Methodenartikel

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 november 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP0 ondergaat nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenis is niet bekend. Hier beschrijven we het gebruik van de confocal microscoop als een hulpmiddel om te kwantificeren ICP0 beweging in HSV-1 infectie, die de basis legt voor het kwantitatief ICP0 translocatie in toekomstige mechanistische studies te analyseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) van herpes simplexvirus (HSV-1) 1 is een onmiddellijke vroege eiwit met een RING-type E3 ubiquitin ligase. Het is verantwoordelijk voor de afbraak van de remmen van host beperkende factoren en de activering van latere virale gen. ICP0 bevat een reeks canonieke nucleaire localisatie (NLS). Het komt de kern onmiddellijk na DOVO synthese en voert haar anti-host defense functies voornamelijk in de kern. Echter verderop in infectie, is ICP0 aangetroffen uitsluitend in het cytoplasma, het voorkomen van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Vermoedelijk kan ICP0 translocatie ICP0 te moduleren van haar functies aanroept volgens haar subcellular locaties op verschillende infectie fasen. Om het af te bakenen de biologische functie en regelgevende mechanisme van ICP0 nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie, bewerkt we een immunefluorescentie microscopie methode voor het controleren van de ICP0 handel tijdens HSV-1 infectie. Dit protocol omvat immunefluorescentie kleuring, confocal microscoop beeldapparatuur en nucleaire vs. cytoplasmatische distributie analyse. Het doel van dit protocol is te passen de steady-state confocal opnamen in een tijdsverloop in een kwantitatieve documentatie ICP0 verkeer gedurende de lytische infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden gegeneraliseerd om nucleaire vs. cytoplasmatische lokalisatie van andere virale of cellulaire eiwitten kwantitatief te analyseren zonder tussenkomst van levende imaging technologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herpes simplexvirus (HSV-1) 1 zorgt ervoor dat een breed scala van milde tot ernstige herpetic ziekten zoals herpes labialis, genitale herpes, stromale keratitis en encefalitis. Eenmaal besmet, wordt het virus een levenslang latente infectie in ganglia neuronen. Soms kan het virus worden gereactiveerd door diverse redenen zoals koorts, stress en immuun onderdrukking1, leiden tot recidiverende herpes infectie. Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) is een belangrijke virale regelgever cruciaal voor zowel lytische en latente infectie van de HSV-1. Het transactivates stroomafwaarts virus genen via het tegengaan van de host intrinsieke/aangeboren antivirale verdedigingen2,3. ICP0 heeft een E3 ubiquitin ligase activiteit, die gericht is op verschillende factoren van de cel voor proteasoom-afhankelijke degradatie3. Het interageert ook met verschillende trajecten van de cel om hun activiteiten te reguleren en vervolgens ter compensatie van de host antivirale beperkingen3. ICP0 is bekend om te zoeken op verschillende subcellular compartimenten naarmate de infectie3,4,5 vordert. Het eiwit heeft een lysine/arginine-rijke nucleaire localisatie signaal (NLS) gelegen op residuen 500 naar 5066. Bij DOVO synthese op vroege infectie van de HSV-1, is ICP0 direct geïmporteerd in de kern. Het wordt eerst gedetecteerd bij een dynamiek van nucleaire structuur genoemd nucleaire domein 10 (ND10)7. De E3 ubiquitin ligase activiteit van ICP0 activeert de afbraak van ND10 organisator eiwitten, promyelocytic leukemie (PML) eiwitten en gespikkelde eiwit 100 kDa (Sp100)8,9,10. Na het verlies van eiwitten van de organisator, ND10 nucleaire organen zijn verspreid en ICP0 wordt verspreid om te vullen de hele kern4,11.

Interessant, na het begin van virale DNA replicatie verdwijnt ICP0 uit de kern. Het is uitsluitend gevonden in het cytoplasma, suggereert de aanwezigheid van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie laat in HSV-1 infectie4,12. De eis van de DNA-replicatie impliceert de mogelijke betrokkenheid van een late virale expressie gebrachte eiwitten bij het vergemakkelijken van de cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP04,12. Blijkbaar ICP0 handel tussen verschillende compartimenten tijdens infectie machtigt ICP0 te differentiëren van de interacties aan verschillende cellulaire routes in een ruimtelijke-temporele mode, en daarom coördinaat zijn meerdere functies te fine tunen het evenwicht tussen de lytische en latente HSV-1 infectie13. Om beter te begrijpen ICP0 multifunctionaliteit en de coördinatie van de functionele domeinen ICP0 gedurende de lytische infectie, ontleed we zorgvuldig de moleculaire basis van de dynamische ICP0 translocatie12. Om uit te voeren het mechanistisch onderzoek eerder gemelde12, hebben we een immunefluorescentie kleuringstechniek om te visualiseren subcellular localisatie van de ICP0 op verschillende infectie status onder confocal microscoop toegepast. We hebben ook een kwantitatieve protocol om te analyseren de nucleaire vs. cytoplasmatische verdeling van ICP0 met behulp van de confocal software ontwikkeld. De bevolking van HSV-1 besmette cellen was tabelvorm tijdens de fasen van de infectie en de trends van de ICP0 beweging werden geanalyseerd, onder verschillende biochemische behandelingen12. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol dat documenten ICP0 translocatie in HSV-1 infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden vastgesteld als een algemene methode om te studeren van de nucleaire vs. cytoplasmatische translocatie voor andere virale of cellulaire eiwitten, die als alternatief dienen kan voor levende imaging wanneer de levende imaging techniek niet van toepassing is vanwege is problemen zoals het labelen van de methode, signaal intensiteit of eiwit overvloed.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cel zaaien en virusinfectie

  1. 20 – 24 uur voordat de virusbesmetting, seed 5 x 10,4 van menselijke embryonale Long (HEL) fibroblast cellen of andere cellen worden onderzocht op een dia 4-well 11 mm gespreid in groeimedium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderen serum (FBS)). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2).
    Opmerking: Elk goed moet hebben 70-80% cel confluentie ten tijde van infectie.
  2. Verwijder het groeimedium op de volgende dag, en de cellen met virussen in Medium-199 op een reeks van 4-10 pfu/cel infecteren. Incubeer virus-geïnfecteerde cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Houd de dia schudden tijdens de incubatieperiode.
  3. Na de incubatie 1 h Medium-199 verwijderen en aan te vullen met groeimedium.
    Opmerking: Medicijnen die met verschillende infectie fasen interfereren kunnen worden toegevoegd vóór de virale absorptie of bij deze stap.
  4. Incubeer de virus-geïnfecteerde cellen bij 37 ° C met 5% CO2 voor verschillende lengtes van de periode van de infectie.

2. fixatie en Permeabilization

  1. Tegelijkertijd goede infectie snel wassen van de geïnfecteerde cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 3 keer en toevoegen van 200 μL van 4% paraformaldehyde vers bereid in PBS. Incubeer de cellen met paraformaldehyde gedurende 8-10 minuten bij kamertemperatuur te lossen van de cellen in elk putje.
  2. Paraformaldehyde gecombineerd en was de putjes met 200 μL van PBS voor 3 keer. Volledig gecombineerd PBS na de 3rd wassen.
  3. Voeg 100 μl van 0,2% niet-ionogene oppervlakteactieve stof aan elk putje te permeabilize van de cellen voor 5-10 min.
  4. De niet-ionogene oppervlakteactieve stof gecombineerd en was de putjes met 200 μL van PBS voor 3 keer.

3. immunefluorescentie kleuring

  1. Volledig gecombineerd PBS en voeg 200 l blokkeerbuffer (1% bovien serumalbumine (BSA) en 5% paard serum in PBS) in elk putje en bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
  2. Voeg experimenteel bepaalde concentratie van primair antilichaam (konijn anti-ICP0 polyclonal antilichaam12) in de blokkeerbuffer en na een nacht bebroeden primair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of bij 4 ° C.
  3. Wassen met een blokkeerbuffer 3 keer met 10 min incubatie. Toevoegen van Alexa 594-geconjugeerde geit anti-konijn secundair antilichaam (1:400 verdund in blokkeerbuffer) en de dia's bij kamertemperatuur gedurende 1 uur uit te broeden. Daarna wassen de dia's 3 keer met een blokkeerbuffer met 10 min interval.
  4. Tot slot wassen de dia een keer met PBS residuele BSA en paard serum te verwijderen.
  5. Voeg één druppel antifade montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) te monteren van de dia en verzegel het met een dekglaasje aan met doorzichtige nagellak.

4. confocal Imaging

  1. Met een confocal microscoop, vastgesteldop de golflengte 590 – 650 nm voor Alexa 594 en 410-520 nm voor DAPI. Selecteer afbeeldingsformaat bij 1024 x 1024 en lijn gemiddelde van 8 te verwerven van hoge resolutiebeelden.
  2. Elk putje op de dia 4-well onder confocal microscoop te analyseren. Verwerven representatieve cel beelden onder de 100 X doelstelling, zoals aangegeven in Figuur 1 en Figuur 2.
  3. Voor het tellen van groot aantal cellen, beelden van opeenvolgende velden onder de 40 X doelstelling op te nemen.
    Opmerking: Het vereist 5 – 10 beelden te accumuleren van meer dan 200 geïnfecteerde cellen van elk punt van de tijd van elke infectie.
  4. In elk experiment, foto's nemen met constante confocal parameters voor alle monsters moeten worden vergeleken.

5. het analyseren van nucleaire vs. cytoplasmatische distributie

  1. Open project met de confocal toepassingssoftware. Selecteer een afbeelding waaruit cellen moeten worden tabelvorm voor nucleaire vs. cytoplasmatische distributie van ICP0.
  2. Klik op het tabblad "Hoeveelheid" uit het bovenste menu en selecteer "sorteren ROIs" uit het menu Extra.
  3. Een longitudinale lijn aanzuigen en de cel die moet worden geanalyseerd door het selecteren van de "Grens" van hoogste menu.
    Opmerking: Histogram wordt weergegeven waaruit de intensiteit van de fluorescentie langs de lijn voor zowel de ICP0 als de DAPI. In het histogram, blauwe lijn vertegenwoordigt DAPI pixels en markeert de grens van de kern dat de rode lijn ICP0 pixels vertegenwoordigt.
  4. Gebaseerd op achtergrondkleuring, instellen van een constante drempel voor ICP0 intensiteit te analyseren ICP0 subcellular distributie in elk experiment.
    1. Zoals wordt geïllustreerd Figuur 2, als de rode signaal gemiddeld lager is dan de drempel in de nucleaire regio maar boven de limiet ligt buiten de blauwe grens, categoriseren van het rode signaal als voornamelijk gelegen in het cytoplasma.
    2. Als het rode signaal hoger dan de drempel in de kern en daarbuiten de grens van het blauwe signaal is, groepeert u het rode signaal als nucleus plus cytoplasmatische lokalisatie.
    3. Als het rood signaal boven de drempel in de kern is, maar gemiddeld lager dan het buiten de grenzen van het blauwe signaal is, groepeert u het rode signaal als nucleaire localisatie.
  5. Meer dan 200 geïnfecteerde cellen van elk monster tabulate tegelijkertijd verschillende infectie en plot in staafdiagram om te illustreren ICP0 verkeer volgens tijd (Figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te begrijpen van de basis voor moleculaire en biologische functies van de ICP0 handel tijdens HSV-1 infectie, gebruiken we een immunefluorescentie microscopie methode om te analyseren ICP0 subcellular distributie op verschillende infectie fasen. Figuur 1 toont de representatieve cellen met kenmerkende ICP0 localisatie naarmate de infectie vordert. Om te kwantificeren van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van ICP0, analyseren we ICP0 distribut...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP0. ICP0 ondergaat subcellular handel tijdens HSV-1 infectie (Figuur 1). Waarschijnlijk, ICP0 communiceert met verschillende trajecten van de cel voor het uitvoeren van verschillende functies op verschillende locaties. Hierdoor ICP0 te fine-tunen van haar veelvoudige functies in de krachtmeting met menselijke gastheer13. Echter, hoe ICP0 coördineert de veelvoud...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de financiële steun van een toegekende aan Haidong Gu NIH-subsidie (RO1AI118992). Wij danken de microscopie, Imaging & Cytometry middelen (MICR) Core faciliteit aan de Wayne State University voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellen en virussen
Human Embryonic Lung fibroblasten (HEL-cellen)Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)HEL-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS
HSV-1-virusstam (stam F)Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM)Invitrogen 11965-092
Foetaal bovien serum (FBS)SigmaF0926-500ml
Medium-199 (10x)Gibco11825-015
Reagentia
4-well 11 mm stapsgewijze schuifCel-Line/Thermofisher Scientific 30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde-oplossing(w/v) Methanol vrijThermo Scientific28908
Triton X-100Fisher reagentiaBP151-1C0
Bovien Serum Albumine (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
Paarden SerumSigmaH1270
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7,4)Dr. Haidong Gu lab
NaCl      Fisher BioreagentBP358-212
KH2PO4            Fisher BioreagentBP362-500
KCl             Fisher Scientific BP366-500
Na2HPO4             Fisher BioreagentBP332-500
Blocking buffer (PBS met 1% BSA en 5% Paarden serum )Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0-antilichaamDr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Muis monoklonaal IgGsanta Cruz BiotechnologySC-966
Alexa Fluor 594-geit anti-konijn IgGinvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-geit anti-muis IgGinvitrogenA11001
Vectashield montagemedium met DAPIVector laboratoriesH-1200
Pasteur-pipetFisher Brand13-678-20D
Nail PolishSally Hansen
Apparatuur
Confocal MicroscoopLeica SP8
Confocal SoftwareLeica LAS X Application suite
Excel softwareMicrosoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubatorThermo ScientificBestelcode 51026282

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378(2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nucleair cytoplasmatische translocatieHSV 1 ICP0 prote neanalyse van prote netransportsubcellulaire lokalisatieconfocale beeldvormingsprotocolmeting van fluorescentie intensiteitDAPI kernkleuringtijdreeksinfectievirale genactivatie

Gerelateerde artikelen