    4. Voeg 2 µl van 0,1% TFA in H2O/acetonitril (1:1) met een ander uiteinde van de Pipet (zonder filter) bovenop de kraal waarin de peptide. Het filtraat van toepassing op de grond stalen doelstelling en het monster drogen.
    5. Breng 1 µL van een zure oplossing van 37 mM α-cyano-4-hydroxycinnamic in een mengsel van 0,1% TFA in H2O/acetonitril (1:1) aan de steel van de grond gericht met het monster en het monster drogen.
    6. Gebruik de modus van de reflector voor de metingen en een peptide ijkstandaard voor molaire massa onder 6000 g/mol.
  4. Aminozuur analyse
    Opmerking: Analyseer de exacte peptide concentratie, alsook de aminozuursamenstelling van de peptide met behulp van een amino acid analyzer.
    1. 100 µg van de zuivere peptide (2604 g/mol; 0,04 µmol) overbrengen in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL en los het poeder in 200 µL van 6 M HCl.
    2. Breng 200 µL van de oplossing in een glazen ampul en spoelen de tube van de microcentrifuge van de 1,5 mL tweemaal met 200 µL van 6 M HCl. Breng de spoeldouche oplossing in de glazen ampul ook.
    3. Sluit de ampul door verwarming van de hals van de ampul met een vlam Bunsenbrander. Zet de ampul in een glazen buis. Plaats het in een blok van de verwarming gedurende 24 uur bij 110 ° C voor hydrolyse.
    4. De ampul open en breng de oplossing kwantitatief over in een tube van 2 mL microcentrifuge. Wassen van de ampul (3 x 200 µL) en het gemeenschappelijk landbouwbeleid (3 x 100 µL) met tweemaal gedestilleerd H2O en breng dit in de microcentrifuge buis.
    5. Centrifugeer de oplossing gedurende 6 uur bij 60 ° C en 210 x g in een rotatie vacuüm concentrator. Los van de gehydrolyseerde product in 192 µL van de steekproef verdunning buffer (200 µM) en breng de oplossing kwantitatief over in een micro-centrifugaal filter.
    6. Centrifugeer het monster voor 1 min bij 2300 x g en overdracht 100 µL van het filtraat in een monsterbuisje aminozuur analyse. Plaats de buis in de amino acid analyzer en beginnen met de analyse. Een aminozuur-standaard wordt gebruikt voor de kalibratie.

7. MS/MS analyse van Disulfide connectiviteit

  1. Gedeeltelijke vermindering en alkylatie17
    1. Los van het pure peptide (2604 g/mol; 0,23 µmol) in 1.2 mL 0,05 M citraat buffer (pH 3.0; 0,14 mM peptide concentratie) 600 µg dat 7,5 mg tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP; 0,02 M 0.03 mmol).
    2. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur en nemen verschillende reactie controlemonsters (100 µL) variërend van 0 min tot 30 min.
    3. Meng de monsters in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 300 µL van alkylatie buffer (0.5 M tris-acetaat, pH 8.0; azijnzuuroplossing (NA2EDTA) ethyleendiamminetetra 2 mM; 1,1 M iodoacetamide) zet de reactie stop en uitvoeren van carbamidomethylation van de vrije thiol-groepen.
    4. Stop de reactie na 5 minuten door toevoeging van 100 µL van 10% TFA (H2O) en winkel de monsters op droog ijs. Bereiden van HPLC monsters zoals beschreven in stap 6.1.2 en injecteren 400 µL.(Figuur 2)
    5. Gebruik een kleurovergang elutie systeem van 0,1% TFA in H2O (Eluens A) en 0,1% TFA in acetonitril (Eluens B). Analyseren van de peptiden met behulp van de combinatie van een isocratic scheiding (10% Eluens B gedurende 15 minuten) en vervolgens een latere verloop van 10-35% Eluens B meer dan 25 min op een debiet van 10 mL/min. detecteren de pieken bij 220 nm.
    6. Verzamel de breuken in 1,5 mL microcentrifuge buizen en freeze-dry de peptiden. (Figuur 2B)
    7. Een kleine hoeveelheid van elke fractie overbrengen in een tube microcentrifuge 1,5 mL voor MS/MS analyse van de geoxideerde vormen (Lees verder bij stap 7.1.12).
    8. Los van de resterende peptide (10-100 µg) in 0,1% TFA in H2O (10-50 µL) en een passende omvang van een 100 mM TCEP-oplossing (in H2O) toevoegen om een eindconcentratie van de TCEP van 10 mM.
    9. Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C (Figuur 2C). Freeze-Dry het reactiemengsel en opslaan bij-20 ° C.
    10. MS/MS monsters zoals beschreven in stap 6.3.2-6.3.5 voor te bereiden.
    11. De MS/MS-metingen uit te voeren op een MALDI-TOF/TOF massa spectrometer. MS/MS deksel (laser-geïnduceerde verval) gebruiken voor versnippering van de peptide en selecteer de massa van de voorloper van 2 - en 4-times carbamidomethylated soorten. Verwerken en evalueren van de MALDI-gegevens om te bevestigen de gewenste bisulfide-connectiviteit.

8. NMR experimenten en structuuranalyse

  1. Los ca. 0,3-2 mg van het product puur peptide in 500 µL van H2O/D2O (90:10) en de overdracht het mengsel in een NMR microtube.
  2. Stel het monster voor meting bij een NMR spectrometer
  3. Record 2-dimensionale [1H,1H] - DQF - COSY (dubbele quantum gefilterd correlatie spectroscopie), [1H,1H] - TOCSY (totale gecorreleerde spectroscopie), [1H,1H] - NOESY (Nucleair Overhauser enhancement spectroscopie), en [1H,13C]-HSQC (heteronucleaire één quantum samenhang) spectra met behulp van water onderdrukking.
  4. Toewijzen van de proton resonanties van de opgenomen spectra en maken de atoom-toewijzing van NOESY spectra. Vergelijk de intensiteit in de spectra van de NOESY in te stellen van de beperkingen van de bovengrens afstand tussen verschillende atomen in de peptide. Gebruik de intensiteit van de germinal protonen voor piek-intensiteit kalibratie.
  5. Het uitvoeren van berekening van de structuur en verfijning met een computerprogramma voor het visualiseren van de moleculaire en gebruik van de geïdentificeerde bisulfide connectivities van stap 7 als extra beperkingen (Figuur 3).
  6. Selecteer de structuren met de laagste energieën en gebruik het voor moleculaire dynamica (MD) simulaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

15 verschillende bisulfide-overbrugd isomeren van de µ-conotoxin-PIIIA zijn gesynthetiseerd en gekenmerkt in detail (Figuur 1). Disulfide bindingen worden geïdentificeerd door de gedeeltelijke vermindering en latere MS/MS analyse (Figuur 2). NMR analyse van de verschillende isomeren wordt uitgevoerd (Figuur 3) te onthullen van de individuele peptide structuren. Met name is een combinatie van RP HPLC,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De beschreven methode hierin voor de synthese van cysteïne-rijke peptides zoals µ-PIIIA vertegenwoordigt een mogelijkheid tot selectief bisulfide-gebonden isomeren van dezelfde aminozuur volgorde. Daarom, gevestigde methoden zoals Fmoc gebaseerde solid phase peptide synthese18 en een gedefinieerde bescherming strategie van de groep voor de regioselectieve vorming van disulfide bindingen waren gebruikte16. De solid-phase peptide synthese kan produceren aminozuur sequenties o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij zouden graag willen bedanken A. Resemann, F. J. Mayer en D. Suckau van Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts en C. Thiele uit de Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger van het FLI-Jena, M. Engeser van de Universiteit van Bonn; K. Kramer, A. Harzen en H. Nakagami van het Max Planck Instituut voor fok plantenonderzoek, Keulen; Susanne Neupert van het Instituut voor Dierkunde, Keulen; Biomoleculaire magnetische resonantie spectroscopie faciliteiten van de Universiteit van Frankfurt voor technische ondersteuning, modules, opleiding en toegang tot instrumenten. Financiële steun van de Universiteit van Bonn aan D.I. wordt dankbaar erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc)BachemA-3850
Arg(Pbf)Iris BiotechFSC1010
Asn(Trt)BachemB-1785
Asp(tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp(tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys(Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(Trt)Iris BiotechFDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphatSigma Aldrich8510060Ontvlambaar
DMFFisher ScientificD119Ontvlambaar, toxisch
DCMFisher ScientificD37Carcinogeen
PiperidineAlfa AesarA12442Ontvlambaar, toxisch, corrosief
N-Methyl-MorpholinSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
trifluoruacetic acidSigma Aldrich74564Toxisch, corrosief
fenolMerck1002060Toxisch
thioanisolAlfa AesarA14846
ethanedithiolFluka Analytical2390
diethyletherVWR100,921Ontvlambaar
tert-butanolAlfa AesarL12338Ontvlambaar
acetonitrilFisher ScientificA998Ontvlambaar
waterFisher ScientificW5
isopropanolVWRACRO42383Ontvlambaar
natriumhydroxideAppliChemA6579,1000Corrosief
iodoaceetamideSigma AldrichI6125
jodiumSigma AldrichI0385
zoutezuurMerck110165Corrosief
ascorbinezuurSigma AldrichA4403
difenylsulfoxideSigma AldrichP35405
anisolSigma Aldrich96109Ontvlambaar
trichloromethylsilaanSigma AldrichM85301Ontvlambaar
monsterverdunningsbufferLaborservice Onken
natriumdiwaterstoffosfaatSigma Aldrich106370
dinatriumwaterstoffosfaatSigma Aldrich795410
(2-carboxyethyl)fosfinehydrochlorideSigma AldrichC4706
citroenzuurSigma Aldrich251275
natriumcitraatdihydraatSigma AldrichW302600
tris-acetaatCarl Roth, 7125
EthyleendiaminetetraazijnzuurSigma AldrichE26282 
peptide kalibratiestandaard IIBruker Daltonics GmbH8222570
Naam van apparatuurBedrijf
solid-phase peptide synthesizerIntavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
lyofilisaat Martin Christ GmbH Alpha 1-2 Ldplus
semipreparatieve HPLCJascosysteem PV-987
Eurospher 100 C18 kolom (RP, 5 µm deeltjesgrootte, 100 Å poriëngrootte, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2Jzuivering van het lineaire peptide
Vydac 218TP1022 kolom (RP C18, 10 µm deeltjesgrootte, 300 Å poriëngrootte, 250 x 22 mm)Hichrom-VWRHICH218TP1022zuivering van het geoxideerde peptide
analytische HPLC Shimadzusysteem LC-20AD
Vydac 218TP54 kolom (C18 RP, 5 µm deeltjesgrootte, 300 Å poriëngrootte, 250 x 4.6 mm) Hichrom-VWRHICH218TP54analytische kolom
gemalen stalen doelwit (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436MALDI-voorbereiding 
C18-concentratiefilter (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096MALDI-voorbereiding 
MALDI-massaspectrometerBruker Daltonics GmbHultraflex III TOF/TOF
aminozuuranalyzerEppendorf-Biotronik GmbHLC 3000 systeem
NMR-spectrometer Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
computerprogramma voor moleculaire visualisatieYASARA Biosciences GmbHYasara-structurenNMR-structuurberekening
computerprogramma voor MALDI-gegevensevaluatie Bruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioToolsMS/MS-fragmentatie
analoge vortexmixerVWRVM 3000
MicrocentrifugeEppendorf5410
CentrifugeHettichEBA 20
Vac

Referenties

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Trefwoorden

Vorming van disulfidebindingenpeptidesynthesevaste fasesynthesetandemmassaspectrometrienucleaire magnetische resonantieselectieve oxidatieHPLC zuiveringaminozuuranalysepeptidekarakterisering

Gerelateerde artikelen