Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te scheiden van ontbindend thylakoïde complexen door Native groen gelelektroforese. Groene gel banden worden vervolgens gekenmerkt door tijd gecorreleerd Single Photon Counting (TCSPC) en basisstappen voor data-analyse worden verstrekt.

Samenvatting

De licht-reacties van fotosynthese worden uitgevoerd door een reeks van gepigmenteerde eiwitcomplexen in de thylakoïde membranen. De stoichiometrie en de organisatie van deze complexen op zowel lange als korte tijd schalen als gevolg van de processen die aan te passen aan veranderende milieu omstandigheden fotosynthese hoogdynamische is (dat wil zeggen, niet-fotochemische blussen, staat de overgangen, en de op lange termijn antwoord). Historisch, deze processen zijn beschreven spectroscopically in termen van veranderingen in de chlorofyl fluorescentie en spectroscopie blijft een belangrijke methode voor het fotosynthetische controleparameters. Er zijn een beperkt aantal manieren waarin de onderliggende complexe dynamiek van de eiwitten kunnen worden gevisualiseerd. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het hoge-resolutie scheiding en visualisatie van thylakoïde complexen, inheemse groene gelelektroforese. Deze methode gaat gepaard met tijd-gecorreleerde één foton tellen voor gedetailleerde karakterisering van de chlorofyl fluorescentie-eigenschappen van bands gescheiden op de groene gel.

Inleiding

Fotosynthetische organismen moeten voortdurend hun fysiologie aan veranderende milieu omstandigheden hun productiviteit te maximaliseren en met succes concurreren met buren¹aanpassen. Dit geldt met name voor de machine verantwoordelijk voor de licht-reacties van fotosynthese, als omgevingslicht voorwaarden door drie ordes van grootte tussen donker en vol zonlicht fluctueren kunnen. Bovendien, kunnen milieufactoren zoals droogte, koude of hittestress verminderen de beschikbaarheid van kooldioxide voor fixatie van koolstof, die de natuurlijke elektron gootsteen voor de producten van de licht-reacties. Planten moeten, daarom, oogst en gebruik maken van de zonnestraling zo efficiënt mogelijk met behoud van de mogelijkheid om te verdrijven van overtollige licht energie als dit nodig is. Terwijl photooxidative schade nog steeds routinematig onder alle lichtomstandigheden^2,3, onvermogen om te beheren energie van de geabsorbeerde excitatie met succes kan leiden tot de catastrofale celbeschadiging en dood optreedt. Verschillende adaptieve mechanismen bestaan waarmee de fotosynthetische toestellen worden afgesteld zowel aan veranderingen in de heersende milieuomstandigheden en voorbijgaande fluctuaties (dat wil zeggen, over zowel de korte als de lange termijn)⁴. Het gaat hierbij om de lange termijn response (LTR) en niet-fotochemische blussen (NPQ). NPQ is zelf geacht te omvatten ten minste drie andere component fenomenen, waaronder staat overgangen (qT), snel afleidbare energie blussen (qE) en photoinhibition (qI)⁵.

Deze processen werden oorspronkelijk waargenomen en grotendeels in termen van spectroscopische fenomenen gedefinieerd [bijvoorbeeld NPQ verwijst naar een daling in waargenomen chlorofyl fluorescentie (blussen van chlorofyl fluorescentie) thats niet te wijten aan een toename in de snelheid van Fotochemie]⁶. De term "overgangen van de staat" ook naar de waargenomen verwijst verandering in de relatieve hoeveelheid fluorescentie van PSI en PSII⁷. Terwijl de spectroscopische technieken die opsomming van deze verschijnselen mogelijk hebben gemaakt [inzonderheid pulse amplitude gemoduleerd (PAM) Fluorescentiespectroscopie] en blijven een essentieel middel voor het observeren en het ontleden van fotosynthetische processen in vivo, veel van de biochemie is vereist voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectroscopische waarnemingen. Staat overgangen, bijvoorbeeld, houdt een fosforylatie/defosforylerings-cyclus van de LHCII eiwitten door de STN7 kinase en fosfatase TAP38/PPH1, respectievelijk^8,9,10. Deze cyclus regelt de fysieke distributie van de antenne van de LHCII tussen de twee photosystems door een deel van LHCII trimeren van PSII naar PSI, waardoor het wijzigen van de absorptie dwarsdoorsnede van de photosystems^11,12. De qE component van NPQ zet snel overtollige excitatie energie in warmte door middel van de acties van de Violaxanthine/zeaxanthine epoxidatie/de-epoxidatie cyclus en de publieke omroepen-eiwit. De exacte rol van publieke omroepen in dit proces is nog steeds niet volledig begrepen¹³. De component van de qI van NPQ, photoinhibition, wordt over het algemeen toegeschreven om schade aan de proteïne van de D1 van PSII. Herstel van volledige fotosynthetische bevoegdheid vereist een uitgebreide herstelproces te repareren van beschadigde PSII photocenters. De PSII reparatie cyclus omvat de migratie van PSII complexen uit de granal stapels, ontmanteling van de complexen, vervanging van beschadigde D1 eiwitten, opnieuw samenstellen van de complexen PSII en verkeer van PSII complexen terug naar de granal stapels¹⁴. De precieze aard van de photoinhibition en PSII photodamage blijft een onderwerp van intensieve controle¹⁵.

De moeilijkheid bij het bestuderen van verschijnselen als staat overgangen of PSII reparatie vloeit gedeeltelijk voort uit het feit dat er niet een eenvoudige manier is te visualiseren van de mechanica van complexe biochemische systemen. De klassieke biochemische aanpak voor het begrip van een proces is het eerst scheiden van zijn onderdelen, zodat ze kunnen worden gekarakteriseerd in isolatie. Native gelelektroforese is ontstaan uit de succesvolle pogingen in de jaren 1980 te scheiden en karakteriseren de Fotosysteem complexen van de thylakoïde membranen met meer voorbereidende methoden (namelijk sacharose kleurovergang centrifugeren en chromatografie)¹⁶. Het wasmiddel systemen ontwikkeld om het zachtjes solubilize de inheemse complexen van de membranen thylakoïde werden snel aangepast aan elektroforetische scheidingsmethoden, vooral door Allen en article¹⁷ en en Peter en Thornber¹⁸, leiden aan inheemse groene gelelektroforese. Hoewel vertegenwoordigen slechts één uit een verscheidenheid van technieken in het experimentele arsenaal, inheemse pagina een aantal aantrekkelijke kenmerken die een algemeen werkzame methode hebben gemaakt in het onderzoek van de fotosynthese heeft. Inheemse pagina is relatief snel en eenvoudig, waarbij weinig gespecialiseerde apparatuur, terwijl het verstrekken van hoge resolutie scheiding van een groot aantal thylakoïde complexen gelijktijdig. Dit zorgt ervoor dat inheemse pagina een handig hulpmiddel voor de studie van thylakoïde dynamiek en, in combinatie met standaard pagina in de tweede dimensie, alsmede een verscheidenheid van wasmiddel en buffer systemen, een veelzijdig systeem voor het zoeken en karakterisering van nieuwe thylakoïde complexen.

Dat gezegd zijnde, hebben inheemse groene gels een reputatie als een onbetrouwbare techniek, met name in onervaren handen, omdat het gemakkelijk is voor de productie van slechte resultaten vage, smeary gels met enkele bands uit. Dit probleem werd opgelost, gedeeltelijk, met de introductie van blauw-native pagina¹⁹. Het gebruik van coommassie kleurstof in de BN buffersysteem maakt eiwit scheiding robuuster. Daarom kan BN-pagina is vaak een gemakkelijker en betrouwbaarder techniek voor een relatieve beginner instellen en hoge resolutie scheidingen van thylakoïde complexen. Om deze redenen geworden BN-pagina de methode van keuze voor het meeste werk voor dit veld. Terwijl BN-pagina over het algemeen langzamer is uitgevoerd dan groene gelelektroforese, het belangrijkste nadeel is dat de coommassie kleurstof kleuring interfereert met de identificatie van zwakke chlorofyl-bevattende bands, terwijl ook downstream spectroscopische karakterisering problematisch.

De biochemische informatie verstrekt door inheemse gels en 2D SDS-pagina kan aanzienlijk worden versterkt in combinatie met gegevens van spectroscopische technieken. Ongeacht het systeem, een centraal probleem met het gebruik van inheemse gels te identificeren complexen is dat er altijd de identificatie kan worden aangevochten (dat wil zeggen, de eiwitten in een band gevonden kan altijd vertegenwoordigen comigrating complexen of onderdelen, eerder dan een enkel fysiologisch authentiek complex). Spectroscopische karakterisering biofysische informatie over de pigmenten in groene gel bands en kan worden gebruikt om te bepalen welke soorten complexen zijn ze waarschijnlijk bevatten. Chlorofyl fluorescentie is vooral nuttig in dit verband als gevolg van de vaak sterk verschillende spectra en de levensduur van de fluorescentie die karakteristiek voor verschillende fotosynthetische pigment-eiwitcomplexen zijn. Terwijl eenvoudige steady-state 77K fluorescentie spectra historisch nuttig zijn bij de bevestiging van de identiteit van de inheemse gel complexen, bieden moderne tijd-gecorreleerde één foton tellen (TCSPC) veel meer informatie. TCSPC kunnen niet alleen de karakterisatie van complexen op basis van de levensduur van de fluorescentie, maar maakt ook mogelijk de gedetailleerde beschrijving van de energie-overdracht tussen spectrale componenten binnen een complex. Dit soort karakterisering wordt steeds noodzakelijker als het gebruik van verschillende inheemse gel systemen spreads en nieuwe putatief complexen worden ontdekt, waardoor de identificatie van eiwitcomplexen beter worden geverifieerd en het verstrekken van nieuwe biofysische informatie over de werking van deze complexen.

In dit document bieden we een methode waarmee degenen die weinig of geen ervaring met inheemse gelelektroforese om de resolutie van de hoge kwaliteit van inheemse thylakoïde complexen met het oog op het onderzoek naar de mechanica van de licht-reacties van fotosynthese. Deze basistechniek kan vervolgens worden opgedreven naar eigen goeddunken van de experimentator resultaten verbeteren of uitbreiden van toepasselijkheid op andere soorten. Vervolgens beschrijven we het proces voor het onderwerpen van inheemse groene gel bands aan het TCSPC, evenals enkele stappen voor fundamentele analyse en betere presentatie van de gegevens verstrekt door de techniek. De koppeling van de inheemse gelelektroforese met TCSPC analyse breidt het nut van deze gel-systemen door middel van verificatie en biofysische karakterisering van eiwitcomplexen binnen de bands. Het systeem van de groene gel hier beschreven is gebaseerd op die ontwikkeld door Allen en article¹⁷ met enkele wijzigingen en is hetzelfde als die in Schwarz et al.gebruikt. ²⁰. dit systeem is een van de vele maar heeft specifieke functies die handig voor deze methode zijn. Het is snel genoeg, zodat thylakoïde isolatie, de gelelektroforese van het en TCSPC analyse handige kunnen worden uitgevoerd op één dag wegnemen van mogelijke problemen van monster opslag en afbraak. Wij vinden ook dat deze methode robuust in de handen van onervaren gebruikers, is terwijl nog steeds resultaten die variëren van goede naar superior, afhankelijk van de mate van optimalisatie.

Het is belangrijk om te beseffen dat de gevisualiseerd op een native gel complexen afhankelijk zijn op zowel het wasmiddel en buffer systemen die worden gebruikt, alsook op de biologische eigenschappen van het organisme onderzocht. Verschillende systemen van wasmiddel en buffer scheiden bij voorkeur verschillende soorten complexen, en een bepaalde fotosynthetische organisme zal hebben verschillende complexen van andere organismen, niet alle die aanwezig zijn in een bepaalde omstandigheid zal zijn. Het systeem hier beschreven is bijzonder geschikt voor de studie van PSI megacomplexes, zoals beschreven in Schwarz et al.. ²⁰, maar het valt op de meer destabiliserende kant van het spectrum voor degenen die studeren van PSII megacomplexes. Voor een uitgebreide studie van de verschillende systemen voor wasmiddel en buffer gebruikt in native gelelektroforese van thylakoïde eiwitten, is het aanbevolen om Järvi et al.bekijken. ²¹ en Rantala et al. ²².

Protocol

1. stamoplossingen voorbereiding voor het gieten van inheemse groene Gels

1. Bereiden een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voor het oplossen van gel bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 8,3.
2. Een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voorbereiden stapelen gels, bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 6.3.
3. Bewaar deze buffers bij 4 ° C om te voorkomen dat de groei van de schimmel.
   Opmerking: De buffers zijn stabiele maandenlang bij 4 ° C, zodat de bereiding van 100-200 mL elke buffer voor verder gebruik wordt aanbevolen.
4. Bereiden 1 L van 10 x uitvoeren buffer met 250 mM Tris HCl pH 8.3, 1.92 M glycine, en 1% SDS. De 10 x buffer waarop de benchtop opslaan.

2. stockoplossing voorbereiding voor isolatie en solubilisatie van thylakoiden

1. 100 mL TMK homogenisering buffer 50 mM Tris buffer (pH 7), met 10 mM MgCl₂en 10 mM KCl bereiden en bewaren bij 4 ° C.
   Opmerking: Dit is de belangrijkste buffer voor homogenisatie en manipuleren van thylakoïde monsters. Anderzijds kunnen geconcentreerde stamoplossingen worden voorbereid en verdund zonodig (Tris buffer MgCl₂en KCl kan alle gemakkelijk worden opgeslagen op de benchtop zodra 1 M concentreert zich).
2. Bereiden van stamoplossingen van de thylakoïde solubilisatie wasmiddelen, B-decyl maltoside (DM) en n-octyl B-d-glucoside (OG), door het oplossen van elke wasmiddel in TMK buffer op 20% w / v. bevriezing bij-20 ° C in 1 mL aliquots.
3. Bereiden thylakoïde solubilisatie buffer (SB), die ook de buffer monster laden.
   1. In de eerste plaats merk TMK-glycerol buffer door 7 mLs voor TMK buffer en 3 mLs glycerol te combineren.
   2. Om 800 μL van TMK-glycerol buffer, voeg 100 μl van de stockoplossing DM en 100 μl van de stockoplossing OG. Bewaar deze SB werkoplossing, met 2% DM en 2% OG, bevroren bij-20 ° C in 1 mL aliquots.
      Opmerking: Elk aliquot kan worden ontdooid en refrozen zo nodig.

3. gieten groene Mini Gels voor Later gebruik

1. Aparte stapelen en het oplossen van gel oplossingen in 15 mL wegwerp proefbuizen voorbereiden.
   Opmerking: De volumes geboden zijn voldoende voor een enkele mini gel met behulp van 1,5 mm plaat afstandhouders.
   1. Combineren om de stapelvolgorde gel-oplossing, 1,25 mL 4 x stapelen gel-buffer, 0,5 mL van 40% acrylamide stockoplossing (39:1 C) en 3,25 mL water te geven van 5 mL 4% acrylamide in 1 x stapelen buffer. Zodat het oplossen gel combineren oplossing 1.875 mL 4 x oplossen van buffer, 0.94 mL van 40% acrylamide stockoplossing (39:1 C) en 4,7 mL water geven van 7,5 mL 5% acrylamide in 1 x oplossen van buffer.
2. Giet het oplossen gel.
   1. 50 μl van 10% ammoniumnitraat persulfate (APS) toevoegen aan het oplossen gel oplossing, dan toevoegen van 10 μL van TEMED, dop van de tube en voorzichtig omkeren van meerdere keren te mengen. Giet onmiddellijk de gel oplossing tussen de platen van de gel, waardoor ongeveer 1 cm tussen de bovenkant van het oplossen gel en de onderkant van de kam tanden voor de stapelvolgorde gel.
   2. Zachtjes Pipetteer 100% ethanol op de bovenkant van het oplossen gel naar niveau de gel.
      Opmerking: Als de gel niet binnen 15 min stelt, verse APS oplossing dient te geschieden en/of nieuwe TEMED moet worden gebruikt.
   3. Nadat de gel heeft polymeervorm (de interface tussen de gel en de ethanol gemakkelijk zichtbaar en worden niet verplaatst als de gel is getipt), pour uit de ethanol en blot met een absorberend papier.
3. Giet de stapelvolgorde gel.
   1. Voeg toe 25 μL van 10% APS aan de stapelvolgorde gel oplossing, voeg 5 l TEMED, vervolgens GLB en omdraaien om te mixen op dezelfde wijze als het oplossen gel. Giet de oplossing van de gel bovenop het oplossen gel totdat de ruimte tussen de platen is volledig gevuld en invoegen van een 10-well kam.
      Opmerking: Als u klaar bent om te worden gebruikt, de kam te verwijderen van de gel en de putjes met water spoelen, om ervoor te zorgen dat de putten recht en onbelemmerd door gel zijn. De gel kan worden opgeslagen met de kam bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste enkele dagen.

4. isolatie van ruwe thylakoïde membranen van spinazie bladeren

Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd op het ijs met behulp van vooraf gekoeld apparatuur en buffers. Dim verlichting wordt ook aangeraden. Afhankelijk van de experimentator de discretie en de biologische processen bestudeerde, moeten protease en/of phosphatase inhibitors vers worden toegevoegd aan TMK buffers voordat homogenisering.

1. Volledig Meng spinazie bladeren in TMK buffer met een glas Dounce homogenizer.
   Opmerking: Ongeveer 1 tot 2 mL buffer is doorgaans voldoende voor een kleine baby spinazie blad. Een enkele baby spinazie blad kan in het algemeen bieden genoeg materiaal om te laden verschillende putten op een 1,5 mm mini gel.
2. Filter de ruwe blad homogenaat om te verwijderen van de onoplosbare puin.
   1. Om een eenvoudige filter apparaat, een delicate taak knippen veeg in helft en vouw het in kwartalen. Pak de delicate taak wissen in de bodem van een disposable spuit 5 mL en vooraf nat de veeg met TMK buffer.
   2. Gebruik de plunjer van de injectiespuit te drukken van overtollige buffer uit de delicate taak wipe en er zeker van te zijn dat de wipe-filter aan de onderkant van de spuit stevig is ingedrukt nadat de zuiger is verwijderd.
   3. Pipetteer van het homogenaat blad in het midden van het doekje filter en gebruik de zuiger het homogenaat passeren door het filter. Het verzamelen van de gefilterde homogenaat in een centrifugebuis 1,5 mL.
3. Centrifugeer het homogenaat bij 5.000 x g gedurende 10 minuten bij 4° C tot pellet onoplosbaar materiaal, met inbegrip van thylakoïde membranen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL TMK buffer.
4. De hoeveelheid chlorofyl in elk monster normaliseren door het aanpassen van het volume van elk monster geresuspendeerde thylakoïde zodat elk monster dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl bevat, zoals hieronder beschreven.
   Opmerking: Dit zal het toestaan van elk monster aan ontbindend worden in dezelfde hoeveelheid wasmiddel en minimaliseert variabiliteit in solubilisatie als gevolg van verschillen in volume van het pellet.
   1. Om extract chlorofyl van elk monster van geresuspendeerde thylakoïde membranen, neem een 50 μl aliquoot in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL en 950 μL van methanol aan toevoegen. De buis van het GLB en meng door het omkeren van meerdere malen.
   2. Centrifugeer het methanol/chlorofyl extract bij 10.000 x g gedurende 10 minuten naar pellet neergeslagen eiwitten.
   3. Bepaal de chlorofylconcentratie van het supernatans dat volgens Porra et al.met pigment. ²³. Neem extinctie lezingen op 652 en 665 nm met behulp van een spectrofotometer en een meetcel 1 cm. Bepalen totale chlorofylconcentratie met behulp van de onderstaande vergelijking:
      Chls een + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)
   4. Met behulp van chlorofyl concentratie metingen als een gids, verwijderen en verwijderen van sommige volume van elk monster, zo nodig, zodat elke buis dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl bevat.
5. Pellet opnieuw thylakoïde membranen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 10 min. verwijderen en verwijder het supernatant. Wees voorzichtig met het verwijderen van alle bovendrijvende vloeistof zonder aspirating van om het even welk van de pellet.

5. solubilisatie van een thylakoïde membranen voor laden op inheemse Gels

1. Ontdooi een aliquoot gedeelte van TMK 30% glycerol schoonmaakmiddel (SB) en omkeren van meerdere keren te mengen. Houd het op ijs.
2. Los de pellet thylakoïde door toe te voegen het juiste volume van SB tot een chlorofylconcentratie van 1 mg/mL.
   Opmerking: Deze concentratie is een startpunt voor het vinden van de optimale solubilisatie voorwaarden, die empirisch moeten worden vastgesteld. De chlorofylconcentratie moet hetzelfde tussen monsters om geldige vergelijkingen worden gemaakt.
3. Pipetteer herhaaldelijk op en neer terwijl ze voorzichtig om te voorkomen dat het schuim van het monster. Houd op ijs toe thylakoïde monsters te solubilize.
   Opmerking: Solubilize gedurende ten minste 10 minuten. Solubilisatie tijd moet lang genoeg dat het verschil in solubilisatie tijd tussen monsters wordt geminimaliseerd.
   Voorbeeld: Als 3 minuten vereist zijn voor het solubilize van alle monsters, dan ongeveer 30 minuten mag worden voor solubilisatie.
4. Centrifugeer ontbindend ze bij 10.000 x g bij 4 ° C tot pellet onoplosbaar materiaal.
   Opmerking: Ontbindend thylakoïde monsters zijn stabiel op ijs voor uren, maar opslag bij-70 ° C moet worden voorkomen, aangezien cycli bevriezen-ontdooien in een verlies van megacomplex bands resulteren kunnen.

6. scheiding van ontbindend thylakoïde eiwitten door inheemse gelelektroforese

1. Laden van de ontbindend thylakoïde supernatant bereid in stap 5.4 rechtstreeks op de inheemse gel eerder bereid. Een 1,5 mm gel, geladen 15 μL van ontbindend thylakoïde per putje.
2. Stel de inheemse groene gel op in wezen dezelfde wijze als de SDS-pagina gelen met 1 x uitgevoerd buffer. Stel de gel bij 100 V en plaats de hele gel tank op nat ijs voor de duur van de vlucht te verzachten resistieve verwarming van de gel.
   Opmerking: De gel moet ongeveer 2 uur voor het gratis pigment aan de voorzijde van de migratie aan de onderkant van de gel (Figuur 1).

7. excisie van thylakoïde Complex Bands uit inheemse groene Gels

Opmerking: De specifieke band van belang uit de gel middendoor is nodig zijn om de band te worden geplaatst in het pad van de lichtbundel en om te voorkomen dat strooilicht fluorescentie van nabijgelegen complexen worden verzameld.

1. Verwijder de gel uit de elektroforese cel en spoelen buffer off van de gel-platen met gedestilleerd water. Verwijderen van de bovenste plaat van de gel en spoel de gel met gedestilleerd water.
2. Houden van de gel op de bodemplaat voor glas en plaats de gel en de plaat op ijs. Wanneer niet in gebruik, houden de gel in het donker en bedek met een plastic wrap te voorkomen uitdroogt.
3. Accijnzen met de gel op de glasplaat blijven, elke band van belang als u klaar bent voor TCSPC analyse. Accijnzen bands netjes met een scherpe scalpel of scheermesje en zorgen dat de verwijderde band geen contaminerende band-materiaal bevat.

8. verzameling van kamertemperatuur Steady-State fluorescentie Spectra

1. Voor elk complex dat zal worden geanalyseerd door TCSPC, wordt een kamertemperatuur fluorescentie spectrum genomen tussen 600 en 800 nm met behulp van een fluorescentie spectrometer.
   Opmerking: De golflengte van de excitatie gebruikt voor het verzamelen van dit spectrum moet overeenkomen met de golflengte gebruikt voor TCSPC.

9. TCSPC van groene Gel Bands

Opmerking: Zie Figuur 2 voor een voorstelling van het TCSPC-setup.

1. Sandwich het gel segment tussen twee glazen microscopie glijdt. Gebruik plakband, op elk uiteinde van één van de microscopie dia's geplaatst en meer dan meerdere malen gevouwen als wilt maken van afstandhouders, zodat de dia's kunnen worden samengehouden stevig zonder het comprimeren van het gel-segment.
   Opmerking: Hiermee maakt u een pad voor de laserstraal te geven tussen de Microscoop dia's en door het gel-segment.
2. Een kleine hoeveelheid water toevoegen aan het segment van de gel op de rand van het glas dia's een gladde interface maken die signaal verstrooiing zal verminderen.
3. Klem de gel/dia sandwich in het pad van de bundel, dus dat de lichtbundel treft het segment van de gel door middel van de open rand van de platen, waardoor fluorescentie emissie worden via de kant van het glas dia's waarin de gel is ingeklemd, loodrecht op het pad van de lichtbundel.
   Opmerking: De golflengte van de excitatie gebruikt zal afhangen van het experiment. Een golflengte van 435 nm zal wekken zowel chlorofyl a en chlorofyl b, terwijl 465 nm bij voorkeur chlorofyl b zal prikkelen. In dit geval, 435 nm werd gebruikt als de excitatie golflengte.
4. Verzamel 10.000 totale gegevenspunten op regelmatige tijdstippen uit het emissiespectrum van de fluorescentie voor elk complex. Bijvoorbeeld, het verzamelen van gegevens elke 10 nm, beginnend op 680 nm en eindigend bij 750 nm.
   Opmerking: Bereiden meerdere gel banden voor elk complex worden bestudeerd, zodat dat vers monster beschikbaar is in het geval dat photobleaching voldoende signaal-collectie voorkomt.

10. TCSPC (Data-analyse)

1. Voor een gegeven complex, normaliseren eerst de piekhoogte van elke curve verval voor alle golflengten verzameld.
   Opmerking: Deze stap is niet nodig voor de bouw van DAS, maar voorziet in verval curven worden bedekt en als een eerste inspectie van de gegevens visueel met elkaar vergeleken.
2. Staart-match elke verval curve tot de steady-state fluorescentie spectrum van het complex, zoals hieronder beschreven.
   1. Kies een timepoint waarna het verval signaal heeft afgevlakt, meestal na een paar nanoseconden.
   2. Voor elke golflengte, normaliseren de verval-curve zodat de signaalsterkte op de geselecteerde timepoint gelijk aan de waarde van het spectrum van de fluorescentie steady-state op die golflengte is (dat wil zeggen, de waarden van alle golflengten samen op de geselecteerde timepoint opnieuw zal maken de steady-state fluorescentie spectrum).
3. Bouwen verval-medewerker spectra (DAS) van de staart zoekwoorden verval curven, zoals hieronder beschreven.
   1. Met behulp van gegevens punten van de staart zoekwoorden verval curven bouwen een aantal percelen graphing intensiteit van de fluorescentie vs. golflengte op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld elke 10 ps). Bijvoorbeeld, is de DAS op 50 ps gebouwd door het uitzetten van de waarde van elke curve verval op 50 ps vs. golflengte.
   2. Overlay aller de verval-geassocieerde spectra maken een waterval stijl plot die het verval van het spectrum van de fluorescentie na verloop van tijd toont.

Resultaten

Representatieve resultaten voor groene gelelektroforese worden gepresenteerd in Figuur 1. Lane 1 bevat een voorbeeld van ideale resultaten voor groene gelelektroforese van spinazie ze, waarin een maximum aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn. Deze resultaten zijn enigszins atypisch, gedeeltelijk omdat niet alle van de bands gezien in baan 1 normaal aanwezig zijn in een monster zijn. Extra monster opruimen, in de vorm van chloroplast isolatie vo...

Discussie

Een succesvolle thylakoïde solubilisatie en native gel uitvoeren zal resulteren in de resolutie van meerdere afzonderlijke zichtbaar groene banden op de gel zonder aanzienlijke vervorming of het smeren van de bands. Overbelasting de gel, een hoge concentratie van wasmiddel, een onjuiste monster pH, onopgeloste materiaal, runnen van de gel te snel of bij een te hoge temperatuur, en een ten onrechte gegoten gel zijn allemaal factoren die kunnen bijdragen tot slecht opgelost thylakoïde complexen. Terwijl het optimaliseren v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, niet dodecyl maltoside of alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% oplossing
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333