Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Sub acute cerebrale Microhemorrhages geïnduceerd door Lipopolysaccharide injectie bij ratten

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

17 oktober 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol om te induceren en te detecteren CMHs veroorzaakt door LPS injectie bij Sprague-Dawley ratten, die kan worden gebruikt in de toekomst onderzoek onderzoek naar de pathogenese van CMHs.

Samenvatting

Cerebrale microhemorrhages (CMHs) komen vaak voor bij oude patiënten en zijn gecorreleerd aan verschillende neuropsychiatrische aandoeningen. De etiologie van CMHs is complex, en neuroinflammation wordt vaak waargenomen als een co voorkomen. Hier beschrijven we een sub acute CMHs rat model geïnduceerd door injectie van het lipopolysaccharide (LPS), evenals een methode voor het opsporen van CMHs. systemische LPS injectie is relatief eenvoudig, economisch en kosteneffectieve. Een groot voordeel van LPS injectie, is zijn stabiliteit voor het opwekken van ontsteking. CMHs veroorzaakt door LPS injectie kon worden opgespoord door bruto observatie, haematoxyline en eosine (HE) kleuring, Perl's Pruisische kleuring, Evans blauw (EB) dubbel-labeling en magnetische resonantie beeldvorming-gevoeligheid gewogen imaging (MRI-Zwi) technologie. Ten slotte worden andere methoden van de ontwikkeling van diermodellen CMHs, met inbegrip van hun voordelen en/of nadelen, ook besproken in dit verslag.

Inleiding

Klassieke cerebrale microhemorrhages (CMHs) verwijzen naar gerelateerde kleine deposito's van bloed afbraakproducten zoals Hemosiderine van rode bloedcellen in de hersenen-1. Volgens de studie Rotterdam Scan kan CMHs worden gevonden in bijna 17,8% van de personen in de leeftijd 60-69 jaar en 38,3% in die meer dan 80 jaar2. De prevalentie van CMHs bij ouderen is relatief hoog, en een correlatie tussen de accumulatie van CMHs en cognitieve en neuropsychiatrische dysfunctie geweest gevestigde3,4. Verschillende dierlijke modellen van CMHs hebben onlangs gemeld, met inbegrip van knaagdier modellen geïnduceerd door type IV collagenase stereotaxic injectie5, APP transgene6, β-N-methylamino-L-alanine blootstelling7en hypertensie8, met CMHs geïnduceerd door systemische ontsteking als een van de meest goed geaccepteerde keuzes. Fisher et al. LPS afgeleid van Salmonella typhimurium 9 eerst gebruikt voor het ontwikkelen van een acute muismodel van CMHs. Later, dezelfde groep gemeld de ontwikkeling van een sub acute CMHs muismodel met behulp van de dezelfde benadering2.

LPS is beschouwd als een gestandaardiseerde inflammatoire prikkel via intraperitoneale injectie. Eerdere studies hebben bevestigd dat LPS injectie neuroinflammation veroorzaken kan, zoals blijkt uit de grote hoeveelheid microglia en Astrocyt activering in dierlijke2,10 modellen. Bovendien was het een positieve correlatie tussen de activering van de activering van het neuroinflammation en het aantal CMHs gevestigde2,10. Op basis van deze eerdere studies, werden we gevraagd om een CMHs rat model te ontwikkelen door intraperitoneale injectie van LPS.

Voorschotten in detectie technologieën hebben geresulteerd in een toename van het aantal onderzoeken van het onderzoek op CMHs. De meest algemeen erkend methoden voor het opsporen van CMHs omvatten de detectie van de rode bloedcellen door de haematoxyline en eosine (HE) kleuring, ijzer(III) ijzer detectie door Pruisisch blauw kleuring9, detectie van Evans (EB) afzetting door immunofluorescentie blauw beeldbewerking en 7.0 Tesla magnetische resonantie beeldvorming-gevoeligheid gewogen beeldvorming (MRI-Zwi)10. De huidige studie is gericht op het ontwikkelen van een methode van screening voor CMHs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van het PLA Army General Hospital.

1. materialen

  1. Voorbereiding van LPS injectie
    1. Voeg 25 mL gedestilleerd water tot 25 mg van LPS poeder een eindconcentratie van 1 mg/mL, afgeleid van S. typhimurium . Winkel de injectie in een steriele buis bij 4 ° C.
      Let op: LPS is giftig.
    2. Bereid een 2% EB oplossing in normale zoutoplossing 0,9% EB injectie om op te houden werken concentratie.

2. dieren

  1. LPS toedienen aan mannelijke ratten Sprague-Dawley (SD), 10 weken oud (gemiddeld gewicht: 280 ± 20 g) door intraperitoneale injectie.
    Let op: Als ratten zijn gekocht bij een andere organisatie, vervolgens de adaptieve fase mag niet minder dan 7 dagen.

3. LPS injecties

  1. Injecteren van LPS intraperitoneally in elke rat bij een dosis van 1 mg/kg en de rats terugkomen in hun kooi.
    Opmerking: Verdoving is niet nodig.
  2. Zes uur later, injecteren de dezelfde dosis van LPS injectie in de rats.
  3. Zestien uur later injecteren de dezelfde dosis van LPS in de rats.
    Let op: SD ratten injecteren met LPS bij een dosis van 1 mg/kg kan resulteren in een mortaliteit van 5%. Het sterftecijfer kan verdere toename van jongere of oudere ratten of zwangere vrouwelijke ratten.
  4. De rats terugkomen in hun kooien na injectie van LPS en ad libitum toegang bieden tot eten en drinken.
    Opmerking: Ratten zullen vertonen een duidelijke systemische inflammatoire respons, en is daarom essentieel dat de kooien schoon gedurende het gehele experiment blijven. Ratten moet worden regelmatig (2 x dag) monitoring voor gewicht, algemene uiterlijk en houding na de eerste injectie van LPS. Als de ratten begint te vertonen van een gebogen houding, onwil om te gaan, belangrijk gewichtsverlies (> 20%), porfyrine kleuring dat zij humaan euthanized voorafgaand aan de 7 dag EB studie eindpunt.

4. sample collectie

  1. EB injectie
    1. Zeven dagen na de eerste injectie, anesthetize de rat door intraperitoneally volgens uw goedgekeurde IACUC protocol.
    2. 1-2 min wachten voor de ratten vertonen geen hoornvlies reflex reacties. Uitvoeren van een 5-8 mm-diep cardiale lekke band op elke rat; het puncturing punt moeten 5 mm aan de linkermarge van borstbeen op de 3e en 4e intercostals ruimte.
    3. Wacht totdat het bloed herstel wordt waargenomen, en vervolgens EB injecteren bij een dosis van 0,2 mL/100 g lichaamsgewicht in het hart van de linker ventrikel.
      Let op: Cardiac punctie en EB injectie moeten zorgvuldig geschieden. EB kan worden geïnjecteerd in de borstholte of pericard in plaats van het hart van de linker ventrikel.
      1. Zuigen terug met een lege buis en dit volume te vervangen door een EB-buis vóór injectie te helpen verminderen van het percentage mislukkingen (bv., injectie ribbenkast door fout).
    4. Houd de rat in een liggende positie gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Als monster niet gebruikt wordt voor het detecteren van EB lekkage in immunofluorescentie beeldbewerking, dan deze stap kan worden weggelaten.
  2. Bruto observatie
    1. Uitvoeren van cardiale perfusions ijskoude 1 M fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) gebruiken om de cerebrale therapieën en de hersenen te ontruimen.
      1. Met behulp van een scalpel, maak een abdominale insnijding over de gehele lengte van het middenrif.
      2. Knippen door ribben net links van de middellijn van de ribbenkast.
      3. Toegankelijk opwaarts naar de borstholte. Gebruik klemmen om het hart bloot te stellen en om de afvoer van bloed en andere vloeistoffen.
      4. Terwijl gestaag het hart met een tang (het hart moet nog steeds worden gewonnen), direct invoegen van een naald in het uitsteeksel van het linkerventrikel te breiden dit tot ongeveer 5 mm. de naald op die positie veilig door klemmen in de buurt van het punt van binnenkomst.
        Let op: Doen buitensporig verlengt niet de naald, als het kan de interieur wand doorboren en het verkeer van oplossingen in gevaar te brengen.
      5. Laat de klep zodat de stroom ijskoude PBS oplossing (200-300 mL) in een langzame en gestage tempo van ongeveer 20 mL/min met behulp van een pomp perfusie. Als de dieren fixatie in plaats van bruto observatie moeten, gebruikt u dezelfde dosisniveaus van ijskoude zoutoplossing 0,9%.
      6. Maak met scherpe schaar een insnijding in het atrium, ervoor te zorgen dat de oplossing voortdurend stroomt. Als de vloeistof niet vrij stroomt of uit de neusgaten of de mond van het dier komt, verplaatsen de naald.
    2. Scherm voor CMHs door bruto observatie.
      Opmerking: Als het monster niet wordt gebruikt bij de berekening van het aantal CMHs door bruto observatie, dan deze stap kan worden weggelaten.
  3. Fixatie
    1. Uitvoeren van cardiale perfusions met ijskoude 0,9% zoutoplossing (200-300 mL) wissen van de cerebrale therapieën en hersenen.
    2. Cardiale perfusions met ijskoude 4% paraformaldehyde voor fixatie uitvoeren
    3. Onthoofden van ratten, isoleren van de hersenen en het onderdompelen van de hersenen in de 20% sacharoseoplossing voor ten minste 6 uur.
    4. Veranderen van de oplossing in 30% sacharose en moeilijke situatie voor een andere 6 h.
  4. 10 mm dik hersenen weefsels secties met behulp van een cryostaat voor te bereiden.

5. hij kleuring

Opmerking: Deze procedure wordt uitgevoerd met behulp van een hij kleuring Kit.

  1. Wassen van de dia's in gedestilleerd water.
  2. Vlek in de Haematoxyline oplossing gedurende 8 minuten wassen in stromend kraantjeswater voor 5 min.
  3. Differentiëren in 1% zuur alcohol voor 30 s. Wash in stromend kraantjeswater voor 1 min.
  4. Vlekken in 0,2% ammoniak water (blauwsel) of verzadigde lithium carbonaat oplossing voor 30 s tot 1 min. Wash in stromend kraantjeswater voor 5 min.
  5. Spoel in 95% alcohol (10 dips).
  6. Counterstain met eosine oplossing voor 30 s tot 1 min.
  7. Uitdrogen door 95% alcohol, twee wijzigingen van absolute alcohol, voor elke 5 min.
  8. Duidelijk in xyleen voor 30 s.
  9. Monteren met behulp van Liu methode9.
  10. Analyseren met behulp van een helderveld fluorescentie Microscoop.
    Opmerking: rode bloedcellen vrijgelaten uit de bloedvaten, die de onderdelen van CMHs zijn, verschijnt in rood-oranje onder hij kleuring.

6. Perl Pruisisch blauw kleuring

Opmerking: Deze procedure wordt uitgevoerd met behulp van een Perls kleuring Kit.

  1. Dia's met gedestilleerd water wassen.
  2. Vlek in reactie oplossing met gelijke delen mengsel van ferrocyanide en zoutzuur voor 10 min.
  3. Uitdrogen, duidelijk, monteren en analyseren van de dia's, zoals beschreven in stappen 5.7 – 5.10.

7. EB dubbel-kleuring

Opmerking: Deze procedure volgt stap 4.1.3.

  1. Wassen van dia's met PBS driemaal voor elke 5 min.
  2. Dia's met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  3. Wassen van de dia's met PBS oplossing drie keer, gedurende 5 minuten elk, en mount dia's met PBS-glycerol oplossing.
  4. Analyseren van beelden op een fluorescentie Microscoop. EB afzetting wordt aangegeven door rode fluorescentie; kernen worden aangegeven door blauwe fluorescentie.

8. MRI-SWI

  1. MRI op een 7-T magneet uitgerust met een actief afgeschermde kleurovergang systeem (16 cm-binnendiameter) uitvoeren.
  2. Zeven dagen na de behandeling, anesthetize de rats gelaatsmasker na inademing van 1,5-2,0% Isofluraan met behulp van een systeem van Isofluraan anesthesie.
  3. Dierenarts zalf op de ogen van de rat om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving toepassen.
  4. Houd de ratten in naar voren gebogen positie en uitvoeren van een scan MRI-SWI.
  5. Verkrijgen van SWI gewogen scans met behulp van een echo van de snel-spin-reeks met de volgende parameters: echo tijd (TE) 8 ms, herhaling tijd (TR) 40 ms, flip-hoek = 12°, beeldveld (FOV) 35 mm × 35 mm, overname matrix 384 × 384, verwerven van 1 mm dik-segmenten.
  6. CMHs in MRI-SWI volgens Greenberg et al. identificeren 11, waaronder de volgende criteria: (1) een diameter van ≤10 mm, en (2) circulaire, geïsoleerde en laag-signaal intensiteit vlekken.
  7. Aan het einde van het experiment, euthanaseren de ratten met behulp van de methode van de overdosis kooldioxide op (een stroom van 6 L/min) of 30% van het volume van de container.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

CMHs kunnen worden opgespoord met behulp van diverse benaderingen. De meest goed geaccepteerde methoden omvatten het volgende: (1) bruto observatie en evaluatie van oppervlakte CMHs (weergegeven in afbeelding 1, bovenste); (2) hij kleuring voor de opsporing van rode bloedcellen (afgebeeld in figuur 2A, bovenste deelvenster) of Pruisische kleuring detecting ijzer(III) ijzer afgeleid van lysis van de rode bloedcellen (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de afgelopen jaren toegenomen onderzoeken op CMHs. Het mechanisme van CMHs blijft echter onduidelijk is, te vragen wetenschappers om dierlijke modellen die deze bijzondere voorwaarde te simuleren. Bijvoorbeeld, Hoffmann et al. een hypoxie-geïnduceerde CMHs muismodel ontwikkeld dat laat zien dat CMHs worden veroorzaakt door hypoxie en verstoring van cerebrovasculaire autoregulatie12. Reuter et al. 5 een CMHs model in APP23-transgene muizen, waaruit bleek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken leraar Jian Feng Lei en collega's uit de hoofdstad Medizinische Universität voor begeleiding tijdens de MRI. Wij danken ook Jing Zeng van de afdeling Neurologie, de tweede Volksrepubliek ziekenhuis van Yichang voor het verstrekken van technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LPSSigma-AldrichL-2630voor ontstekingsinductie
EBSigma-aldrichE2129voor EB-lekdetectie
DAPI-kleuringsoplossingServicbioG1012tellingsmedium voor IF
Perl’s Pruisisch blauwkleuringSolarbioG1424Kit voor Pruisisch blauwkleuring
HE-kleuringSolarbioG1120Kit voor HE-kleuring
ChoralhydraatSigma-Aldrich47335UVoor anesthesie
Fosfaat bufferoplossing (PBS)SolarbioP1022Een soort bufferoplossing die veel wordt gebruikt in experimenten
0,9% zoutoplossingHainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaOplossing voor perfusie
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127Een soort oplossing die veel wordt gebruikt voor fixatie
20% sucrose-oplossingSolarbioG2461Een soort oplossing die veel wordt gebruikt voor fixatie
30% sucrose-oplossingSolarbioG2460Een soort oplossing die veel wordt gebruikt voor fixatie
diergeneeskundig zalfSolcoseryl ooggel, Bacel, ZwitserlandVoor de bescherming van rattenogen

Referenties

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22(2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441(2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822(2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Evans Blue-kleuringHematoxyline- en Eosine-kleuringPruisisch Blauw-kleuringMagnetic Resonance ImagingSusceptibility Weighted ImagingCardiale PerfusieBrain Tissue SectioningFluorescentiemicroscopie
Sub acute cerebrale Microhemorrhages geïnduceerd door Lipopolysaccharide injectie bij ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.