Een visuele gids voor het bestuderen van gedrags verdediging aan Pathogen aanslagen in blad-Cutting mieren

Samenvatting

In de blad-cutting mieren, presenteren wij een visuele ondersteuning om ziekte verdediging gedrag met afzonderlijke clips en de bijbehorende definities, geïllustreerd in een experimentele infectie scenario. Ons belangrijkste doel is om te helpen andere onderzoekers belangrijke defensief gedrag te herkennen en te zorgen voor een gemeenschappelijk begrip voor toekomstig onderzoek op dit gebied.

Samenvatting

De complexe levensstijl, evolutionaire geschiedenis van geavanceerde samenwerking en ziekte verdedigingen van blad-cutting mieren zijn goed bestudeerd. Hoewel tal van studies de problemen in verband met de verdediging van de ziekte en de bijbehorende gebruik van chemicaliën en antimicrobiële stoffen beschreven hebben, heeft geen gemeenschappelijke visuele melding is gemaakt. Het belangrijkste doel van deze studie was het opnemen van korte clips van gedragingen die betrokken zijn bij de verdediging van de ziekte, zowel prophylactically als rechtstreeks gericht op een antagonist van de kolonie na infectie. Te doen zodat we een experiment van de infectie, met sub kolonies van de blad-cutting ant soorten Acromyrmex echinatior, en de belangrijkste bekende pathogene bedreiging voor de mieren schimmel gewas gebruikt (Leucoagaricus gongylophorus), een gespecialiseerde pathogene schimmels van het geslacht Escovopsis. We gefilmd en ten opzichte van besmette en niet-geïnfecteerde koloniën, in zowel vroege als meer gevorderde stadia van de infectie. We gekwantificeerde belangrijke defensief gedrag over behandelingen en laten zien dat de gedragsmatige reactie op pathogene aanval waarschijnlijk tussen verschillende kasten van Arbeider mieren, en tussen de vroege en late detectie van een bedreiging varieert. Gebaseerd op deze opnames we een bibliotheek gedrags clips hebben, vergezeld van de definities van de belangrijkste afzonderlijke defensief gedrag. We verwachten dat zulk een gids kan een gemeenschappelijk referentiekader voor andere onderzoekers die werken op dit gebied bieden, te herkennen en bestuderen van deze gedragingen, en ook meer mogelijkheden bieden voor het vergelijken van verschillende studies om te helpen uiteindelijk beter begrijpen van de rol deze problemen spelen in de verdediging van de ziekte.

Inleiding

Blad-cutting mieren zijn geavanceerde sociale insecten, vormen enkele van de meest complexe kolonies op aarde. Ze zijn een afgeleide tak van de schimmel groeiende mieren (stam Attini) bestaande uit de twee geslachten Acromyrmex en Atta¹. Ze kweken de schimmel gewas soorten Leucoagaricus gongylophorus (Basidiomycota: Agaricales), waarop zij vertrouwen als hun voornaamste voedsel bron^2,3. De mieren leveren deze schimmel met verse blad materiaal voor de groei, en de schimmel produceert in ruil voedselrijke gezwollen hyphal tips (gongylidia) die door de mieren en hun brood worden verbruikt. Kolonies zijn ondergronds gebouwd, de schimmel gewas wordt gehandhaafd in externe tuinen^4,5, en de mier boeren hun gewas monocultuur behoeden voor mogelijke ziekteverwekkers^{6,7,8 ,9,10,11,12}. Kolonies verdelen arbeid tussen werknemers van verschillende grootte (kaste) en leeftijd^13,14,15, die zich tot de verdediging van de mieren en gewas van ziekteverwekkers uitstrekt.

We kunnen verwachten dat de blad-cutting mier kolonies kwetsbaar voor ziekte zou moeten zijn. Groep levende verwachting om verspreiding van ziekten tussen verwante werknemers als gevolg van frequente interactie en dus gemakkelijker transmissie¹⁶. De mieren zijn vatbaar voor entomopathogene schimmels parasieten, zoals Metarhizium soorten en Beauveria bassiana⁶. Deze parasieten zijn generalisten en zijn vaak aanwezig in de grond dicht bij de nesten^7,8. Landbouw van het gewas van de schimmel, zoals een monocultuur^4,maakt⁵ het waarschijnlijk ook vatbaar voor ziekte^17,18. Het kan worden besmet door schimmel parasieten generalist (met inbegrip van Aspergillus niger en Trichoderma soorten³); echter, de belangrijkste bedreiging is een specialist necrotrophic schimmel in het geslacht Escovopsis (ascomyceten: Hypocreales)¹¹. Door afscheiding van de mycolytic enzymen en andere verbindingen, Escovopsis doodt en voedingsstoffen verkrijgt van de schimmel gewas¹², met mogelijk fatale gevolgen voor de mier kolonies^11,19.

Ter bestrijding van de bedreigingen van de ziekte, hebben de mieren opmerkelijke verdediging op zowel individu als kolonie niveau, combineren biologische bestrijding, gedrags- en chemische verdediging te treden prophylactically en, wanneer nodig, in reactie op de infectie. Collectief, die afweer voorkomen of beperken van de gevolgen van infecties van zowel generalistische pathogenen en specialisten zoals Escovopsis. Ze betrekken in het algemeen het vermijden van de samentrekking van parasieten in de omgeving²⁰, preventie van parasieten uit het invoeren van het nest en beperking van de verspreiding van de infectie binnen nesten. De eerste regels van defensie bevatten chemicaliën uit klierweefsel afscheidingen^{3,21,22,23,24,25,26, 27} desinfecteren plant substraten, door werknemers likken ze vóór opneming in de tuin van de schimmel, en mieren uitvoeren van zowel zelf- en allogrooming. Wanneer grooming zich, met name bij binnenkomst van het nest, kunnen werknemers zure fecale afscheidingen ook toepassen op hun lichaam²⁷. Deze profylactische verdedigingen zijn aantoonbaar belangrijk te voorkomen dat infectie door pathogene bedreigingen^{6,7,8,9,10,11, 12}.

Als eerste verdediging mislukken en een ziekteverwekker zoals Escovopsis slaagt in het invoeren van het nest en de tuin van de schimmel, en infectie in een vroeg stadium wordt ontdekt, de mieren gebruiken schimmel verzorgen te verwijderen sporen^25,28_. De mieren kunnen toepassen afscheidingen van de metapleural klieren of overbrengen van de sporen naar de infrabuccal zak (een mondholte), waar ze worden gemengd met een chemische cocktail met metapleural en labiaal klier afscheidingen²⁶. Er zijn meer dan 20 bekende verbindingen in deze klieren, met inbegrip van de γ - keto-, carboxylic- en indoleactic zuren³. Deze zijn actief toegepaste²⁵, hebben antibiotica, fungistatische en schimmeldodende eigenschappen²⁹en Escovopsis spore kiemkracht³⁰kunnen remmen. Sporen in de zak infrabuccal opgeslagen zijn later verdreven buiten de kolonie^31,32. De meeste van deze schimmel verzorgen na beginnende detectie wordt uitgevoerd door minderjarige werknemers^28,33. Echter als een ziekteverwekker beheert om ontdekking te voorkomen en in de tuin van de schimmel verspreidt, zowel kleine en grote werknemers onkruid besmette onderdelen van de schimmel²⁸, en dit verwijderd materiaal buiten het nest³¹wordt gestort. Bovendien, soort van het geslacht van de blad-cutting Acromyrmex gebruiken biologische bestrijding in de vorm van antibiotica geproduceerd door symbiotische Straalzwammen^34,35,^,36— bijgehouden op de mier cuticula³⁷van overwegend jonge grote werknemers^34,38,39,40— tot verbindingen produceren die voorkomen mycelial groei van Escovopsis dat ^{34 , 38 , 41}. deze antibiotica productie kan op zijn beurt worden geschaad door Escovopsis-verbindingen tijdens een infectie¹⁹geproduceerd.

Figuur 1: Ant morfologische kenmerken. Een schematische tekening van een mier tonen de morfologische structuur vermeld in het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Blad-cutting ant verdediging vormen een geïntegreerde vergadering van gedrags- en chemische mechanismen die deze mieren collectief voorzien van zeer efficiënte bescherming tegen ziekte⁴². Inzicht in deze verdediging is van groot belang, en ze zijn uitgebreid onderzocht^{16,20,42,43,44}. Een visuele compilatie van het defensief gedrag dat ondubbelzinnige definitie helpen zou en beschrijving van hen voor systematische gebruik door onderzoekers is echter, om onze kennis, niet beschikbaar. Hoewel de terminologie die wordt gebruikt om te beschrijven van ant gedrag is relatief gestandaardiseerd, is er dus geen zekerheid dat dezelfde gedrags feiten consequent in verschillende studies heten. Hier is ons belangrijkste doel is om dit te verhelpen door het verstrekken van duidelijkheid en normalisatie via een compilatie van video-opnamen van individuele profylactische en defensief gedrag, vergezeld van de bijbehorende definities. We deze clips gefilmd tijdens een gedrags-experiment, waarin we waargenomen en gekwantificeerd gedrag in de context van experimentele Escovopsis infecties van Acromyrmex echinatior sub kolonies, waarvan de resultaten ook we hier presenteren als een illustratief voorbeeld van hoe deze compilatie kan worden gebruikt voor behavioral studies.

Protocol

1. Escovopsis -isolatie

1. Isoleren Escovopsis stammen uit Acromyrmex echinatior laboratorium koloniën, door het plaatsen van schimmel tuin fragmenten, met mieren verwijderd, over een petrischaal met vochtige watten voor meerdere dagen totdat Escovopsis kiemt en sporulates. Sporen overbrengen in aardappel dextrose agar platen (PDA, 39 g/L) en Incubeer bij ca. 23° C gedurende ongeveer twee weken.
   Opmerking: Een stam werd gebruikt in de huidige studie.
2. Gebruik een steriele naald te halen uit de rijpe sporen van deze eerste platen. Kies genoeg sporen ter dekking van de punt van de naald.
3. Sporen op nieuwe platen onder steriele omstandigheden beënten en incuberen bij ~ 23 ° C gedurende ongeveer twee weken.
4. Wanneer schimmeldraden bedekt de hele plaat en uitgegroeid tot een volwassen bruine sporen, herhaal stap 1.3 maar ditmaal met sporen van de nieuwe PDA-plaat.
5. Herhaal het proces totdat een schone voorraad van Escovopsis voor elke stam is verworven (geen zichtbare verontreinigingen groeien op of onder het oppervlak van de plaat).

2. experimentele opstelling

1. Gebruik drie A. echinatior kolonies.
   Opmerking: Hier de kolonies, Ae160b, Ae322 en Ae263 werden gebruikt.
2. Maken van elke kolonie, 12 sub kolonies. Zes sub kolonies voor observatie na 0 h en zes sub kolonies voor observatie na 72 uur maken. Dit geeft een totaal van 36 sub kolonies; Mark de helft van de sub kolonies van elke 'bovenliggende' kolonie als controle, en de andere helft als'Escovopsis behandeling'.
   Opmerking: Terwijl in bovenliggende kolonies de aanwezigheid van een koningin is van invloed op gedrag van de werknemer, we verwachten (hoewel dit kan niet worden gegarandeerd), dat de koningin-minder sub kolonies dreigen te gedragen als queenright kolonies voor de korte periode waarin het experiment wordt uitgevoerd.
3. Voor elke sub kolonie, gebruikt u een vierkante doos van lengte: ~ 3.15 in (8 cm), breedte: ~ 2,17 in (5,5 cm) en diepte ~ 1.77 in (4,5 cm).
   Opmerking: Het belangrijke punt wil bieden voldoende ruimte voor mieren buiten het fragment van de schimmel te foerageren en het dumpen van afval, maar tegelijkertijd om het vak klein genoeg dat filmen en gedrag erkenning haalbaar is.
4. Voor elke sub kolonie, voeg een thee-lepel formaat (ongeveer 2,2 cm³ en 1.2 g) stukje van het centrale deel van de schimmel tuin (L. gongylophorus) uit de oorspronkelijke kolonie, een paar van Braam bladeren, en een stuk van watten gedrenkt in water.
   Opmerking: De watten biedt vochtigheid. Het moet niet worden druipend van het water en de tuin van de schimmel niet moet aanraken.
5. Gebruik een inenting lus voor sub kolonies behandeld met Escovopsis, en vullen van de opening, dus het enkel door Escovopsis sporen gedekt is. Beënt de sporen door zachtjes te tikken op een klein, gelokaliseerde deel van de schimmel tuin tien tot twintig keer zodat sporen zijn ook niet geclusterd.
6. Voor sub kolonies gebruikt als besturingselementen, de toepassing van Escovopsis naar de tuin van de schimmel met een steriele inoculatie lus na te bootsen.
   Opmerking: Hoewel dit niet in het huidige experiment gebeurde, de inoculatie van een steriel poeder (zoals grafiet of talkpoeder) kan worden gedaan in dit stadium te onderscheiden van een infectie met een pathogeen en een inerte agent.
7. Voor 72 h opmerkingen, laat de helft van de sub koloniën (zowel besturingselementen en geïnfecteerde) voor 72 uur na de invoering van Escovopsis voor het toevoegen van mieren of video-opname te starten.
   Opmerking: 72 h in de afwezigheid van mieren wachten maakt het waarschijnlijk dat de Escovopsis sporen zullen ontkiemen (ongepubliceerde in vitro gegevens); Hoewel dit verhoogt ook de kans op andere infecties (bijvoorbeeld van een schimmel die al aanwezig zijn in de tuin van de schimmel), is deze periode beter voor deze behandeling van het beginstadium van een gevestigde infectie vertegenwoordigen.
8. Voor 0 h opmerkingen, direct na stap 2.6 en ongeveer 30 minuten voordat u gaat opnemen, twee brood, vier kleine de werknemers en vier grote tegelijk toevoegen uit de bovenliggende kolonie aan elk vak.
   1. Gebruik twee grote werknemers uit binnen de tuin die jonge met lichte pigment, met Straalzwammen die het grootste deel van de cuticle bestaat. Neem de andere twee uit buiten de tuin, met donker pigment en Straalzwammen maar het beslaat wel het laterocervical platen.
9. Herhaal voor 72 h opmerkingen, 2.8 en 2.8.1 op 30 min voordat u gaat opnemen, dat wil zeggen, 71.5 h na inoculatie met Escovopsis.
   Opmerking: Experimentele sub kolonies zijn aanzienlijk kleiner dan gevestigde natuurlijke Acromyrmex kolonies. Dit is nodig om gedrag accuraat te registreren. Terwijl dit invloed kan zijn op de frequentie van sommige gedragingen kwalitatief, werd de samenstelling van de sub kolonies gekozen om na te denken van de mix van werknemers in natuurlijke koloniën aan waarschijnlijker kwalitatief de gedrags interacties.

3. video-opname en het scoren van gedrag

1. Gebruik een USB-endoscoop aangesloten op een laptop (of gelijkwaardig) en zorgen voor voldoende licht.
2. Uitvoeren voor elk sub kolonie, video-opname voor 4 uur (vanaf 0 h of 72 uur na besmetting).
3. Review na het opnemen van de 36 sub kolonies, alle gedragingen van belang op het totaal van 144 h van beeldmateriaal en score van alle individuen in elk sub kolonie.
   Opmerking: In de huidige experimentele voorbeeld, we moesten uitsluiten van twee sub koloniën (een besturingselement uit de kolonie Ae160b) en een behandeling sub kolonie uit kolonie Ae322 als gevolg van infectie met schimmels dan Escovopsis, vermindering van het totale aantal uren van opmerkingen op 136.
4. Telkens wanneer die een probleem wordt waargenomen, het opnemen als 1 exemplaar.
   Opmerking: Een gedrag kan worden voor korte of lange duur, maar alleen de score het als > 1 als het wordt onderbroken door een ander gedrag, of als de mier is passieve voor een periode van tijd.

4. gedrag

Opmerking: Behavioral definities werden gemaakt met behulp van een combinatie van beschrijvingen van eerdere studies^{23,27,28,31,45} en persoonlijke opmerkingen willen maken. Voor een gedetailleerde illustratie presentatie van belangrijke morfologische structuren gebruikt in het protocol voor erkenning van gedrag, Zie Figuur 1.

1. Zelf verzorgen en antenne schoonmaken (Video 1)
   1. Zoals u ziet, als de mier been beweging stopt te leiden zelf verzorgen. Controleer of de antennes worden via de antenne schoonmakers op de voorpoten (Figuur 1) opgehaald, een klem-achtige structuur gelegen op het scheenbeen-tarsus gewricht dat bestaat uit een inkeping geconfronteerd met een uitloper met verschillende grootte borstels en kammen^{45, 46}.
   2. Na het schoonmaken van de antenne, Let op dat de mier de benen en de antenne schoonmakers, zal schoon door te trekken van de benen door de monddelen, het verwijderen van deeltjes en potentiële ziekteverwekkers met de glossa (Figuur 1).
      Opmerking: Zelf grooming kan bestaan uit het schoonmaken van de antenne en vervolgens de antenne schoonmakers (Figuur 1), maar ook met behulp van monddelen de benen schoon te maken. Als een mier is het reinigen van haar benen, reinigt het vaakst alle zes poten in successie.
2. Schimmel verzorgen (Video 2)
   1. Bericht als de mier been bewegingen op een vast punt op de tuin van de schimmel stopt. Vaststellen dat de antennes zijn onbeweeglijk en parallelle wees vooruit naar de schimmel zodat de hoek tussen de scape en funiculus (Figuur 1) ongeveer 45 is °, en het uiteinde van de antennes elkaar bijna raken elkaar, dicht bij de toppen van de kaken ( Figuur 1).
   2. Merk op dat de bovenste (maxillae) en lagere (labium) monddelen openstaan, met de opkomst van de glossa (Figuur 1) te likken van de schimmel.
3. Allogrooming (Video 3)
   1. Dit gedrag observeren wanneer één of meer mieren hebben benaderd, een andere (ontvanger) ant of vice versa. Tijdens het gedrag, de mieren stoppen beweging en staan nauw samen met fysiek contact. De grooming ant(s) kan iets bewegen ter dekking van een groter gebied van de ontvangende ant's lichaam.
   2. Let op dat de antennes van de partij(en) onbeweeglijk en puntige naar een specifiek punt van de ontvangende ant of verplaatsen en licht te tikken op de ontvanger kunnen zijn. De hoek tussen de scape en de funiculus (Figuur 1) is ongeveer 45 ° afhankelijk van of ze zijn vastgesteld op een bepaald punt of te tikken. De toppen van de actor's antennes zijn meestal dicht bij elkaar en de toppen van de kaken (Figuur 1).
   3. Merk op dat de bovenste (maxillae) en lagere (labium) monddelen openstaan, met de opkomst van de glossa (Figuur 1) te likken de ontvanger mier.
4. Metapleural klier verzorgen (Video 4)
   1. Let op wanneer de mier stopt verkeer te leiden metapleural klier (Figuur 1) verzorgen. Merk op dat de mier naar één kant leunt te bereiken een van zijn voorpoten rug te wrijven de opening (neusgang) van de klier metapleural (bijvoorbeeld, het rechter voorpand been).
      Opmerking: De andere voorste been is gelijktijdig (in dit voorbeeld de linker voorste been) likte door de glossa (Figuur 1).
   2. Controleer of de mier naar de overkant leunt en benen schakelt en het dezelfde beweging met de tegenovergestelde benen herhaalt. De mier blijft bewegen van de voorpoten, aan de metapleural klieren en vervolgens aan de glossa constant schakelen tussen benen (Figuur 1).
      Opmerking: In dit voorbeeld de mier nu passeert de linker voorste been de klier metapleural en het rechter voorpand been aan de glossa (Figuur 1). Na metapleural klier (Figuur 1) verzorgen, initieert de mier vaak zelf verzorgen (stap 4.1).
5. Spore wieden (Video 5)
   1. Observeren dit gedrag wanneer de mier been bewegingen op een vast punt op de tuin van de schimmel stopt. Let op dat de antennes zijn onbeweeglijk en parallel, wees vooruit naar de schimmel zodat de hoek tussen de scape en funiculus is ongeveer 45°, en de toppen van de antennes bijna elkaar en de toppen van de kaken (Figuur 1 raken elkaar).
   2. Controleer dat de mier haar kaken (Figuur 1) te grijpen van de zichtbare sporen van de Escovopsis en hen loskoppelen van de schimmel gewas wordt geopend door te trekken ze af. De mier draagt de cluster van sporen uit het nest, terwijl de antennes zachtjes voor oriëntatie evolueren. De antennes kunnen worden gereinigd door de antenne schoonmakers (Figuur 1; Zie Video 1) terwijl het cluster van sporen. De mier zet de sporen af in een afval stapel.
      Opmerking: Opname van activiteit rond de afval stapel gebeurde niet in het huidige experiment maar zou een geschikt verlenging van het huidige protocol.
6. Schimmel wieden (Video 6)
   1. Observeren dit gedrag wanneer de mier been bewegingen op een vast punt van de schimmel stopt. De antennes zijn losjes verwijst naar het deel van de schimmel die de mier probeert te verwijderen, terwijl het lichtjes te tikken op het stuk van de schimmel.
   2. Let op dat de mier zijn kaken aan beide knippen door de schimmel gewas gebruikt om een opgegeven gebied los te maken, of om te grijpen van een deel van het stuk van de schimmel met de kaken (Figuur 1). De mier zal gelijktijdig rots van links naar rechts op de benen, terwijl het trekt uit het stuk schimmel.
      Opmerking: Wieden kan worden gedaan door meerdere werknemers en door zowel de minderjarigen en de majors. Als zo, sommige mieren het snijden van de schimmel doen, anderen het schommelen en verrichten trekken motie. Het vrijstaande deel van de schimmel is uitgevoerd buiten het nest en afgezet in de afval stapel. Opname van de afval storting gebeurde niet in het huidige experiment maar zou een geschikt verlenging van het huidige protocol.
7. Fecale vloeistof verzorgen (Video 7)
   1. Observeren dit gedrag wanneer de mier been bewegingen op een vast punt op de tuin van de schimmel stopt. De mier buigt haar gaster (Figuur 1) en hoofd ten opzichte van elkaar toe te passen van een druppel van fecale vloeistof naar de monddelen.
   2. Let op dat de mier de voorpoten door de kaken (Figuur 1), één filter tegelijk trekt. Vervolgens beweegt de mier de antennes door de antenne schoonmakers (Figuur 1) gelegen op het scheenbeen-tarsus gewricht van de voorpoten.
8. Druppel regurgitatie (Video 8)
   1. Observeren dit gedrag wanneer de mier been bewegingen op een vast punt van de schimmel stopt. De antennes zijn onbeweeglijk en parallel, wees vooruit naar de schimmel zodat de hoek tussen de scape en funiculus is ongeveer 45°, en de toppen van de antennes bijna raken elkaar en de toppen van de kaken (Figuur 1).
   2. Let op dat de mier een druppel vloeistof op de schimmel, variërend van transparant licht geel of zelfs bruin, van haar monddelen uitbraakt.

Resultaten

De belangrijkste doelstelling van deze studie was de oprichting van korte clips die gedragingen die zijn gekoppeld aan de verdediging van de ziekte in de blad-cutting mieren, voor het genereren van een catalogus moet worden gebruikt als een verwijzing voor toekomstige studies illustreren. De studie gebruikt bovendien een voorbeeld van een experimentele opzet waarbinnen deze gedragingen werden gekwantificeerd om te laten zien hoe deze catalogus kan worden gebruikt in behavioral studies, die waarvan de representatieve resultaten we hier vatten.

Sub-Colonies werden opgericht voor observatie op vroeg stadium (0 h) en laat stadium (72 h) infectie. Als gevolg van zware infecties met schimmels dan Escovopsis na 72 uur, waren twee sub koloniën (één besturingselement voor kolonie Ae160b) en één behandeling tegen kolonie Ae322 uitgesloten, dus we de presentatie van de resultaten op het punt van de tijd 0 h richten en minder nadruk leggen op gedrag waargenomen na 72 uur. Na het filmen van alle sub kolonies en scoren het defensief gedrag, vonden we verschillen in gedragspatronen die is gekoppeld aan de tijd na infectie en context, met inbegrip van de verschillende manieren waarop ze werden gebruikt door werknemers van kleine en grote. Daarentegen werd zelf verzorgen en uitgevoerd bij allen tijde zowel controle besmette sub kolonies. Het was ook gemeenschappelijke toen mieren waren op zoek naar, en probeert te verwijderen, Escovopsis schimmeldraden of sporen. Omdat dit probleem zo universeel waargenomen en frequente in alle situaties was, deden wij niet kwantificeren.

Wij scoorde alle ander gedrag dat wordt beschreven in het protocol en de huidige berekende totale en gemiddelde frequenties voor kleine en grote werknemers per sub kolonie (tabel 1). We vonden dat in besturingselementen, minderjarige werknemers verzorgd de tuin gewas meer dan grote werknemers (Figuur 2a), en anekdotische waargenomen dat ze meer tijd in de tuin van de schimmel doorgebracht. In kolonies geïnfecteerd met Escovopsis was er een tendens voor grotere schimmel verzorgen over het geheel genomen ten opzichte van de kolonies van de controle, maar dit was niet significant (F_1,23 = 2,80, p = 0.1077; Tabel 2; Figuur 2 een). er werd een niet-aanzienlijke toename in fecale verzorgen met infectie (F_1,23 = 0,60, p = 0.4455; Tabel 1) maar geen verschil tussen kleine en grote werknemers (Figuur 2b). We waargenomen fecale grooming wanneer werknemers ingevoerd de schimmel, eerder dan toen ze op waren of volledig uit de buurt van de schimmel voor langere tijd.

Figuur 2: frequentie van grooming gebeurtenissen. Bedoel nummer (± standaardfouten (SE); n = 9) van (een) schimmel verzorgen en (b) fecale vloeistof verzorgen evenementen binnen vier uur na inoculatie, het vergelijken van kleine en grote werknemers in besturingselementen en Escovopsis behandelingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Verschillende gedragingen waren uiterst zeldzaam. Wij alleen waargenomen metapleural klier viermaal het verzorgen, en alle gevallen voorgedaan na 72 uur; eenmaal in de controlegroep, en driemaal in de kolonies met Escovopsis infectie (Zietabel 1). Bijna zo zelden, vonden we dat mieren een vloeibare droplet op de schimmel-tuin en een paar keer buiten de schimmel (tabel 1 rakelen zou). In de groepen 0 h gebeurde dit nadat een besturingselement sub kolonie en tweemaal besmette kolonies - in alle drie gevallen het gedrag werd uitgevoerd door een grote werknemer. Bij één gelegenheid herbevestigd een minderjarige werknemer een druppel in de hoek van het vak, en zodra een belangrijke werker deed hetzelfde op een blad van Braam, zowel in de Escovopsis behandeling. In de koloniën van 72 h, was druppel regurgitatie op de schimmel nooit waargenomen in de koloniën controle maar zeven keer gebeurd in de besmette kolonies. Zes daarvan waren belangrijke werknemers en drie van deze door een enkel individu die druppeltjes buiten de tuin schimmel toegevoegd.

Spore wieden (Figuur 3een) en schimmel wieden (Figuur 3b) waren beiden lage frequentie. Terwijl er geen significant verschil in de frequentie van de schimmel wieden tussen besmette kolonies en controle was, was er een neiging voor het wieden te verhogen met de tijd sinds de infectie (F_1,23= 2.91, p = 0.1014; Tabel 2). onze waarnemingen gericht op Escovopsis spore Wieden, die niet aanzienlijk met de tijd veranderen, maar er was een tendens voor een hogere frequentie in kolonies geïnfecteerd met Escovopsis dan in niet-geïnfecteerde besturingselementen (F_1,23 = 3.27, P = 0.0838; Tabel 2). minder sub kolonies geïnfecteerd met Escovopsis hadden zichtbare sporen overblijft na de observatieperiode met een beginnende infectie (Wanneer mieren werden ingevoerd na 0 h van spore inoculatie), met mieren door het verwijderen van alle sporen in bijna de helft van de sub koloniën (4 van 9; Figuur 3 c). In later stadium infecties (waar mieren werden ingevoerd na 72 uur van spore inoculatie), de mieren waren niet geschikt voor het verwijderen van sporen volledig in om het even welk van de sub kolonies. Samen genomen, suggereren deze opmerkingen een tendens voor mieren te verschuiven van spore wieden aan schimmel Wieden in de loop van een infectie.

Figuur 3: frequentie van het wieden gebeurtenissen. Bedoel frequentie (± standaardfouten (SE); n = 9) van (een) spore wieden (van Escovopsis sporen) en (b) schimmel wieden (Escovopsis of andere schimmels) tijdens een observatieperiode van 4 h, minderjarigen en majoors van behandelgroepen, vergelijken en (c) het aantal sub kolonies met zichtbare sporen van de Escovopsis in behandeling in groepen aan het einde van de waarnemingsperiode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

	Minderjarige werknemers - controle	Minderjarige werknemers - behandeling	Grote werknemers - controle	Grote werknemers - behandeling
0h
Schimmel verzorgen	84 (9.333)	131 (14.56)	37 (4.111)	66 (7.333)
Allogrooming	6 (0.6667)	14 (1.556)	5 (0.5556)	6 (0.6667)
Spore wieden	0	3	0	5 (0.5556)
Schimmel wieden	0	0	0	0
Fecale vloeistof verzorgen	46 (5.111)	69 (7.667)	27 (3.000)	48 (5.333)
Druppel toepassing	0	0	1 (0.1111)	2 (0.2220)
Metapleural klier verzorgen	0	0	0	0
72h
Schimmel verzorgen	10 (1.429)	45 (5.000)	24 (3.429)	38 (4.222)
Allogrooming	2 (0.2857)	10 (1.111)	1 (0.1110)	4 (0.4440)
Spore wieden	0	0	0	1 (0.1110)
Schimmel wieden	0	1 (0.1110)	0	2 (0.2220)
Fecale vloeistof verzorgen	19 (2.714)	38 (4.222)	30 (4.286)	30 (3.333)
Druppel toepassing	0	1 (0.1110)	0	6 (0.6667)
Metapleural klier verzorgen	0	2 (0.2220)	1 (0.1429)	1 (0.1110)

Tabel 1 : Het aantal gedragingen in vier uren van observatie op 0 en 72 h na Escovopsis inoculatie. Het gemiddelde totale aantal waarnemingen (met gemiddelde frequenties per individu haakjes), kleine en grote werknemers uit controle en Escovopsis infectie sub kolonies, respectievelijk vergelijken (n = 9).

Typebeproevingen 3 van vaste effecten
		Schimmel verzorgen				Allogrooming				Fecale verzorgen				Spore wieden				Schimmel wieden
Effecten		Num DF	Den DF	F-waarde	PR > F	Num DF	Den DF	F-waarde	PR > F	Num DF	Den DF	F-waarde	PR > F	Num DF	Den DF	F-waarde	PR > F	Num DF	Den DF	F-waarde	PR > F
Kolonie		2	23	0.77	0.4733	2	23	0.52	0.5989	2	23	0.54	0.5903	2	23	0.51	0.6052	2	23	1.17	0.3272
Sub kolonie (kolonie)		6	23	0.93	0.4892	6	23	0.51	0.7978	6	23	0.63	0.7067	6	23	1,67	0.1742	6	23	1.53	0.2127
Behandeling		1	23	2.8	0.1077	1	23	1,85	0.1875	1	23	0.6	0.4455	1	23	3.27	0.0838	1	23	1	0.3275
Tijd		1	23	6.53	0.0177	1	23	0.88	0.3574	1	23	0.97	0.3361	1	23	0,53	0.4742	1	23	2.91	0.1014

Tabel 2 : Statistische resultaten van de gemengde ANOVA tests op aparte gedrag waarvoor statistische analyses kunnen worden uitgevoerd. Vaste effecten waren kolonie, sub kolonie (genest kolonie), behandeling en tijd. Klik hier om te downloaden van deze tabel.

Video 1: zelf verzorgen en antenne schoonmaken. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 2: schimmel grooming. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 3: Allogrooming. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 4: Metapleural klier grooming. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 5: Spore wieden. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 6: schimmel wieden. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 7: fecale vloeistof grooming. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Video 8: druppel regurgitatie. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Discussie

De primaire doelstelling van deze studie was om te observeren en record defensief gedrag via karakteristiek blad-cutting-ant in aanwezigheid van schimmel-tuin infectie met Escovopsis, maken van referentie clips voor gebruik door de bredere wetenschappelijke gemeenschap. Opgemerkt moet worden dat deze gedragingen niet exclusief zijn tot verdediging van kolonies van Escovopsis, maar kan ook een rol spelen in de verdediging tegen andere verontreinigingen en infecties^{6,7,8,9 ,10,11,12}, en in de verdediging van de mieren zelf⁴². Ons protocol biedt een achtergrond voor breder onderzoek op verdediging in groeiende schimmel mieren. Dit is waarschijnlijk vooral nuttig zijn: (i) voor jonge onderzoekers die niet vertrouwd met deze gedragingen; (ii) om te zorgen voor consistente definities voor en observaties van gedragingen; (iii) te vergemakkelijken van vergelijkingen over studies en ant soorten; (iv) omdat een aantal van deze gedragingen zo zelden voor dat zelfs ervaren komen kan kunnen onderzoekers nooit hebben waargenomen (iv) omdat inzicht en het herkennen van gedrag in gecontroleerde omstandigheden in de help van het laboratorium studies in situ waar de omstandigheden moeilijker zijn te controleren.

De resultaten van onze gedrags studie stroken met eerdere werk waaruit bleek dat minderjarige werknemers schimmel bruidegom — cruciaal als een infectie vroegtijdig wordt ontdekt — meer dan grote werknemers^25,28,32. Hier, verhoogd grote werknemers de hoeveelheid schimmel verzorgen na Escovopsis infectie (Figuur 2een). Dit suggereert dat minderjarige werknemers zijn de overheersende schimmel trimmers, maar dat belangrijke werknemers kunnen helpen bij het voorkomen van de verspreiding van meer infecties vastgesteld. De grotere grote werknemers kunnen verwijderen sporen sneller, terwijl kleine werknemers meer geschikt voor het verwijderen van sporen minder toegankelijk zou kunnen worden. We vonden ook dat werknemers verwijderd sporen in ongeveer de helft van de besmette sub koloniën (vier van de negen) toen ze werden ingevoerd op het moment van infectie, en dus de pathogen vroege (Figuur 3c detecteren kon). Globaal, is deze verwijst naar een reeks van gedrags reacties waar de mieren eerst proberen om te stoppen Escovopsis infectie door het verwijderen van sporen (en doen dus voordat een infectie verspreidt), in plaats van het verwijderen van delen van de tuin van de schimmel (Figuur 3a, b. ). Dit verandert na verloop van tijd als de infectie vordert, wanneer mieren meer kans hebben om delen van de tuin van schimmel²⁸. Hoewel onze omvang van de steekproeven te klein zijn om overtuigend, en we kunnen niet uitsluiten dat gelijktijdige infecties wieden gedrag geïnduceerde, ondersteunt onze gegevens deze trend, met schimmel wieden voornamelijk aanwezig in latere stadia van de infectie (Figuur 3 een). De over het algemeen lage niveaus van schimmel wieden zou kunnen suggereren dat de mieren andere verdedigingen (bijvoorbeeldchemische stoffen) gebruikt om verdere groei van Escovopsisremmen of dat geen van onze experimentele sub koloniën te zwaar waren besmet (het maken van de meer destructieve verdediging geen onnodige).

Onze bevindingen suggereren dat zelf verzorgen met fecale vloeistof is kenmerkend voor mieren invoeren van de tuin van de schimmel, en gebruikt als een preventieve maatregel, in plaats van wordt geassocieerd met een infectie. Soortgelijke opmerkingen in stichtster vrouwtjes die bruidegom zelf en fecale druppels met hun mond overbrengen in hun benen, bij het invoeren van het nest hebben voorgedaan of hanteren van het gewas-²⁷. Een infectie zou in theorie vergroten de activiteit van de werknemers op de rand van de tuin van de schimmel, als het verwijderde besmette materiaal is uitgevoerd en in afval palen daalde Vandaar, fecale vloeistof grooming kan ook indirect verhogen tijdens de infectie te minimaliseren van de verspreiding van de ziekte. We zouden verwachten het tegenovergestelde patroon voor ernstige infecties, met verminderde beweging aan de rand van de tuin van de schimmel, als werknemers de schimmel verlaten of meer extreme zoals chemische defense maatregelen.

Terwijl fecale vloeistoffen als een belangrijke profylactische chemische voor een individu dienen kunnen, wordt allogrooming gebruikt door de nest-stuurlieden op andere werknemers als ze lichaamsvreemde deeltjes of microben detecteren. Het aanzienlijke verschil dat we waargenomen tussen de frequentie (tabel 1) van fecale vloeistof grooming (n = 304) en allogrooming (n = 48) kan wijzen op een verschil in pathogen detectie. Mieren zijn niet kundig voor speurder gemakkelijk ziekteverwekkers op zichzelf met hun antennes; allogrooming wordt aan de andere kant gedaan door de nest-mates, die kunnen het hele lichaam van een mier inspecteren en alleen kiezen voor een bruidegom indien nodig. Aangezien Escovopsis een parasiet van de schimmel tuin in plaats van de mieren, kan dit ook de lage hoeveelheid allogrooming verklaren.

We waargenomen zelden metapleural klier grooming, en alleen in de latere stadia van de infectie. Soorten schimmels groeiende mieren met overvloedige Pseudonocardia bacteriële cover bruidegom de klieren metapleural minder dan soorten met minder of geen betrekking heeft op^25,47. Zoals A. echinatior een overvloed aan de symbiont^{47 heeft}, kan dit verklaren de lage klier grooming frequentie. De secretie van de klier metapleural is ook duur om te produceren van³⁰, en voor langere tijd, wat betekent dat de noodzaak voor het verzorgen van de klier metapleural zeldzaam kan worden binnen de infrabuccal zak kan worden opgeslagen. Tijdens metapleural klier verzorgen, de mieren gelijktijdig schakelen poten en likken van het been, dat had net verzorgd de klier; de sporen worden aldus overgedragen aan de infrabuccal-zak, waar klier afscheidingen zijn essentieel voor de remming van Escovopsis' potentieel voor verdere ontkieming²⁵. Minderjarige werknemers zijn meer overvloedig in het nest en hebben groter metapleural klieren per eenheid lichaam massa³⁰, suggereert dat zij verantwoordelijk zijn voor de meerderheid van de metapleural klier afscheidingen. Dit kan ook verklaren waarom, in onze studie, de hoogste frequentie van schimmel grooming behoorde minderjarige werknemers.

We moeten observeren behavior(s) geven actieve gebruik van de antibiotica van de bacteriële symbiont Pseudonocardia, vaak waargenomen op de epidermis van Acromyrmex werknemers en bekend dat een rol spelen in de verdediging tegen Escovopsis ^{36 , 39 , 40}. de meest waarschijnlijke verklaring voor het niet naleven van dergelijk gedrag, is dat de toepassing van deze antibiotica kan worden opgenomen in andere gedragingen, zoals zichzelf verzorgen gevolgd door schimmel verzorgen en/of Wieden, waardoor het moeilijk te zien als een verschillende gedrag.

We hebben vastgesteld het ongebruikelijke gedrag van apen vloeibare druppeltjes op de tuin van de schimmel. Regurgitatie van voedsel voor nestmates is eerder beschreven in blad-cutting mieren²². In ons experiment verschilde druppels in kleur van transparant tot donkerbruin, suggereren ze kunnen worden een bron van voedsel voor andere mieren en/of water. Wij alleen waargenomen twee gelegenheden waar andere mieren dronken uit de druppels, dus we kunnen niet bepalen of de druppels andere mieren profiteren of dienen om te hydrateren van de schimmel, wanneer de luchtvochtigheid is laag. De meeste opmerkingen van dit probleem werden tijdens Escovopsis infecties, wat betekenen een defensieve rol, zoals immuun priming door regurgitatie van antimicrobiële peptiden^{16,48 dat zou}. We kunnen niet stevige conclusies trekken over dit omdat dit probleem zeldzaam was, maar het zou een interessante lijn om nader te onderzoeken, bijvoorbeeld door te bepalen of druppels antimicrobiële eigenschappen hebben.

Gezien dat observationele studies van de complexe defensief gedrag van blad-cutter mieren, met inbegrip van een vergelijking met en zonder tuin schimmel infectie zou zeer moeilijk te maken in het veld, experimentele gegevens kunnen waardevolle inzichten in deze gedragingen onder meer gecontroleerde omstandigheden. Terwijl de opmerkingen onder laboratoriumomstandigheden van de gedragingen gevonden onder natuurlijke omstandigheden afwijken kunnen, zoals onze catalogus van belangrijke defensief gedrag instrumenten moeten worden ontwikkeld, te verbeteren zowel experimentele en veld studies in de toekomst. De experimentele aanpak kan echter gedeeltelijk verklaren waarom sommige gedragingen waren uiterst zeldzaam (BV, allogrooming, metapleural klier grooming) in onze demonstratie van het gebruik van deze gedrags definities. Toekomstige studies overwegen daarom de beperkingen van deze experimentele opstelling, op zoek naar manieren om meer natuurlijke opmerkingen te maken. Bijkomende factoren kunnen ook worden geïntegreerd in het huidige protocol, zoals het onderscheid te maken tussen Straalzwammen-uitvoering (jongere) werknemers en oudere werknemers met minder overvloedige cover, die anders op de dreiging van een Escovopsis reageren kunnen infectie. Er zijn afwegingen tussen opmerkingen nauwkeuriger maken (bijvoorbeeld door te scoren focal personen), of met sub kolonie groter (groter aantal werknemers) en de hoeveelheid tijd of aantal sub kolonies of individuen die gefilmd kan worden op een bepaalde Wijs in de tijd. Toch, terwijl de set-up kan worden uitgebreid voor grotere behavioral studies met een focus op het aanpakken van een gedrags doel, in dit geval we gericht op met succes de presentatie van een methode voor het registreren en het definiëren van specifieke defensief gedrag.

We beschreven gedragingen die tot de verdediging in de blad-cutting mieren bijdragen en meer aanzienlijk, hebben systematisch geïdentificeerd, beschreven en defensief gedrag op film vastgelegd. Onze representatieve resultaten versterken andere onderzoek op dit gebied voorstellen waarom het is moeilijk voor een ziekteverwekker om met succes het infecteren van schimmel-landbouw mier kolonies, wanneer geconfronteerd met een uitgebreide van defensief gedrag set en toepassing van antimicrobiële bijbehorende verbindingen. Ons belangrijkste doel was om een nieuw instrument bieden voor de toekomstige werkzaamheden op dit gebied, en we hopen dat de gedrags catalogus zal waardevol zijn voor het beveiligen van consensus en gestroomlijnde definities, waarnemingen en interpretaties van gedrag, om te dienen als een belangrijke hulpbron voor toekomstig onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plastic boxes	N/A	N/A	Transparant. Lengte: 3,15 inch (8 cm), breedte: 2,17 inch (5,5 cm), diepte: 1,77 inch (4,5 cm)
Petrischalen	Sarstedt	82.1472	3,62x0,63 inch (9,2x1,6 cm)
Inoculatie-lussen	Labsolute	7696431	Disponibel 1uL. Lengte: 7,67 inch (19,5 cm)
Camera's	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscoopcamera
Camerahouders	N/A	N/A	Oude klemstandaard voor bekers.
Laptop	HP	N/A	Generieke laptop voor het opslaan van opnames.
Gebruikt programma op de laptop	Windows Movie maker	N/A
Pincetten	Vermandel	50.054	Zacht
Aardappel dextrose bouillon	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L