Method Article

Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

DOI:

10.3791/58397

⸱

September 18th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Urology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, SUNY Upstate Medical University, 3Laboratory of Comparative Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 4Boulder BioPATH, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetisch gemodificeerde muizen zijn nuttige modellen voor het onderzoek naar prostaatkanker mechanismen. Hier presenteren we een protocol om te identificeren en ontleden prostaat lobben van het urogenitaal systeem van een muis, onderscheiden van hen op basis van histologie, isoleren en cultuur de primaire prostaat cellen in vitro als spheroïden voor downstream analyses.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) dienen als effectieve preklinische modellen voor het onderzoeken van de meeste soorten menselijke kankers, met inbegrip van prostaatkanker (PCa). Inzicht in de anatomie en de histologie van de muis prostaat is belangrijk voor het efficiënt gebruik en de juiste karakterisering van dergelijke dierlijke modellen. De muis prostaat heeft vier verschillende combinaties van de lobben, elk met hun eigen kenmerken. Dit artikel demonstreert de juiste methode van dissectie en identificatie van de prostaat lobben muis voor analyse van de ziekte. Na dissectie, de prostaat cellen kunnen verder worden gekweekt in vitro voor mechanistische begrip. Sinds de muis prostaat primaire cellen de neiging om te verliezen hun normale kenmerken wanneer gekweekt in vitro, duidelijk naar voren komt hier een methode voor het isoleren van de cellen en groeien ze als 3D sferoïde culturen, die is effectief voor het behoud van de fysiologische kenmerken van de cellen. Deze 3D culturen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de morfologie van de cel en gedrag in in de buurt van de fysiologische omstandigheden, onderzoeken gewijzigd niveaus en lokalisaties van belangrijke eiwitten en trajecten die betrokken zijn bij de ontwikkeling en de vooruitgang van een ziekte, en kijken Reacties op behandelingen van de drug.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wetenschappelijke gemeenschap heeft geprobeerd het ophelderen van het complex mechanisme van de ontwikkeling van de menselijke kanker voor decennia. Overwegende dat de identificatie van potentiële hoofdrolspelers en drug doelen begint met patiënt cellen en weefsel studies, vereist de translationeel toepassing van dergelijke bevindingen vaak het gebruik van preklinische diermodellen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen modellen (GEMMs) met model menselijke kanker is gestaag gestegen sinds de oprichting van de muis modellen van menselijke kankers Consortium (NCI-MMHCC), een comité dat getracht te beschrijven en verenigen van de kenmerken van de muis kanker modellen voor wetenschappers wereldwijd1,2. Muismodellen voldoen aan de behoefte voor mechanistische studies in pre-klinische studies van de meeste vormen van kanker, voor inzicht in de ontwikkeling, progressie, reactie op de behandelingen, en verworven weerstand3.

Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen, die meer dan 160.000 mannen elk jaar4. Agressieve vormen van de ziekte beweren tienduizenden levens per jaar. Echter, het mechanisme van de progressie van de ziekte is nog steeds slecht begrepen. Dit resulteert in een ernstig gebrek aan effectieve behandelingsopties voor geavanceerde en uitgezaaide prostaatkanker, zoals blijkt uit het hoge sterftecijfer in geavanceerde prostaatkanker patiënten4. Vandaar, is er een groeiende behoefte aan pre-klinische modellen om te studeren van prostaatkanker. Echter, als gevolg van de inherente verschillen tussen de muis en het menselijke prostaat, modellering van prostaatkanker bij GEMMs kreeg niet populariteit totdat het classificatiesysteem van Bar Harbor werd geïntroduceerd in 2004, die geschetst van histopathologische veranderingen in de muis prostaat bij genetische manipulatie, identificatie van neoplastische veranderingen en hun relatie tot de stadia van progressie van kanker in de mens5. Een belangrijk kenmerk van de muis prostaat, die moet worden meegenomen tijdens het bestuderen van ieder prostaat GEMM model is de aanwezigheid van vier verschillende combinaties van kwabben: anterieure, laterale ventrale en dorsale. De lobben vertonen aanzienlijke verschillen in de histopathologie en gen expressie patroon6. Probasin eiwit-expressiepatroon kan variëren tussen de lobben in jonge na puberteit muizen7, die moet worden beschouwd aangezien Cre gebaseerde GEMM modellen zijn meestal ontworpen met behulp van een probasin gebaseerde promotor genaamd Pb-Cre47. De resulterende ruimtelijke en temporele verschillen in Cre expressie vaak leiden tot verschillen in de tumor initiatie en progressie tijdlijnen evenals verschillen in neoplastische veranderingen tussen de lobben. Dus, het is belangrijk om goed voor dergelijke verschillen terwijl het bestuderen van de ontwikkeling van de tumor in de prostaat GEMMs, en de individuele lobben kunnen moeten afzonderlijk worden beoordeeld om reproduceerbare resultaten te bereiken. Het eerste deel van dit artikel beschrijft de juiste methoden ontleden een muis prostaat, identificeren en elke kwab scheiden en herkennen de histologische verschillen tussen de lobben.

Terwijl de analyse van tumorgroei en histopathologisch onderzoek waardevolle verwerven in de ontwikkeling van tumor inzicht kan, bieden ze niet veel informatie over moleculaire mechanismen. Het mechanisme van de ontwikkeling van de tumor en de progressie te studeren, is het vaak nuttig om te analyseren de tumor cellen in vitro. Verschillende methoden hebben gesuggereerd door de jaren heen waarbij culturen van deze cellen, met inbegrip van opschorting culturen, 3D culturen8 en onlangs, regelmatige 2D9culturen. Overwegende dat de meeste van deze methoden leiden tot goede cel overleving en proliferatie tarieven, bieden de 3D culturen een omgeving die zich het dichtst bij de fysiologische omstandigheden. In 3D of sferoïde culturen geteeld in een kelder membraan extracellulaire matrix (ECM), zijn de volledig gedifferentieerde luminal cellen meestal zeer laag overlevingspercentage; echter, de basale en tussenliggende cellen (voornamelijk stamcellen) kunnen uitdragen en produceren van cel clusters genaamd spheroïden10. Dit maakt het geschikt voor de studie van een kanker omdat epitheliale kankers worden verondersteld te zijn afkomstig uit de cellen van de stam (volksmond bekend als de cellen van de stam van kanker)11. Het tweede deel van dit protocol beschrijft een methode voor het kweken van de prostaat cellen van de muis in 3D culturen. De resulterende sferen kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten downstream analyses, met inbegrip van de studie van de organoid morfologie en gedrag door levende cel imaging, immunofluorescentie kleuring voor verschillende eiwitten, en de studie van reacties op chemotherapeutische behandelingen.

Globaal, is het doel van dit protocol te schetsen van optimale methoden voor het gebruik van Muismodellen in prostaatkanker door het beschrijven van de anatomie en dissectie technieken van de prostaat van de muis en de verwerking van het weefsel voor sferoïde culturen en in vitro analyse .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muis experimenten die hier beschreven werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren in de institutionele IACUC goedgekeurde protocollen SUNY Upstate medische universiteit.

1. de dissectie van urogenitaal systeem (UGS)

Opmerking: Het schema wordt weergegeven in Figuur 1.

  1. Een 3-maanden oude mannelijke C57BL/6 muis met de CO-2 respiratoire euthanasie-methode of een andere goedgekeurde techniek euthanaseren.
    Opmerking: Muizen tussen de leeftijden van 3 en 12 maanden kunnen worden gebruikt met succes voor het experiment. Oudere muizen (> 6 maanden) zal waarschijnlijk hebben meer vet rond de UGS, die moet worden gewist. Identificatie en scheiding van de kwabben is vaak moeilijk in muizen jonger dan 3 maanden. Andere spanningen kunnen worden gebruikt voor het experiment, als goed.
  2. Plaats de muis op de rug en beveiligen van de benen met pinnen, zodat de ventrale zijde van het dier wordt blootgesteld.
  3. 70% ethanol spray op de buik van de muis en maak deze schoon.
    Opmerking: Scheren het haar buik voordat dissectie niet vereist is.
  4. Til de huid van de buik, samen met de spier laag, met een paar middelgrote botte pincet en maak een omgekeerde Y-vormige insnijding op de buik met behulp van schaar.
    1. Controleer eerst een rechte snede met een scherpe schaar van net boven de penis naar het borstbeen (Figuur 2a).
    2. Gesneden uit de basis van de incisie naar elke teen, tot de dijen (Figuur 2b). Vouw terug de huid aan beide zijden en aan de onderkant te bekijken van de gehele buikstreek (Figuur 2 c-e).
      Opmerking: De gesneden grootte varieert afhankelijk van de leeftijd van de muis en de grootte. De grootte van de oorspronkelijke rechte snede kan variëren van 1,5 tot 4 cm, afhankelijk van de grootte van de muis.
  5. Beweeg over de andere organen om de UGS bloot te stellen. Tillen en verplaatsen van de bruin-geel darmen (figuur 2f). Pak de buik vet pads (het ondoorzichtige witte sponsachtige weefsel) met een tang en verplaats ze naar de zijkanten (Figuur 2 g).
    Opmerking: De UGS bestaat uit de zaadblaasjes, de urethra, de prostaat, de ductus deferens (zaadleider) en de urineblaas. Het kan worden geïdentificeerd door de karakteristieke combinatie van ondoorzichtige witte halfronde bogen (die de zaadblaasjes), met de vloeistof gevulde blaas sac gekoppeld aan de base. Het doorschijnend weefsel bevindt zich recht onder de zaadblaasjes is de prostaat.
  6. Zoek de UGS, stevig houdt de urineblaas met een botte Tang en til de hele UGS omhoog uit de buik van de muis.
    Opmerking: Als de blaas vol is, afvoer het eerst met een kleine injectiespuit op een betere grip voorzien van de verlostang en verminderen het risico van het bezwijken van de blaas.
  7. Verder optrekken op de blaas, dia een paar van schaar onder de blaas en prostaat helemaal aan de wervelkolom, en maken een cut. Eventuele resterende verbindingen naar de buikholte (Figuur 2 h en 2i) doorsnijden. Wees voorzichtig niet te dicht op de UGS om te voorkomen dat per ongeluk doorsnijden een prostaat weefsel gesneden.
    Opmerking: Tijdens het maken van de snede onder de UGS, de schaar moet worden ingevoegd helemaal aan de achterkant van de muis, zodat de cut snaps evenals de wervelkolom. Deze methode resulteert in het versnijden van bijna alle van de verbindingen tussen de UGS en de buikholte in een knipsel, verminderen de tijd die nodig is om uit te pakken van het weefsel van de muis.
  8. Verwijder de UGS en plaats het in 2-6 mL (genoeg ter dekking van het weefsel) van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of Dulbecco van bewerkt Eagle medium (DMEM, hoge glucose) in een 6 cm petrischaal (figuur 2j en 2 k) en verplaats het naar een dissectie Microscoop (10 X vergroting).
    Opmerking: Wijzig de ontleden media zoals vereist in de resterende stappen.

2. de ontrafeling van de prostaat

  1. Schakel al het vet uit de dorsale en ventrale weerszijden met een paar fijne pincet en microdissection schaar (Figuur 3a). Soortgelijke chirurgische instrumenten voor de rest van de dissectie-protocol gebruiken.
    Opmerking: Het vet is vaak nauw verweven met de UGS (kan worden geïdentificeerd door zijn witte sponsachtige verschijning); deze stap moet dus zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat per ongeluk uit een prostaat weefsel Knipprogramma. Het kan duren maximaal 10-15 min om al het vet.
  2. Houden en trekken van de blaas met de pincet en snip het aan de basis met de schaar (Figuur 3b).
  3. Plaats de resterende weefsel ventrale zijde omhoog. Houd één ductus deferens met pincet, traceren naar de basis met een schaar, en het (Figuur 3 c) snip, dan Herhaal aan de andere kant. Verwijderen van de ductus deferens, nu verlaten achter de prostaat (doorschijnend en verminous), zaadblaasjes (ondoorzichtig en witte, halfronde) en urethra (roze-rood en ondoorzichtige buis) (figuur 3d en 3e).
  4. Invoegen pincet tussen de binnenste boog van de zaadblaasjes en prostaat weefsel anterior lobben. Wrikken uit elkaar de zaadblaasjes en prostaat en eventuele bindweefsel als nodig (figuur 3f) snip. Traceert de zaadblaasjes naar hun basis in de urethra en verwijderen (Figuur 3 g en 3 h). Wees voorzichtig niet om hen doorprikken.
  5. Gaan ontleden uit de individuele prostaat lobben.

3. bruto anatomie van de prostaat en individuele Lobe Microdissection (cijfers 3i-n, figuur 4)

  1. Flip het weefsel met een paar van botte verlostang zodat de dorsale zijde gezichten, tonen de dorsale lobben, die zal lijken op de vleugels van een vlinder.
  2. De dorsale lobben verzamelen door de kwab met een tang en Knipprogramma op het honk met een schaar (figuur 3j).
  3. Flip-over het resterende weefsel aan de ventrale zijde.
  4. Verzamelen van de laterale lobben, die klein zijn en meestal wikkel de plasbuis aan de kant, die zijn ingeklemd tussen de lobben anterior ventrale en dorsale (Figuur 3 k).
  5. Vervolgens verzamelen de ventrale lobben, die zijn groter dan de laterale lobben en liggen op de urinebuis ventrally (Figuur 3 l).
  6. Laatste, oogsten van de voorste kwab, de grootste van de vier, door snijden en de urethra (Figuur 3 m) te verwijderen.
  7. De stukjes weefsel volgens experimentele behoeften te verwerken. Ga verder naar sectie 4 voor histologie, of sectie 5 voor de sferoïde cultuur.

4. lobe identificatie en morfologie van de haematoxyline en eosine gebeitste dia 's

  1. Los van het prostaat weefsel en inbedden in paraffine. Doorgaan met de dia's met haematoxyline en eosine (H & E) bekijken en identificeren van verschillen in de prostaat kwabben gebaseerd op histologie, met behulp van de kenmerken geschetst door Oliveira et al.kleuring. 12 (Figuur 5).

5. de verwerking van het weefsel voor 3D cultuur10

Opmerking: Dit is uiteengezet in Figuur 6.

  1. Doorgaan met het kweken van de hele prostaat of individuele lobben volgens de experimentele behoeften. Het prostaat weefsel overbrengen in een 10 cm schotel met 2-3 mL DMEM. Gehakt met een scalpel, de prostaat tubuli als fijn en gelijkmatig mogelijk onder de Microscoop dissectie.
  2. Ga verder met de overige stappen onder de motorkap van een weefselkweek, onder steriele omstandigheden.
  3. De stukjes weefsel samen met de DMEM overbrengen in een tube van 15 mL en verhoog het volume tot 9 mL met DMEM. 1 mL van 10 x collagenase stockoplossing toevoegen aan de DMEM-weefsel mengsel en vortex te mengen.
    Opmerking: Collagenase stockoplossing is 10 mg/mL in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium, en de uiteindelijke concentratie in de tube van 15 mL is 1 mg/mL.
  4. Plaats de buis op een rondgaand shaker of buis rotator gedurende 2 uur bij 37 ° C, voor de collagenase te degraderen de extracellulaire matrix.
  5. Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 2 mL zuiver warm 0.05% trypsine-EDTA aan de cel-cel en cel-matrix verklevingen te klieven. Overdracht van de buis tot 37 ° C gedurende 5 minuten.
    Opmerking: Als de stukjes weefsel te groot zijn om goed mengen, knip het uiteinde van de pipet met een scheermesje te maken van een grotere boring.
  7. Elk weefsel bosjes breken door pipetteren met een pipet P1000 8 - 10 keer en vervolgens herhalen met een pipet P200.
  8. Neutraliseer de trypsine met 3 mL van volledige DMEM. Toevoegen van 500 U DNAase ik toe en meng goed.
  9. Passeren een 5 mL-spuit 5 - 10 keer met een naald 18 G. Vervolgens passeren 5 keer met een naald van 20 G.
  10. Herhaal de stappen 4-8 eens te meer als de oplossing nog steeds grote weefsel brokken bevat.
  11. Filtreer de celsuspensie door een filter van de 40 μm geplaatst op een tube van 50 mL. Spoel de tube van 15 mL met 5 mL van DMEM en hetzelfde filter passeren. Herhaal de spoeling.
  12. Negeren van de filter en centrifugeren van de buis met de doorstroming bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

6. plating en kweken van de cellen

  1. Resuspendeer de pellet in 0,5 mL van volledige prostaat epitheliale cel groeimedium (PrEGM). Tellen van de celdichtheid met behulp van een item van de cel- of hemocytometer en verdunnen van de cellen tot 5 x 105 cellen/mL in volledige PrEGM.
    Opmerking: De opbrengst van een 3-maand-oude muis hele prostaat kan variëren van 3 x 10-5-106 cellen. Daarom is het belangrijk om in eerste instantie resuspendeer de pellet in niet meer dan 0,5 mL PrEGM (zoals hierboven vermeld) zodat de gewenste celdichtheid kan worden bereikt, zelfs met lage opbrengst.
  2. Mix het vereiste volume van cellen met het membraan van de kelder ECM in een 2:3 volumeverhouding (60% kelder membraan ECM en 40% celsuspensie) en plaat in een multi goed plaat of kamer dia volgens de experimentele behoeften.
    Opmerking: Voor immunokleuring, plaat op glazen-bodem platen of kamer dia's, die betrekking hebben op de gehele goed of midden van de put. Plaat rond de rand van de put als het tellen van de resulterende organoids of plaat als meerdere druppels heel goed als plating hogere volumes. Wees bewust niet om het te verspreiden te dik of te dun. Plaat van ten minste 100 µL van matrix-cel mengsel per 1 cm2 van plating gebied; bijvoorbeeld, in een dia van de kamer met een 2 cm2-goed oppervlakte, 200 µL van matrix-cel mengsel met 5 x 10,4 cellen moeten worden verguld.
  3. De plaat/dia overbrengen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 voor 30 min. voor het membraan van de kelder ECM te stollen. Dan, voeg voorverwarmde volledige PrEGM ter dekking van de put, niet te verstoren de membraan van de kelder ECM-stekker verzorgen.
  4. Verwijder de helft van de media en voeg verse media elke 2-3 dagen. Groeien spheroïden voor 5-10 dagen.
  5. Doorgaan met oogsten (stap 7), immunokleuring (stap 8), en/of imaging voor downstream toepassingen.

7. het oogsten van de bollen

  1. Om te oogsten bollen, gecombineerd de media zorgvuldig zonder verstoring van de stekker van de kelder membraan ECM-gel en voeg 1 mL 1 mg/mL dispase oplossing in PrEGM per 100 µL van kelder membraan ECM.
    Opmerking: Het is makkelijker om te oogsten van spheroïden als ze zijn verguld in het midden van het goed of de velg (in plaats van die betrekking hebben op de hele put), om ervoor te zorgen dat een voldoende hoeveelheid van de oplossing van de dispase kan worden toegevoegd aan de put.
  2. Schraap de onderkant van de plaat met een cel schraper te heffen uit de kelder membraan ECM gel in de dispase-PrEGM-oplossing.
  3. Pipetteer de gehele oplossing op en neer eenmaal met een breed boring 1000 µL Pipetteer tip of 5 mL pipet te breken van de stekker van de gel in kleinere stukken.
    Opmerking: Knip het puntje van een 1000 µL pipette uiteinde met een scheermesje te maken een breed boring tip.
  4. Incubeer in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 voor 1-2 h totdat de kelder membraan ECM heeft volledig is opgelost.
    Opmerking: Dit kan worden bereikt door visuele inspectie van de bodem goed terwijl het kantelen van de plaat om te bevestigen dat er geen meer brokken van gel blijven.
  5. Het verzamelen van de celsuspensie in een conische tube van 15 mL.
  6. Centrifugeer sferen bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verder met downstream toepassingen.

8. immunokleuring van de bollen13

Opmerking: Nadat de gewenste hoeveelheid tijd gegroeid spheroïden, de kelder membraan ECM kan worden ontbonden en sferen kunnen worden gekleurd, zoals beschreven in Colicino et al. 13.

  1. Kort, spoel de culturen met PBS en 4% paraformaldehyde (PFA) rechtstreeks toevoegen aan de stekker van de kelder membraan ECM-gel. Incubeer gedurende 30-90 minuten bij kamertemperatuur met langzame schudden, totdat de kelder membraan ECM volledig opgelost is, ter vervanging van verse PFA elke 30 min.
    Opmerking: De PFA zal los van de gel-stekker en positiebepaling van de spheroïden tijdens de duur van dit proces.
  2. Vervolgens wassen met PBS 3 keer en voeg 50 mM ammoniumchloride gedurende 10 minuten om elke autofluorescence van de PFA quench. Herhaal voor 3 wasbeurten met PBS.
  3. Permeabilize met 0,1% niet-ionogene wasmiddel voor 5 min en blok met PBSAT (PBS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100) gedurende 30 minuten.
  4. Met een primair antilichaam in PBSAT's nachts bij 4 ° C, gevolgd door 3 wasbeurten met PBSAT en een secundair antilichaam in PBSAT gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  5. Herhaal de wasbeurten met PBSAT en vlek met DAPI volgens protocol van de fabrikant, indien gewenst. Wassen van 3 of meer keer met PBS.
  6. Toevoegen van PBS met 200 mM 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) antifade-reagens en ga naar imaging.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prostaat lobben van de muis kunnen worden geïdentificeerd en ontleed met behulp van hun locaties met betrekking tot de zaadblaasjes en urethra. De muis prostaat is samengesteld uit 4 paren van kwabben dorsally gelegen en ventrally naar de zaadblaasjes en urethra. Figuur 4a en 4b (boven) weergeven de dorsale en ventrale kanten van de intact prostaat, samen met de zaadblaasjes en de urinebuis. De onderste panelen (Figuur...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit document schetst de methoden voor dissectie van de prostaat van de muis en de identificatie van individuele lobben. Ook beschreven is het protocol voor het kweken van de prostaat cellen van de muis in een 3D-cultuur voor in vitro analyse.

Een cruciale stap in het protocol van de dissectie is (1) oogsten het hele UGS uit de muis en het scheiden van de afzonderlijke organen onder een Microscoop dissectie. Het prostaat weefsel is zeer klein en omgeven door de rest van de UGS; Dus, he...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de subsidie van de National Cancer Institute, R01CA161018 naar LK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)World Precision InstrumentsMOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI mediumThermofisher Scientific11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)Thermofisher Scientific11965-084
Fetal Bovine SerumThermofisher Scientific10438018
PBS (Phosphate buffered saline)Thermofisher Scientific10010031
CollagenaseThermofisher Scientific17018029Maak 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilise, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermofisher Scientific25300054
DNase ISigma-Aldrich10104159001 ROCHE
Syringes and NeedlesFisher Scientific
Fisherbran Sterille Cell Strainers, 40μmFisher Scientific22-363-547
PrEGM BulletKit LonzaCC-3166Voeg alle componenten toe, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C.
Matrigel membrane matrixThermofisher ScientificCB-40234
Dispase II powderThermofisher Scientific17105041Maak 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilise, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
  2. Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111(2009).
  3. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  4. Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
  5. Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
  6. Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
  7. Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
  8. Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
  9. Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
  10. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
  11. Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
  12. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  13. Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
  14. Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
  15. Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238(2011).
  16. Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26(2012).
  17. Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Prostate LobesProstate Dissection3D Spheroid CultureCell IsolationTissue DigestionBasement MembraneExtracellular MatrixProstate Epithelial CellsOrganoid FormationBeta Catenin Staining

Related Articles