We beschrijven de methoden voor het labelen van fluorescerende tangentieel migreren cellen door electroporation, en voor time-lapse beeldvorming van de beweging van de gelabelde cel in een flat-mount cultuur om te visualiseren migreren cel gedrag in de ontwikkelingslanden chick optic tectum .
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Time-lapse imaging is een krachtige methode om te migreren cel gedrag te analyseren. Na tl cel labeling, kan het verkeer van de gelabelde cellen in cultuur onder videomicroscopie worden opgenomen. Voor het analyseren van cel migratie in de ontwikkelende hersenen, wordt segment cultuur vaak gebruikt om te observeren cel migratie parallel aan de sectie van het segment, bijvoorbeeld radiale cel migratie. Echter kan beperkte informatie worden verkregen door de methode voor het analyseren van cel migratie loodrecht op de sectie van het segment, bijvoorbeeld tangentiële cel migratie segment cultuur. Hier presenteren we de protocollen voor time-lapse denkbaar om te visualiseren tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden chick optic tectum. Een combinatie van cel labeling door electroporation in ovo en een daaropvolgende flat-mount cultuur op de cel cultuur invoegen maakt detectie van migreren cel beweging in het horizontale vlak. Bovendien vergemakkelijkt onze methode detectie van zowel individuele cel gedrag en de collectieve actie van een groep cellen op de lange termijn. Deze methode kan mogelijk worden toegepast om te ontdekken de sequentiële verandering van de TL-geëtiketteerden micro-structuur, met inbegrip van de axonale rek in de neurale verplaatsing van de weefsels of cellen in de niet-zenuwweefsel.
Inleiding
De studie van cel migratie heeft voortgang met de oprukkende techniek voor levende imaging. Na tl cel labeling, kan het tijdelijke verkeer van gelabelde cellen in een cultuur schotel of in vivo onder videomicroscopie worden opgenomen. In de studie van neurale ontwikkeling, hebben de morfologische veranderingen van cellen migreren of grondvlak axonen zijn geanalyseerd met behulp van time-lapse imaging. Voor effectieve beeldvorming is het essentieel een geschikte methode voor fluorescerende cel labeling en weefsel preparaat, gebaseerd op het doel van het experiment en de analyse toe te passen. Voor het analyseren van cel migratie in de ontwikkelende hersenen, heeft segment cultuur zijn gebruikte om te observeren cel migratie parallel aan de sectie van het segment, bijvoorbeeld radiale cel migratie,1,,2,3. Het segment cultuur systeem wordt ook gebruikt voor het opsporen van tangentiële cel migratie4,5, maar het is niet geschikt voor directionele analyse in gevallen waar de cellen loodrecht naar de segment-sectie verspreiden.
De optische tectum bestaat uit een meerdere lagen structuur, gevormd door radiaal en tangentieel cel migratie tijdens de embryonale ontwikkeling. Tectal laag vorming is voornamelijk afhankelijk van radiale migratie van neuronale voorlopercellen van de ventriculaire zone postmitotic, en hun eindbestemming in de lagen correleert met hun geboortedatum in de ventriculaire zone6. Wat betreft de tangentiële migratie meldden we eerder twee stromen van migraties in de oppervlakkige en middelste lagen in een derde kuiken optic tectum. In de middelste lagen tijdens E6-E8 migreren de bipolaire cellen met een lange leidende proces en een dunne achterstand proces dorsally of ventrally langs de axon arcuatus van tectal efferent axonen uitvoert dorso-ventrally7. Na de migratie van deze axophilic onderscheiden de cellen in de multipolaire neuronen zich in de diepe lagen. In de oppervlakkige lagen tijdens E7-E14 verspreiden de migreren cellen horizontaal door de hervorming van een vertakte leidende proces en scatter in meerdere richtingen8. Na de migratie te verspreiden, onderscheiden de laatstgenoemde cellen uiteindelijk in oppervlakkige neuronen van verschillende morphologies. In beide gevallen is een flat-mount cultuur efficiënt om te observeren cel beweging parallel aan het pial oppervlak.
Hier presenteren we een protocol voor time-lapse denkbaar om te visualiseren tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden chick optic tectum7,-8. Combinatie van cel labeling door electroporation in ovo, en een latere flat-mount cultuur op de cel cultuur invoegen maakt detectie van migreren cel verkeer en migratie richting. Het doel van deze methode is om de detectie van zowel individuele cel gedrag in de lange termijn en de collectieve actie van een groep cellen in het horizontale vlak.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Electroporation In Ovo
- Voorbereiden op de expressie plasmide DNA fluorescerende labeling in hoge concentratie. Isoleren DNA van 200 mL voor bacteriële cultuur door de alkalische lysis methode met behulp van anion-wisselingskolommen volgens de fabrikant protocol (Tabel van materialen). Meng pCAGGS-EGFP en pCAGGS-mCherryNuc op een eindconcentratie van 4 µg/µL elke.
Opmerking: Endotoxine-vrije plasmide DNA zuivering kan zijn voorkeur voor electroporation. - Incubeer vruchtbare kippeneieren horizontaal bij 38 ° C in 70% relatieve vochtigheid.
- Na 2,5 dagen, eiwit (eiwit) 5 mL van de puntige kant van het ei met 20 mL injectiespuit met een naald 18 gauge elimineren en verzegel het gat van de naald met tape.
- Snijd de bovenkant van de eierschaal met een gebogen schaar een gat van 2 cm in diameter openen en controleren van het ontwikkelingsstadium van het embryo onder de stereomicroscoop (fase 17 van de Hamburger en Hamilton9). Zegel van het gat opnieuw met tape.
Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd op elk gewenst moment tijdens de E2.5-E3.0. Stap 1.3 en 1.4 lager het niveau van het embryo in het ei om te voorkomen dat een strakke gehechtheid van de groeiende embryo en de bloedvaten naar de bovenste shell. - Blijven incubatie tot E5.5.
- Voordat hij electroporation, stelt 10 µL van het genoemde plasmide DNA gekleurd met 0,5 µL van snel groen (25 mg/mL), 10 mL gesteriliseerde met autoclaaf fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met penicilline (100 eenheden/mL) en streptomycine (100 μg/mL) en micropipetten gemaakt van glazen capillaire buizen met een micropipet-processor. Snijd het distale uiteinde van de micropipet te maken van een passende omvang van porie afhankelijk van de hoeveelheid DNA voor injectie.
- Snijd de verzegelde top shell met een schaar te heropenen een gat diameter van 2,5 cm en het ei stabiel onder de stereomicroscoop. Voeg een paar druppels van PBS in de eicel. Het allantoïs membraan die betrekking hebben op het embryo zonder bloeding met behulp van twee fijne pincet afschilferen. Verwijder het amnion uit het hoofd van het embryo.
- Tijdens het draaien van het hoofd met een microspatula, injecteren 0,1-1 μL van de gekleurde DNA in de ventriculaire holte van de linker optic tectum met behulp van een micropipet verbonden met het een zuiging buis.
Opmerking: De hoeveelheid DNA geïnjecteerd hangt af van het doel van het experiment. Geconcentreerde oplossing van DNA zou zinken en langs de ventriculaire muur hechten. - Plaats een paar forcep-type elektroden (3 mm vierkante elektroden met 7 mm afstand) zodat het doelgebied van de optische tectumis tussen (Figuur 1stap 1 geplaatst).
Opmerking: Het DNA is electroporated aan de kant van de anode. - Laad een pre puls van 30 V, 1 ms met een interval van 5 ms en vier opeenvolgende pulsen van 6 V, 5 ms met een interval van 10 ms met behulp van de pulse generator.
Opmerking: De elektronische conditie is afhankelijk van de grootte en de afstand van de elektroden. Het moet sterk genoeg zijn om de efficiënte transfectie, maar het moet bescheiden genoeg zijn om te verzekeren van de normale ontwikkeling van het doelweefsel is terechtgekomen. - Zegel van het gat met tape en incubatie blijven. Geniet van de elektroden in PBS te verwijderen van eiwit met een interdentale borstel in een kunststof schotel. Herhaal 1.7-1.11 voor elk ei.
2. platte-Mount cultuur op de cel invoegen
- Een dag voordat de cultuur van de flat-mount, bereiden de gecoate cel cultuur invoegen. Float die wat cultuur van de cel wordt ingevoegd op de gesteriliseerde met autoclaaf gedistilleerd water in een schaal 10-cm cel cultuur. Het laden van een oplossing van 8 µg/mL laminin en 80 µg/mL poly-L-lysine om te dekken de inserts en laat de floated inzetstukken in de cel cultuur CO2 incubator bij 37 ° C's nachts.
Opmerking: De volgende dag, de gecoate inserts kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C. - Op dag van de cultuur op E7.0, de laminin-poly-L-lysine-oplossing verwijderen uit het invoegen en plaatsen van het donormateriaal in een glazen bodem schotel (Figuur 1stap 2) gevuld met 1.1 mL gestolde voedingsbodem (60% verminderde serum medium, 20% F12, 10% foetale runderserum, 10 % chick serum, 50 eenheden/mL penicilline, 50 μg/mL streptomycine). Houd de schotel in de cel cultuur CO2 incubator bij 37 ° C.
Opmerking: Het medium kan gebruikt worden tijdens de periode van de cultuur voor drie dagen zonder verandering. - De cultuur-installatie voor te bereiden. Stel een vochtige kamer eenheid op een omgekeerde confocal microscoop met een gasstroom van 40% O2 en 5% CO2 (gas controller) bij 38 ° C (temperatuur controller).
- Snijd de kop van het embryo met een schaar. Knijp het hoofd uit met de pincet in de ijskoude Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een 6-cm cel cultuur schotel.
- Isoleren van de electroporated optische tectum met behulp van twee fijne pincet. Breng de tectum met een plastic pipet in een andere schotel gevuld met ijskoude HBSS. Gebruik de concaved glazen schotel gebaseerd met zwart silicium als een schotel voor het snijden.
- Controleer de positie van de labels onder de fluorescentie stereoscopische Microscoop. Het tectal weefsel rondom de labeling gebied met een microchirurgische mes uitgesneden. Zorg ervoor dat de richting van het weefsel in de tectum (anterior-posterior, dorsal-ventrale).
- Overbrengen in het gelabelde weefsel met een plastic pipet de invoegen zodat de pia kant is gekoppeld aan het invoegen. Leg het tectal weefsel in de gewenste richting en verwijderen van de overtollige HBSS (Figuur 1stap 2).
- 2.4-2.7 ter voorbereiding van andere weefsels op dezelfde plaats herhalen Plaats de schotel in de prewarmed zaal in de omgekeerde confocal microscoop (Figuur 1stap 3).
3. time-Lapse Imaging
- Controleer de fluorescerende etikettering en richten de microscopische veld in de omgekeerde confocal microscoop. Start de laser confocal eenheden en probeer bemonstering van de confocal scan om de richting en positie van het weefsel langs de X- en y-as in het veld te wijzigen. De 10 X of 20 X objectief zonder immersie-olie gebruiken.
- Selecteer het scannen formaat (bijvoorbeeld 512 x 512 dpi). Bepaalt de interval en de totale bereik van de confocal scan langs de z-as. Neem een interval van 5 of 10 µm voor het bereik van 100 µm. Bepaal het tijdsinterval van de confocal beeldvorming en de totale duur (bijvoorbeeld 10 minuten intervallen meer dan 48 uur) imaging.
Opmerking: Om te voorkomen dat de laser fototoxiciteit, verbieden scannen in de hoge scannen grootte met korte z-intervallen voor de lange z-reeks, of met korte tijdsintervallen tijdens de lange imaging duur. Bijvoorbeeld, bij de toepassing van een hoge scannen grootte (bijvoorbeeld 1024 x 1024 dpi), verlagen het aantal scans langs de z-as. - Stel de parameters van de confocal running program beschreven in 3.2 en start imaging.
- Na de beeldvorming, de confocal afbeeldingen op verschillende z-as te z-stapel afbeeldingen voorzien van focal fijnafstelling op elk punt van tijd te combineren.
- De z-stack-beelden op verschillende tijd-punt toevoegen en bouwen een time-lapse film in het AVI formaat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 toont de gevisualiseerde oppervlakkige tangentiële migratie in een flat-mount cultuur op een verstreken tijd (0, 9, 18, 27 h) na begin van opname. Film 1 is een time-lapse film van 10 min-intervallen over een periode van 28 uur en 50 minuten. Het frame is geselecteerd om zich te concentreren op de migreren cellen uit de label linksonder van het frame aan de labelloze ruimte (figuur 3A). ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol dat hierboven beschreven is geoptimaliseerd voor het opsporen van cel migratie in de oppervlakkige lagen6,8. Het is van toepassing voor het opsporen van middenlaag migratie streams (film 5)6,7, gewoon door een verschuiving van de timing van de electroporation (E5.5 naar E4.5) en het begin van de cultuur en imaging (E7.0 naar E6.0).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant nummer 15K 06740 aan Y.W.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materialen | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-vrij plasmide DNA zuiveringskit |
| 20 ml spuit | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge naald | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicilline en streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| glas capillair buis | Narishige | G-1 | |
| celkweek insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminine | SIGMA | L2020 | coating van het kweekinsert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating van het kweekinsert |
| glasbodem schaal | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | kweekmedium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | kweekmedium |
| fetale boviene serum | Gibco | 12483 | kweekmedium |
| kippeserum | Gibco | 16110082 | kweekmedium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microchirurgisch mes | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| gebogen schaar | AS ONE | No.11 | |
| micropipet processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type elektrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulsgenerator | BEX | CUY21EX | elektroporator |
| fluorescentie stereoscopische microscoop | Leica | MZ16F | |
| invers fluorescence microscoop | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperatuur controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Referenties
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266(2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
