Hierbij presenteren wij een protocol om aan het bed de endotoxine activiteit van menselijke volbloed monsters te meten. De endotoxine activity assay is een eenvoudige test om te presteren en kan een nuttige biomarker zijn bij ernstig zieke patiënten met sepsis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lipopolysaccharide, ook bekend als endotoxine, is een fundamenteel bestanddeel van gram-negatieve bacteriën en speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van sepsis en septische shock. De vroegtijdige identificatie van een infectieuze proces dat zich snel ontwikkelt tot een kritieke ziekte, kan een snellere en intensievere behandeling mogelijk maken, waardoor dit mogelijk leidt tot betere resultaten van de patiënt. De endotoxine activiteit (EA) test kan aan het bed worden gebruikt als een betrouwbare biomarker van systemische endotoxemie. De detectie van verhoogde endotoxine activiteitsniveaus is herhaaldelijk aangetoond dat deze gepaard gaat met een verhoogde ernst van de ziekte bij patiënten met sepsis en septische shock. De assay is snel en eenvoudig uit te voeren. Kort na de bemonstering wordt een hoeveelheid volbloed gemengd met een anti-endotoxine antilichaam en met toegevoegde LPS. Endotoxine activiteit wordt gemeten als de relatieve oxidatieve uitbarsting van GEPRIMEERDE neutrofielen zoals gedetecteerd door chemioluminescentie. De uitvoer van de assay wordt uitgedrukt op een schaal van 0 (afwezig) tot 1 (maximaal) en gecategoriseerd als "laag" (< 0,4 eenheden), "intermediair" (0,4 – 0.59 eenheden), of "hoog" (≥ 0,6 eenheden). De gedetailleerde methodologie en motivering voor de implementatie van de EA-test worden in dit manuscript gerapporteerd.
Inleiding
De lipopolysaccharide (LPS), ook bekend als endotoxine, is een belangrijk onderdeel van de membraan structuur van gram-negatieve (GN) bacteriën. Het maakt ongeveer 10% van de celwand, essentieel voor de buitenste membraan integriteit en homeostase. Bovendien, het is een krachtige activator van de gastheer aangeboren immuunsysteem1,2.
In vitro blootstelling van aangeboren immuunsysteem cellen aan LPS leidt tot veranderingen in de expressie van meerdere genen3. Toediening van zeer kleine hoeveelheden LPS bij gezonde menselijke vrijwilligers activeert de cascade van acute systemische ontstekingen, terwijl sepsis en septische shock kunnen ontstaan met hogere endotoxine concentraties4,5.
Sepsis is een levensbedreigende aandoening die, indien niet snel herkend, kan leiden tot meervoudig orgaan falen en overlijden. Septische patiënten moeten tijdig worden behandeld, met agressieve reanimatie, adequate antibioticumtherapie, optimale broncode beheersing en snelle orgaanondersteunende strategieën. De diagnose van de etiologie van sepsis is voornamelijk gebaseerd op klinische herkenning en op cultuur gebaseerde pathogeen detectie6. De resultaten van microbiële culturen kunnen echter tot 48 uur duren en zijn onduidelijk in maximaal 30% van de gevallen7. Vroegtijdige identificatie en interventie kunnen leiden tot betere resultaten van de patiënt. Bij patiënten bij wie sepsis wordt vermoed, worden beslissingen vaak genomen op basis van fysiologische en biochemische parameters, zonder een duidelijk teken van endotoxemie.
De meting van de endotoxine activiteit (EA) kan worden verkregen door middel van een commerciële assay (Zie tabel van de materialen) in volbloed. Het kan worden gebruikt als een biomarker van systemische endotoxemie voor de vroege stratificatie van de ernst van de ziekte, met name bij patiënten met een risico op het ontwikkelen van septische shock8. De test werd gebruikt om Polymyxine B hemoperfusie therapie te begeleiden in een recent gepubliceerde dubbelblinde gerandomiseerde-gecontroleerde klinische studie bij patiënten met septische shock9. Bij ernstig zieke patiënten toonde de MEDIC-studie verhoogde EA-niveaus om te worden geassocieerd met meerdere orgaandisfunctie, Intensive Care Unit (ICU) lengte van verblijf, en sterfte10.
Er zijn verschillende assays ontwikkeld om endotoxine op te sporen. De Limulus Amoebocyte lysate (LAL) Assay, hetzij als een gel-stolsel, turbidimetrische, of chromogene test, is tot nu toe het vaakst aangenomen voor de schatting van serum endotoxine. Het is gebaseerd op het vermogen van endotoxine voor het induceren van stolling van de Hemolymfe van de Horseshoe krab, Limulus polyphemus. Deze bepaling heeft echter enkele beperkingen op het gebied van specificiteit. In het bijzonder kan het ook worden geactiveerd door andere microbiële producten dan endotoxine, zoals componenten van de schimmel celwand, en het kan worden geremd door verschillende humane plasmaproteïnen11.
Gedurende het laatste decennium is de meting van EA ontwikkeld en gevalideerd als een biomarker van circulerende endotoxemie. In vergelijking met de LAL test is EA sneller en gemakkelijker te implementeren in de klinische setting. Bovendien, het is aangetoond dat nauwkeuriger dan LAL in volbloed, met verhoogde gevoeligheid en specificiteit, zowel in vitro en in vivo12.
Ondanks de initiële implementatie als een vroeg diagnostisch instrument voor de snelle identificatie van GN-bacteriën als sepsis veroorzaker agenten, is het EA-niveau ook bestudeerd als een biomarker van de ernst van de ziekte. In dit verband is gebleken dat het bijzonder nuttig is om de hypoperfusie toestand te beoordelen als gevolg van aanhoudende kritieke ziekte, zoals septische shock of post-hartstilstand syndroom13. Meer recentelijk, sinds de ontwikkeling van hemopurificatie systemen, is er ook een positief resultaat van EA voorgesteld als screening tool om potentiële kandidaten voor deze therapie14nauwkeurig te identificeren. Onlangs voerden we een observationele retrospectieve studie uit over de prevalentie en klinische significantie van vroege hoge niveaus van EA bij 107 patiënten met septische shock. In lijn met andere recente resultaten ontdekten we dat EA een veelbelovende marker is van de ernst van de ziekte bij patiënten met septische shock15.
Het doel van het huidige manuscript is om de methode te beschrijven om de EA-test uit te voeren, hetzij aan het bed of in het laboratorium, en om het mogelijke gebruik ervan te beschrijven in een representatief scenario van septische shock. Deze techniek kan LPS-activiteit detecteren door het meten van de verbeterde oxidatieve uitbarsting in neutrofielen na hun priming door complexen van een anti-endotoxine-antilichaam en LPS. De verhoogde respiratoire burst wordt gedetecteerd door een chemiluminometer en de hoeveelheid uitgezonden licht wordt evenredig geacht aan de hoeveelheid Endotoxine in het bloedmonster. De assay vereist weinig reagentia, duurt ongeveer 30 minuten om uit te voeren en gebruikt zo weinig als 40 μL volbloed12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol wordt uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen met betrekking tot de omgang met menselijke biospecimens en na de huidige standaard operatieve procedures van ons klinisch laboratorium. Het gebruik van EA-gegevens en klinische informatie van patiënten die worden getest, volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van onze instelling.
1. laboratoriumapparatuur en inhoud van de assay kit
- Bewaar de EA-Kit op 2 – 8 °C wanneer deze niet wordt gebruikt.
-
Elke EA-test bestaat uit 5 verschillende soorten buizen; gebruik elk voor een ander deel van de test (zie rubriek 2).
- Gebruik Tube #1 (de "Control" Tube) om de basale activiteit van de niet-specifieke oxidatieve uitbarsting van de neutrofielen van de patiënt te meten bij afwezigheid van een specifiek antilichaam.
- Gebruik Tube #2 (de "sample" Tube) om de oxidatieve uitbarsting te meten in reactie op het LPS-antilichaam complex.
- Gebruik Tube #3 (de "Max" buis) om de maximale oxidatieve uitbarsting van de neutrofielen van de patiënt te meten als reactie op een overmaat endotoxine.
- Gebruik Tube #4 (de "LPS" buis) als een bron van exogene endotoxine.
- Gebruik Tube #5 ("aliquot" Tube) voor bloed opslag.
Opmerking: Duplicaten van buizen #1, #2 en #3 zijn voorzien voor een totaal van 8 buizen die moeten worden gebruikt voor elk bloedmonster dat wordt getest (de EA-reagensfles en de kwaliteitscontrole test kunnen worden gebruikt voor alle tests in een zakje).
- Verzamel bloedmonsters van patiënten in steriele buisjes met EDTA-anticoagulans. Bewaar bloedmonsters bij kamertemperatuur voordat u de EA-test uitvoert.
- Schakel voor aanvang van de test de chemiluminometer en de incubator in. Verwarm de incubator tot de temperatuur van 37 °C.
- Idealiter begint het verwerken van het monster binnen 30 minuten na het verzamelen van bloed.
2. endotoxine activiteit test
- Bereid de testbuisjes van EA voor voor het bloedmonster van elke patiënt die u moet testen. Leg de buizen in buis rekken. Verwijder vervolgens de caps.
- Pipetteer met behulp van een combipipet een volume van 1 mL van het EA-reagens uit de fles in buisjes #1 (controle buis), #2 (monsterbuisje) en #3 (Max Tube), elk in tweevoud.
Opmerking: Pipetteer de zijkant van de buis om te voorkomen dat de oplossing opspattend. - Meng het bloedmonster van de patiënt door de bloedafname buis gedurende 20 keer voorzichtig te inverteren. Pipetteer vervolgens 0,5 mL bloed van de patiënt in de buis #4 (LPS Max Tube) en buis #5 (aliquot Tube). Vortex buis #4 voor 10 s.
- Leg de tube racks met alle EA-reageerbuisjes in de incubator Shaker. Sluit de deksel en incuberen gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 37 °C.
- Open het deksel en verwijder de buis rekken uit de incubator. Vortex buis #5 (aliquot Tube). Pipetteer met behulp van een steriele punt 40 μL bloed in buisjes #1 en #2, in tweevoud.
- Vortex buis #4 (LPS buis). Pipetteer met dezelfde pipetpunt 40 μL bloed van buis #4 in buis #3 (Max buis), in tweevoud.
- Vortex de zes laatste reageerbuisjes (#1, #2, #3 en respectieve duplicaten) en plaats ze vervolgens weer in hun rekken.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle buizen voor dezelfde hoeveelheid tijd worden gevorde. - Plaats de buis rekken terug in de incuberende shaker en sluit de deksel. Stel de incuberende Shaker in op 100 rpm en start de beweging gedurende 14 minuten.
- Plaats de EA gelabelde chipkaart in de chemiluminometer en druk op Start. Volg na de incubatie van 14 minuten de instructies die op de chemiluminometer worden weergegeven om de EA-Tubes in de juiste volgorde te lezen.
- Draai elke buis gedurende 10 sec zachtjes om voordat u deze op de monsterhouder van de chemiluminometer plaatst. Open de monster lade en plaats de buis #1 in de monsterhouder. Sluit vervolgens de voorbeeld lade en wacht tot het lezen van de relatieve licht eenheid (RLU).
- Herhaal stap 2,10 voor buis 2 en buis 3.
- Herhaal stap 2,10 voor dubbele buizen 1, 2 en 3.
Opmerking: Probeer alle buizen voor dezelfde hoeveelheid tijd te Vortex tijdens stappen 2.10 – 2.12. - Nadat alle buizen zijn verwerkt, moet u er rekening mee dat de resultaten van EA automatisch worden berekend en afgedrukt. Niveaus worden uitgedrukt als EA-eenheden en vertegenwoordigen het gemiddelde van dubbele bepalingen van dezelfde monsters.
- Herhaal de stappen 2,2 tot en met 2,13 voor elk bloedmonster dat moet worden getest.
- Bewaar na afloop van de test de overgebleven reageerbuisjes en EA-reagentia gedurende maximaal 30 dagen bij 2 – 8 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een 72-jarige man werd toegelaten tot de spoeddienst (ED) van een academisch stedelijk ziekenhuis. Een paar dagen eerder had hij aan zijn primaire zorg arts die klagen over branden op urineren gepresenteerd. Een korte-cursus therapie met orale foshomycine werd aanbevolen. Zijn medische geschiedenis omvatte hypertensie, ongecompliceerde type-2 diabetes en goedaardige prostaathyperplasie. Zijn medicijnen waren enalapril, Atorvastatine, tamsulosine en metformine.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Septische shock is tegenwoordig nog steeds geassocieerd met een sterfte zo hoog als 40%, hoewel dit percentage varieert volgens de overwogen rapporten16. De behoefte aan nieuwe en betere biomerkers wordt bepleit door de meeste deskundigen op de gebieden om clinici te helpen bij vroegtijdige diagnose, beter beheer en prognosticatie van patiënten met septische shock6.
Het uitvoeren van een EA-test vereist geen eerdere technische kennis of geavancee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Estor SpA had betrekking op de kosten van de publicatie van het dagboek en de kosten voor videoproductie. De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Paolo Braganò en Lisa Mathiasen, Ph.D. voor hun beoordeling van de methodologie van het assay protocol. Dario winterton, MD heeft substantiële hulp geboden bij het herzien van het manuscript voor Engelse taalvaardigheid.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Pakket met 20 tests + 1 kwaliteitscontrole |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
Referenties
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
- Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).
- Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
- Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).
- Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).
- Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).
- Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).
- Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).
- Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).
- Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218(2014).
- Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
- Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).
- Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).
- Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).
- Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).
- Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10 (7), (2015).
- Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).
- Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).
- Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).
- Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42 (3), 521-528 (2014).
- Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28 (5), 524-529 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
