Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Summary

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Abstract

Secreted factoren, membraan-gebonden receptoren en hun interactie partners zijn belangrijkste regulatoren van cellulaire communicatie en initiatie van signalering cascades tijdens homeostase en ziekte, en als zodanig vertegenwoordigen voornaamste therapeutische doelen. Ondanks hun relevantie blijven deze interactienetwerken aanzienlijk ondervertegenwoordigde in huidige databanken; Daarom moeten de meest extracellulaire eiwitten geen gedocumenteerde bindende partner. Deze discrepantie is voornamelijk te wijten aan de uitdagingen in verband met de studie van de extracellulaire eiwitten, met inbegrip van expressie van functionele eiwitten, en de zwakke, lage affiniteit, eiwitinteractie vaak tot stand gebracht tussen oppervlakte cel receptoren. Het doel van deze methode is om te beschrijven van het afdrukken van een bibliotheek van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken voor screening van eiwit-eiwitinteractie. Als u wilt inschakelen van detectie van zwakke interacties, wordt een methode gebaseerd op multimerization van het query-eiwit onder studie beschreven. Gekoppeld aan deze benadering van de microbead gebaseerde multimerization voor verhoogde multivalency, maakt de eiwit microarray de robuuste ontdekking van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie in hoge-doorvoer. Deze methode biedt een snelle en lage monster consumeren-benadering voor de identificatie van nieuwe interacties die van toepassing zijn op elke extracellulaire proteïne. Eiwit microarray afdrukken en screening protocol worden beschreven. Deze technologie zal zitten nuttig voor onderzoekers op zoek naar een robuuste methode voor ontdekking eiwitinteractie in de extracellulaire ruimte.

Introduction

De hier besproken methode beschrijft het afdrukken van een verzameling van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken, gevolgd door een methode voor screening van een doelwit van belang tegen deze bibliotheek. We hebben eiwit multimerization aangewezen als een cruciale stap voor de detectie van interacties gekenmerkt door lage bindende verwantschappen. Om detectie van deze interacties te verbeteren, beschrijven we een protocol op basis van multimerization van de query-proteïne van belang met behulp van microbeads.

Uitgescheiden en cel oppervlak-uitgedrukt eiwitten (collectief genoemd extracellulaire eiwitten) samen met hun interacti....

Protocol

1. generatie van een bibliotheek van extracellulaire menselijke eiwitten

1. Een lijst samenstellen van cel oppervlakte receptoren of secreted proteïnen van belang voor de eiwit microarray bibliotheek bouwen. Specifieke proteïne families (bijvoorbeeld de immunoglobuline superfamilie) of eiwitten selectief aangegeven met name cel typen kunnen worden geselecteerd voor de studie.
2. Voor oppervlakte cel receptoren, bepalen de extracellulaire domeingrenzen (ECD) door het identificeren van de signaal-peptide en transmembraan regio's met behulp van softwaretools. Sommige van de relevante instrumenten, vrij beschikbare online, wordt verwezen in de Tabel ....

Results

Een schematische voorstelling van de workflow voor de extracellulaire eiwit microarray technologie is afgebeeld in Figuur 1. Zodra de microarray dia's met de extracellulaire proteïne bibliotheek beschikbaar zijn, kan de screening van de proteïne van belang en data analyse binnen één dag worden voltooid. Vele fysiologisch relevante interacties tussen membraan-embedded receptoren worden gekenmerkt door zeer zwak bindende kracht (K_D in de micromolar b.......

Discussion

Een aanzienlijk aantal gekoppelde receptoren blijven in het menselijk genoom, en roman interagerende partners blijven voor extracellulaire eiwitten met eerder gekarakteriseerd liganden ontstaan. Vaststelling van de receptor-ligand interacties in mens en modelorganismen is essentieel om te begrijpen van de mechanismen die de cellulaire communicatie tijdens de homeostase, evenals disregulatie leidt tot ziekte dicteren en daarom nieuwe of verbeterde kennis therapeutische opties. Detectie van extracellulaire eiwitinteractie .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides