Methodenartikel

Micron-schaal fenotypering technieken van maïs vaatbundels gebaseerd op de X-ray Microcomputed tomografie

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij bieden een nieuwe methode om het contrast X-ray absorptie van maïs weefsel geschikt voor het scannen van gewone microcomputed-tomografie. Op basis van CT-beelden, introduceren we een set van beeldverwerking workflows voor verschillende maïs materialen effectief uitpakken microscopische fenotypes van vaatbundels van maïs.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is noodzakelijk de anatomische structuren van maïs materialen op basis van hoge-doorvoer afbeelding analysetechnieken nauwkeurig te kwantificeren. Hier, bieden wij een "monster voorbereiding protocol" voor maïs materialen (dat wil zeggen, stengel, blad en wortel) geschikt voor gewone microcomputed tomografie (micro-CT) scannen. Op basis van hoge resolutie CT-beelden van maïs stengel, blad en wortel, beschrijven we twee protocollen voor de fenotypische analyse van vaatbundels: (1) op basis van het beeld van de CT van maïs stengel en blad, ontwikkelden we een bepaalde afbeelding analyse pijpleiding als u wilt automatisch uitpakken 31 en nog 33 fenotypische eigenschappen van vaatbundels; (2) gebaseerd op de CT afbeelding serie van maïs root, we zetten een beeld verwerking ten behoeve van de driedimensionale (3-D) segmentatie van metaxylem schepen, en geëxtraheerd van tweedimensionale (2D) en 3D-fenotypische eigenschappen, zoals volume, oppervlak van metaxylem schepen, enz. Vergeleken met traditionele handmatige meting van vaatbundels van maïs materialen, verbeteren de voorgestelde protocollen aanzienlijk de efficiëntie en nauwkeurigheid van de fenotypische kwantificering micron-schaal.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De maïs vasculaire systeem loopt door de gehele installatie, van de wortel en stam naar de bladeren, dat de belangrijkste vervoer paden vormt voor het leveren van water, minerale voedingsstoffen en organische stoffen1. Een andere belangrijke functie van het vaatstelsel is mechanische ondersteuning te bieden voor de maïs plant. Bijvoorbeeld, zijn de morfologie, het aantal en de verdeling van de vaatbundels in wortels en stengels nauw verwant aan de accommodatie weerstand van maïs planten2,3. Op dit moment studie over de anatomische structuur van vaatbundels voornamelijk gebruik maken van microscopische en ultramicroscopic technieken om de anatomische structuren van een bepaald deel van de stengel, blad of wortel, weer te geven en vervolgens meten en tellen deze structuren van belang door handmatige onderzoek. Ongetwijfeld, handmatige meting van verschillende microscopische structuren in grootschalige microimages is een zeer vervelend en inefficiënt werken en ernstig beperkt de precisie van microphenotypic eigenschappen, vanwege haar subjectiviteit en inconsistentie4, 5.

Maïs heeft geen secundaire groei, en de inhoud van de cel bestaat hoofdzakelijk uit water in de primaire meristeem. Zonder enige voorbehandeling, kunnen verse monsters van maïs weefsels worden rechtstreeks gescand met behulp van een micro-CT-apparaat; de scannen resultaten zijn echter waarschijnlijk slechte en ruw. De belangrijkste redenen zijn samengevat als volgt: (1) lage demping dichtheden van plantaardige weefsels, wat resulteert in een laag contrast van atoomnummer en een hoog geluidsniveau in beelden; (2) verse plantaardige materialen zijn gevoelig voor uitdrogen en krimpen tijdens de normale scannen omgeving, zoals gerapporteerd door Du6. De bovengenoemde problemen zijn de belangrijkste beperkingen voor de ontwikkeling en toepassing van microphenotyping technologie voor maïs, tarwe, rijst en andere eenzaadlobbigen geworden. Hier introduceren wij de 'sample voorbereiding protocol' aan de voorbehandeling van de monsters van maïs stengel, blad en wortel. Dit protocol vermijdt de uitdroging en vervorming van plantaardig materiaal tijdens de CT scan; het is dus gunstig voor Verhoog de tijd van bewaring van plant monsters met nondeformation. Bovendien, de verven stap gebaseerd op solide jodium ook verbetert het contrast van plantaardig materiaal; Dus, het maakt aanzienlijke verbeteringen in de grafische kwaliteit van micro-CT. Daarnaast ontwikkelden we beeld processing software, genaamd VesselParser, voor het verwerken van de CT-beelden van maïs stengels en bladeren. Deze software integreert een aantal van de beeldverwerking pijpleidingen naar high-throughput en automatische fenotypering analyses uit te voeren voor 2D-CT afbeeldingen van verschillende plantaardige weefsels. Vaatbundels in de hele doorsnede van de maïs stengel en blad worden gedetecteerd, uitgepakt en geïdentificeerd met behulp van een automatische beeldverwerking methode. Daardoor krijgen we 31 microscopische fenotypes van de maïs stengel en 33 microscopische fenotypes van de maïs blad. Voor de CT afbeelding serie van de maïs root ontwikkelden we een beeld-verwerkende regeling te verwerven van 3D-fenotypische eigenschappen van metaxylem schepen. Deze regeling is superieur in efficiëntie van Beeldacquisitie en wederopbouw in vergelijking met traditionele methoden.

Deze resultaten wijzen erop dat de beeldverwerking pijpleidingen overweegt dat de imaging kenmerken van gewone röntgenfoto micro-CT bieden een effectieve methode voor de microscopische fenotypering van vaatbundels; Dit uiterst verruimt de toepassingen van CT technieken in plantkunde en verbetert de automatische fenotypering van plantaardig materiaal op cellulaire resolutie6,7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. steekproef voorbereiding Protocol

  1. Voor de bemonstering, de stengel, blad, verzamelen en wortel uit verse maïs planten en verdeel ze in drie soorten monster groepen (elke groep met vier replicaties). Vervolgens, snij ze in kleine segmenten met behulp van een chirurgisch mes op de volgende manier: (1) knippen een segment van het midden voort stengellid 1-1,5 cm in lengte; (2) snijd een segment van de maximale breedte van het blad 0,5 - 3 cm in de lengte langs de verticale richting met de belangrijkste ader; (3) Snij een segment van de kroon wortel 0.5 cm in lengte.
  2. Voor de fixatie van de FAA, geniet u de segmenten van het monster in een FAA-oplossing (90:5:5 v/v/v, 70% ethanol: 100% formaldehyde: 100% azijnzuur) voor ten minste 3 d.
  3. Voer de procedure uit uitdroging in zes opeenvolgende ethanol verlopen (dat wil zeggen, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% en 100%) en stel de verwerkingstijd van het verloop van elke ethanol als 30 min.
  4. Plaats de plant materialen in de overeenkomstige monster manden vervaardigd met behulp van een 3D-printer; vervolgens Breng snel het monster manden naar de monster-cel van een CO2 kritische-punts drogen systeem. Het drogen parameters als volgt instellen:
    (1) CO2 in: snelle snelheid. Houder vulstoffen: 100%.
    (2) gratis: CO2 gratis vertraging 120 s in de kringloop. Wisselen van snelheid: 5. cyclus nummer: 12.
    (3) gas uit: warmte, snel. Snelheid: traag, 50%.
    1. Volgens de morfologische verschillen van maïs wortel, stam, en blad, design en drukproef manden met behulp van een 3D-printer (bijvoorbeeld, Figuur 1).
  5. Plaats de gedroogde plant materialen (maïs wortel, stam of blad) in een centrifugebuis van 50 mL met 2 g voor solide iodine kleurstof het plantaardig materiaal met damp van de vluchtige jodium en dan het plaatsen van de buizen in een Svetonepronitsaemyi kamer voor 4-5 h.

2. micro-CT scan Protocol

  1. Als u wilt scannen in de onbewerkte gegevens van CT, stel de CT Scanparameters als volgt: 40 kV/250 µA (voor stengel en blad) of 34 kV/210 µA (voor root). Stel de corresponderende scannen marges voor de verschillende maten en hoeveelheden van de gebruikte materialen voor de plant en de beeldvorming pixelgrootte als volgt aanpassen: 2,0 µm (voor de maïs root), 6.77 µm (voor de maïs stam) en 10.0 µm (voor de maïs blad).
  2. Als u wilt reconstrueren segment beelden, de ruwe gegevens van de CT in CT segment beelden met een 2K resolutie (2000 x 2000 pixels) met behulp van een afbeelding wederopbouw software te converteren. Meer details vindt u in de gebruikershandleiding van de NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. image analyse Protocol voor een Single CT-beeld van een maïs stengel of blad

Opmerking: Gebruik automatische denkbaar software voor vaatbundels de fenotypering analyse van vaatbundels binnen de CT segment beelden van de maïs stengel en blad (Figuur 2). De software gebruik stappen zijn als volgt omschreven.

  1. Het orgel-type voor het initialiseren van verschillende algoritme pijpleidingen te benoemen. Klik op de knop van de parameters van de methode en selecteer maïs stam of maïs blad in de eerste drop-down box.
  2. Naar de afbeeldingen importeren en klik op Gegevensbeheer , stel de werk map automatisch alle segment afbeeldingen in deze map importeren. Selecteer één of meerdere segment afbeeldingen in de afbeelding pijpleidingen.
  3. Het bepalen van de werkelijke pixelgrootte van het beeld. Klik op de knop van de parameters van de methode en voer de werkelijke pixelgrootte van het beeld in de punt van het bewerken van de pixelgrootte.
  4. Voor de berekening van de fenotypering, klikt de fenotypering berekening automatisch uitpakken fenotypische kenmerken van de vaatbundels voor alle geselecteerde segment afbeeldingen.
  5. Klik op de knop van de statistische analyse om de output van de resultaten als een TXT- of CSV-dossierformaat.

4. afbeelding analyse Protocol voor CT-serie van de afbeelding van een maïs Root

Opmerking: De CT afbeelding serie van maïs wortels worden gebruikt om uit te pakken van de 3D-structuren van metaxylem schepen met behulp van beeld-verwerkende software. De belangrijkste stappen zijn als volgt.

  1. De gereconstrueerde beelden van maïs wortels (in BMP-bestandsindeling) importeren en bepalen van de nauwkeurige spatiëring parameters (de grootte van een voxel [d.w.z., x, y, z]). De recursieve Gaussian hulpprogramma gebruiken om vlakken van deze beelden om de beeldkwaliteit te verbeteren.
  2. 3D-segmentatie van metaxylem schepen voeren door het aanpassen van de parameters van de drempel; Dit genereert een uniforme kleurlabel voor elk vaartuig van de aangesloten metaxylem.
  3. Verbeteren en de metaxylem vaartuigen interactief met behulp van morfologie, bitsgewijze, en de flood-fill operaties te identificeren.
  4. Volume visualisatie en oppervlak-reconstructie van de schepen voeren. Gebruik het gereedschap Masker statistieken te tellen en meten van de fenotypische kenmerken van een schip in de 2D en 3D-niveaus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het monster voorbereiding protocol geschikt voor gewone micro-CT scanning niet alleen de vervorming van plantaardige weefsels voorkomt maar ook verbetert het contrast van de absorptie X-ray. Voorbehandeld plantaardig materiaal worden gescand met behulp van een micro-CT-systeem in kwalitatief hoogwaardige segment beelden, en de hoogste resolutie kan bereiken 2 µm/pixel. Figuur 4 toont de gescande micro-CT-beelden van de stengel, blad en wortel, en het afbeeldi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de succesvolle toepassing van CT technologie op het gebied van biogeneeskunde en materiaalkunde, is deze technologie geleidelijk ingevoerd in de velden in de botanie en landbouw, bevordering van onderzoek in de biowetenschappen plant als een veelbelovende technisch instrument . In de late jaren 1990, was CT technologie voor het eerst gebruikt om te studeren de morfologische structuren en de ontwikkeling van het wortelstelsel van de planten. In het afgelopen decennium, synchrotron HRCT is een krachtige, niet-destructi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door de nationale aard Science Foundation van China (No.31671577), de wetenschap en technologie innovatie speciale bouw gefinancierd programma van Beijing Academie van landbouw en bosbouw Sciences(KJCX20180423), het onderzoek Ontwikkelingsprogramma van China (2016YFD0300605-01), de Beijing Natural Science Foundation (5174033), het Beijing Postdoc Research Foundation (2016 ZZ-66), en de Peking Academie van landbouw en bosbouw wetenschappen Grant (KJCX20170404),) JNKYT201604).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Skyscan 1172 X-ray computed tomography systemBruker Corporation, BelgiumNAVoor CT-scannen
CO2 kritische punt drogingssysteem (Leica CPD300)Leica Corporation, DuitslandNAVoor het drogen van monsters
EthanolElkNAVoor FAA-fixatie
FormaldehydeElkNAVoor FAA-fixatie
AzijnzuurElkNAVoor FAA-fixatie
Chirurgisch mesElkNAVoor het snijden van de monstersegmenten
3D-printerMakerbot replicator 2, MakerBot Industries, VSNAVoor het printen van de monstermanden van maïswortel, stengel en blad
CentrifugebuisCorning, VSNAPlaats de wortel-, stengel- of bladmaterialen
Vaste jodiumElkNAVoor het verven van monsters
SkyScan Nrecon softwareSkyScan NRecon, Versie: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiumNAVoor beeldreconstructie
VesselParser-softwareVesselParser, Versie: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, ChinaNABeeldanalyseprotocol voor een enkele CT-afbeelding van maïsstengel of blad
ScanIPScanIP, Versie: 7.0; Simpleware, Exeter, VKNA3D-beeldverwerkingssoftware
Latex handschoenenElkNA
PincetElkNA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protocol voor monstervoorbereidingpijplijn voor fenotypische analyse3D segmentatiemetaxyleemvatenCT beeldreconstructieautomatische imagingsoftwarevolumevisualisatieoppervlaktereconstructie

Gerelateerde artikelen