We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zuurstofverbruik proton motive force (PMF) en proton lek zijn metingen van de mitochondriale ademhaling, of hoe goed de mitochondriën zijn kundig voor bekeerling NADH en FADH in ATP. Aangezien mitochondriën ook de primaire site voor zuurstof gebruik en nutriënten oxidatie in kooldioxide en water zijn, hoe efficiënt ze zuurstof gebruiken en produceren van ATP rechtstreeks betrekking heeft op de efficiëntie van nutriënten metabolisme, voedingsstoffen eisen van het dier, en gezondheid van het dier. Het doel van deze methode is te onderzoeken van mitochondriale ademhaling, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gevolgen van verschillende drugs, diëten en milieueffecten op mitochondriale metabolisme. Resultaten omvatten zuurstofverbruik gemeten als proton afhankelijke ademhaling (staat 3) en proton lek afhankelijke ademhaling (staat 4). De verhouding tussen staat 3 / staat 4 ademhaling wordt gedefinieerd als respiratoire controle verhouding (RCR) en mitochondriale energetische efficiëntie kan vertegenwoordigen. Mitochondriale proton lek is een proces waarmee dissipatie van Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) door ontkoppelingseiwit oxidatieve fosforylatie van ADP minderen van de efficiëntie van de ATP-synthese. Zuurstof en TRMP + gevoelige elektroden met mitochondriale substraten en elektronentransport keten remmers worden gebruikt als eenheid staat 3 en staat 4 ademhaling, mitochondriale membraan PMF (of het potentieel voor de productie van ATP) en proton lek. Beperkingen van deze methode zijn dat leverweefsel zo vers mogelijk moet en alle biopsies en tests moeten worden uitgevoerd in minder dan 10 h. Dit beperkt het aantal monsters dat kan worden verzameld en verwerkt door één persoon in een dag om ongeveer 5. Echter, slechts 1 g van leverweefsel nodig is, dus in grote dieren, zoals melkvee, de hoeveelheid monster nodig klein ten opzichte van de grootte van de lever is en er weinig hersteltijd nodig is.
Inleiding
Mitochondriën zijn zeer gevoelig voor stress en hun cellulaire omgeving kan bijdragen tot een breed scala aan metabole ziekten. Zuurstofverbruik en proton lek in mitochondriën zijn indicatoren voor de gezondheid van de mitochondriën. De methoden die worden beschreven in dit papier schatting mitochondriale energie-efficiëntie met behulp van RCR gebaseerd op zuurstofverbruik met en zonder proton lek. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik1. Wijzigingen in zuurstof verbruik en proton lek herkent mitochondriale dysfunctie die bijdraagt tot metabole ziekte en resulteert in verminderde energie-efficiëntie. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden, protocol en studies die hier beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Californië, Davis.
1. het verkrijgen van een lever biopsie van een melkkoe van Holstein
Opmerking: Een lever biopsie moet worden uitgevoerd door een erkende dierenarts. Lever biopten kunnen worden uitgevoerd op de zuivel-site waar de koeien zich bevinden. Zogende melkkoeien kunnen blijven normaal worden gemolken en melk hoeft niet te worden onttrokken aan de voedselvoorziening voor of na de ingreep. Het wordt aangeraden dat er minstens 4 personen nodig zijn v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Positieve resultaten tonen de RCR en proton lek kinetiek worden weergegeven in tabel 1 en Figuur 15, respectievelijk. In deze studie7, RCR en eiwit lek kinetiek werden gemeten in Holstein melkkoeien op 70 dagen pas in melk nadat koeien had 1 van 5 verschillende niveaus van Cu, Zn en Mn gevoederd gedurende 28 dagen. Staat 4, maximale proton lek-afhankelijke ademhaling, had de neiging te worden beïnvloed door minerale in.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het meest kritieke punt in het protocol is het verkrijgen van een steekproef representatief leverweefsel en beginnen het isolement van de mitochondriën zo spoedig mogelijk na biopsie. Variatie in ademhaling metingen is laag (tabel 1) als gevolg van een korte transporttijd van koe naar laboratorium. Verklein de transporttijd en een klein laboratorium opgericht in het kantoor van de melkerij, en lever monsters naar het laboratorium van office werden verdreven, zoals elk werd verzameld zodat mitochondriën g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door Alltech en USDA Hatch fondsen door het centrum voor levensmiddelen, diergezondheid bij UC Davis School voor diergeneeskunde.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Leverbiopsie | |||
| Uitrusting | |||
| Schackelford-Courtney boviene leverbiopsie instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Sutuurdraad | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Sutuurnaalden | NA | NA | Meegeleverd met Sutuurdraad |
| Schelpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # voor handvat en bladen |
| Operatiedoeken | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falconbuizen 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Pincet | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| Spuiten 50 mL | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injectienaalden (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Koeienhalsband | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Wattenstaafjes | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| Wattenschijfjes (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medische schaar | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicaliën | |||
| Coccidiose Vaccin 0,75 fles/koe | Verstrekt door dierenarts | ||
| Clostridia Vaccin | Verstrekt door dierenarts | ||
| Leverbiopsie antibiotica excenel 2 cc/100 lbs gedurende 3 dagen | Verstrekt door dierenarts | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV bij 0,010-0,015 mg/kg lichaamsgewicht | Verstrekt door dierenarts | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Verstrekt door dierenarts | ||
| 1 mg/kg IV injectie van flunixin meglumine | Verstrekt door dierenarts | ||
| Isolering van Mitochondria (lever) | |||
| Uitrusting | |||
| Wheaton buisje 30 mL met een Teflon stamper van 0,16 mm ruimte | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenisator Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenisator Sonde | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Automatische Pipet (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beker (500 mL) met ijs | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Gekoelde microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge buisjes (1,5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicaliën | |||
| Bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit (microplaten voor plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (vetzuurvrij) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| De-ioniseerd water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Gebruikt om mitochondria isolatie media te maken: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, en 0,1% (w/v) vetzuurvrije BSA, pH 7,4 bij 4 °C, zal 2 dagen meegaan in de koelkast | |||
| Mitochondriale Zuurstof Consumptie | |||
| Uitrusting | |||
| Oxygraaf Opstelling + Clark type zuurstof elektrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermogeregelde Waterpomp | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Zuurstof elektrode | NA | NA | |
| Autopipet (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Meegeleverd met Oxy1 |
| Kleine magnetische roerbar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipet (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicaliën | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Gebruikt om mitochondriale zuurstof consumptie media te maken: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes en 1 mM EGTA, pH 7,4 bij 30 °C met 0,3% ontvette BSA | |||
| Rotenone (4 mM oplossing) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M oplossing) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM oplossing) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (oplossing van 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondriale Membraan Potent |
Referenties
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
