Beoordelen van neuroprotectieve effecten van Glycyrrhizae Radix et Rhizoma uitpakken met behulp van een muismodel van voorbijgaande middelste cerebrale slagader occlusie

Samenvatting

In deze studie wijzigen we een bestaande experimentele methode meer reproduceerbare om resultaten te verkrijgen, door de oprichting van een muismodel van middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO). Orale toediening van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GR) methanol extract (GRex), na beroerte inductie, sterk gedaald totale infarct volume ten opzichte van de onbehandelde controlegroep.

Samenvatting

Ischemie gevolgd door reperfusie van de cerebrale bloedstroom na een beroerte leidt tot de dood van zenuwcellen en verlies van hersenweefsel. De meest gebruikte diermodel voor de studie van de lijn is het middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) model. Eerdere onderzoeken hebben verschillende infarct maten gemeld, zelfs wanneer dezelfde experimentele diersoort onder vergelijkbare omstandigheden van de MCAO werd gebruikt. Daarom ontwikkelden we een verbeterde experimentele methode om aan te pakken van deze discrepantie. Muizen werden onderworpen aan MCAO met behulp van een gloeidraad als de occlusie materiaal om menselijke beroerte omstandigheden nabootsen en dikte van de gloeidraad is geoptimaliseerd om meer reproduceerbare infarct volume. Muizen die zijn behandeld met een methanol extract van Glycyrrhizae Radix et wortelstok (GRex) na beroerte inductie toonde een aanzienlijk verminderde totale infarct volume en het toegenomen aantal overlevende cellen ten opzichte van de onbehandelde controlegroep. Dit experimenteel protocol met succes gewijzigd en reproducibly blijkt de gunstige invloed van GRex op ischemische beroerte.

Inleiding

Schade aan de hersenen veroorzaakt door ischemie en reperfusie van de cerebrale bloedstroom leidt tot de dood van zenuwcellen en verlies van hersenweefsel. Dit soort schade aan de hersenen blijft toenemen met de toenemende prevalentie van cerebrovasculaire ziekten als gevolg van de verspreiding van metabole ziekten zoals obesitas, hypertensie en diabetes mellitus^1,2. Het absolute aantal oudere patiënten met een beroerte is sterk toegenomen wereldwijd, en de kosten van medische zorg voor deze patiënten, die vaak met op lange termijn een handicap zitten, is een grote maatschappelijke Last. Daarom moeten secundaire een handicap zoveel mogelijk te verminderen van de economische last^1,2worden opgevangen.

De meest gebruikte knaagdier model van cerebrale infarct is het middelste cerebrale slagader (MCA) occlusie (MCAO) model, waarin de MCA is geroteerd met een silicium beklede chirurgische hechten gloeidraad voor het blokkeren van de bloedstroom, veroorzaakt ischemische beroerte^{3, 4}. met behulp van een gloeidraad als het occlusie-materiaal zorgt voor de controle van occlusie tijd en duurzaamheid door het manipuleren van de duur van de intra-luminal gloeidraad invoegpositie.

Eerdere studies hebben aangetoond dat zelfs wanneer hetzelfde knaagdier MCAO model wordt gebruikt, het totale volume van cerebrale infarct tussen experimenten varieert, veroorzaakt lage reproduceerbaarheid van de studies. We geoptimaliseerd om te verbeteren reproduceerbaarheid, de dikte van de gloeidraad munt gebruikt in het experiment. De resultaten van een voorstudie van de cerebrale ischemische periode en geïnduceerde infarct bleek dat een ischemische langer dan 60 min de volumetrische regio van mogen beschadigde hersenweefsel worden waargenomen en gekwantificeerd.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), ook bekend als zoethout, bestaat uit de gedroogde wortels en wortelstokken van Glycyrrhiza uralensis en G. glabra. Het is in de Chinese en Koreaanse traditionele geneeskunde gebruikt voor verschillende doeleinden, inclusief als een levensmiddelenadditief en medicinale^5,6,7.

In een eerdere studie⁸, voorbehandeling met GR methanol extract (GRex) toonde een anti-apoptotic effect bij MCAO muizen, met inbegrip van belangrijke preventie van de daling in de eiwit expressie van B-cel lymfoom 2 (Bcl-2) en Bcl-extra grote (Bcl-xL). Deze studie werd uitgevoerd om de reproduceerbaarheid van de conventionele muismodel van MCAO verbeteren door haar efficiëntie bij het bepalen of na infarct behandeling met GRex effectief verminderd het infarct volume in MCAO-induced cerebrale schade te evalueren.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de ethische commissie van Pusan National University (erkenningsnummer, PNU-2016-1087). Een grafisch overzicht van deze studie is afgebeeld in Figuur 1.

1. voorbereiding en toediening van GRex

Opmerking: De GR gebruikt in deze studie werd gekocht van een commerciële farmaceutisch bedrijf.

1. 200 g GR plaats in 2.000 mL methanol en Incubeer bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 5 dagen.
2. Filteren van het mengsel met behulp van filtreerpapier met 0,26 mm dikte en 5 µm poriegrootte en verwijder de bovendrijvende substantie. 1000 mL methanol Voeg aan het residu GR en filtert u opnieuw.
3. Combineren van de twee supernatant, filteren door filterpapier concentreren onder vacuüm en vervolgens het residu te produceren GRex freeze-dry.
4. Los van de GRex in dimethylsulfoxide (DMSO), verdund met 0,9% fysiologische zoutoplossing, en filtreer door een 0,45 µm spuit filter. Vervolgens aangepast, de uiteindelijke concentratie van DMSO < 5%.
5. Grijs (300 mg/kg lichaamsgewicht) 1 h na de reperfusie van MCAO via mondelinge maagsonde beheren. Beheren van DMSO verdund in een fysiologische zoutoplossing (10 mL/kg lichaamsgewicht) alleen voor de normale groep en de controlegroepen, respectievelijk.
   Opmerking: De concentratie van GRex gebruikt in dit experiment werd bepaald volgens de concentratie die actief zijn via onze eerdere studie⁸was.

2. muismodel van MCAO

1. Gebruik mannelijke C57BL/6 muizen veroudering 6 weken en met een gewicht van 22-25 g. bieden alle dieren met gratis toegang tot de standaard chow en water en huis hen in een omgeving met gecontroleerde temperatuur (22 ± 1 ° C) en een 12 h licht/donker cyclus.
   1. Verdeel de muizen in groepen van zes muizen per stuk, die moeten bestaan uit sham bediende normaal, controle en GRex behandelgroepen.
   2. MCAO chirurgie (wijziging van de methode van Koizumi et al. uitvoeren ⁹) over de controle en de GRex behandelgroepen met een stereomicroscoop.
2. Inademing verdoving in de muizen met behulp van 2% Isofluraan in 70% N₂O en 30% O₂induceren. Anesthesie wordt voldoende geacht wanneer de muis reageert niet op mechanische prikkel toegepast op zijn staart. Het handhaven van de lichaamstemperatuur van de muizen bij 36.5 ± 0,5 ° C met behulp van een lichaam temperatuur-bedrijf deken met een thermometer verbonden.
3. Verwijder al het haar op de borst en nek van de muizen door scheren gevolgd door gebruik van haar verwijdering room, de chirurgische site van huid met betadine scrub afgewisseld met alcohol voor twee keer desinfecteren en breng een insnede van ongeveer 2 cm lang met chirurgische Blade in het midden van de nek. Zorgvuldig isoleren de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA), externe halsslagader en de tak van de interne halsslagader uit de omliggende bindweefsel.
4. De externe halsslagader en de gemeenschappelijke halsslagader met een chirurgische hechtdraad (4-0 zijde hechtdraad, half hitch knoop) tijdelijk blokkeren de bloedstroom in de interne halsslagader afbinden tijdens de operatie.
5. Invoegen van een silicium-gecoat nylon Sutuur (geologie) (8-0 monofilamenten, 11 mm lang) via de interne halsslagader naar de oorsprong van de linker MCA. Aanpassen van de dikte van het silicium beklede deel van de gloeidraad naar een bereik van 0.10-0,12 mm.
6. Het meten van de afname van de relatieve cerebrale doorbloeding (rCBF) in het MCA met behulp van een laser Doppler debietmeter. MCAO zal bevestigd worden wanneer de rCBF wordt gehandhaafd op < 20% van de rust voorwaarde waarden tijdens de gehele periode van ischemische.
7. Los van de ingevoegde gloeidraad naar het bloedvat voor 2 h terwijl de cerebrale slagader is geroteerd, en vervolgens zorgvuldig trekken de gloeidraad om te herstellen van de bloedstroom voor 22u van reperfusie. Suture van de huid door naaien op 5 plaatsen (3-0 zijde hechtdraad, twee half haperingen knoop) en laat elke muis te ontwaken uit de narcose.
8. In de normale groep bewerking een schijnvertoning volgens dezelfde procedure hierboven (tot 2.4), met de volgende uitzondering. De gemeenschappelijke halsslagader afbinden en suture de ingesneden spieren en huid.

3. meting van Volume van beschadigde hersenweefsel

1. Na euthanasie van de muizen voor meting van de schade aan de hersenen met CO₂ inademing hersenen accijnzen de muis 24 uur na het begin van MCAO met behulp van iris chirurgische scharen en schuine pincet.
   1. Na het verwijderen van het hoofd met behulp van schaar, maak een incisie in de huid van de middellijn van het hoofd om te spiegelen over de huid van de schedel.
   2. De pariëtale botten breken met schuine pincet, peeling uit dura deeltjes op hetzelfde moment, en vervolgens het isoleren van de hersenen zorgvuldig van de schedel.
2. Knippen het verwijderde weefsel in secties (1 mm dik) met behulp van een matrix van de hersenen muis en vervolgens vlek de secties voor 17 min in een oplossing van 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC).
3. Los van de secties in 10% formaline voor ten minste 2 uur en dan fotograferen met een digitale camera. TTC worden om levensvatbare weefsel rode vlek, terwijl het necrotische gebieden wit zullen nageleefd.
4. Analyseren en kwantificeren van de cerebrale infarct gebied van elke sectie met behulp van ImageJ.

4. de haematoxyline en eosine (H & E) en Cresyl Violet kleuring van histologische secties

1. De muizen voor histologisch onderzoek euthanaseren CO₂ inademing en perfuse hen transcardially met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 10 mL 4% paraformaldehyde (PFA). Isoleren van de hersenen met behulp van dezelfde procedure als hierboven (3.1) en dompel de hersenen 10 ml van 30% sucrose's nachts.
2. Insluiten van het hersenweefsel in optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde en snijd het coronally in 15 µm-dik secties met behulp van een cryostaat. Monteer de secties op glas-dia's, gevolgd door de kleuring met haematoxyline en eosine (H & E) of cresyl violet.
3. Dia's glas in 80% ethanol voor 1 min, gevolgd door de kleuring in Haematoxyline oplossing gedurende 5 min. onderdompelen.
   1. Dompel de dia's in 1% zuur alcohol tweemaal, onderdompelen in verzadigde Lithiumcarbonaat oplossing voor 30 s, wassen met leidingwater voor 30 s, waarna counterstain in eosine oplossing voor 30 s.
   2. De dia's in leidingwater te spoelen, weken in 95% en absolute ethanol opeenvolgend.
   3. Drogen van de dia's, schakelt u hen in xyleen voor ten minste 10 min. en dan mount de coverslips met behulp van montage medium.
4. Plaats het glas dia's op een dia warmer gedurende ten minste 1 uur, gevolgd door onderdompeling in 50% ethanol verdund met chloroform's nachts.
   1. Vlek van de dia's met 0,1% cresyl violet gedurende 10 minuten in een droge oven 40 ° C.
   2. Onderdompelen in 95% ethanol voor 30 min en vervolgens uitdrogen in absolute ethanol voor 2 keer.
   3. 2 keer in xyleen voor 5 min Schakel en mount met montage medium na het drogen van de lucht.
5. Met behulp van een Microscoop, observeren de histologische veranderingen die zich hebben voorgedaan na MCAO-geïnduceerde hersenletsel.

5. statistische analyse

1. Geefderesultaten experimentele middelen ± standaardafwijking en bepalen van de statistische significantie tussen de groepen indelen met behulp van een one-way variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de Tukey post hoc analyse met behulp van een software van de analyse van gegevens.
2. Instellen van de statistische significantie op een p-waarde < 0.05.

Resultaten

In de normale groep sham bediende wordt geen cerebrale infarct waargenomen overwegende dat in de controlegroep, een relatief groot aantal beschadigde gebieden wordt waargenomen. In de muizen wordt door de overheid gereguleerde 300 mg/kg grijs in de MCAO Modelgroep, een statistisch significante afname van het beschadigde gedeelte waargenomen (Figuur 2).

De histologische wijzigingen worden onderzocht ...

Discussie

Met de toenemende prevalentie van metabole ziekten zoals chronische hypertensie, diabetes en hyperlipidemie, die belangrijke risicofactoren voor lijn, zijn lijn preventie en behandeling geworden een belangrijk gebied van medisch onderzoek^{12, 13}. tekorten in taal en beweging na een beroerte zijn sterk gecorreleerd met de mate van schade aan weefsel¹⁴ hersenen en leiden tot een slechte kwaliteit van leven voor patiënten en hun families-

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep