Inductie en evaluatie van inteelt kruisen met behulp van de mier, Vollenhovia Emeryi

Samenvatting

In dit protocol, worden methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen, en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen, beschreven voor de mier Vollenhovia emeryi. Deze protocollen zijn belangrijk voor experimenten gericht op het begrijpen van de genetische basis van geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen).

Samenvatting

De genetische en moleculaire componenten van de seks-bepaling cascade zijn uitvoerig bestudeerd in de honingbij, Apis mellifera, een Hymenoptere model-organisme. Echter, er is weinig bekend over de mechanismen van de seks-bepaling gevonden in andere niet-model Hymenoptere taxa, zoals mieren. Vanwege de complexe aard van de levenscyclus die geëvolueerd in de Hymenoptere soorten, is het moeilijk te handhaven en uit te voeren experimentele kruisingen tussen deze organismen in het laboratorium. Hier beschrijven we de methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen in mier Vollenhovia emeryi. Inducerende inteelt in het laboratorium met V. emeryi, is relatief eenvoudig vanwege de unieke biologie van de soort. Specifiek, deze soort produceert alopecia mannetjes en vrouwelijke reproductives vertonen vleugel polymorfisme, waardoor eenvoudiger identificatie van de fenotypen in genetische kruisen. Bovendien, is evaluatie van het succes van inteelt eenvoudig zoals mannetjes kunnen continu worden geproduceerd door inteelt kruisen, terwijl normale mannen alleen tijdens een welomschreven reproductieve seizoen in het veld weergegeven. Ons protocol toestaan voor het gebruik van V. emeryi als een model om te onderzoeken van de genetische en moleculaire basis van het geslacht bepaling systeem in mier soorten.

Inleiding

Hymenoptere eusociale taxa, zoals mieren en bijen, geëvolueerd in een systeem van haplodiploid seks-bepaling in welke personen die heterozygoot op één of meer aanvullende seks vastberadenheid zijn loci (CSD) geworden vrouwtjes, terwijl degenen die homo- of hemizygous mannetjes (Figuur 1A)¹geworden.

Genetische en moleculaire componenten die betrokken zijn bij het geslacht bepaling trapsgewijs zijn goed bestudeerd in de honingbij, Apis mellifera, een Hymenoptere model organisme^2,3,4. Recente vergelijkende genomica-onderzoek suggereren dat de mieren en honingbijen vele putatief homologen in het geslacht bepaling traject, zoals het eerste geslacht bepaling gen, csd⁵delen. Bewijs voor de functionele instandhouding van deze homologen ontbreekt echter nog steeds in de mieren.

Om aan te pakken dit probleem, inteelt lijnen moeten worden ontwikkeld, zoals ze essentieel voor genetische kartering en moleculaire studies zijn. Het is echter moeilijk te handhaven en uit te voeren experimentele kruisingen tussen deze organismen in het laboratorium vanwege de complexe aard van de levenscyclus die geëvolueerd zijn.

Hier, gebruiken wij Vollenhovia emeryi als een model om te onderzoeken van de genetische en moleculaire basis van het geslacht bepaling systeem in mieren^6,7. De inteelt lijnen van deze soorten zijn eerder ontwikkeld voor koppeling toewijzing van kwantitatieve trait loci (QTL) voor traits gerelateerde geslacht bepaling voor de eerste keer in mieren⁶. Daarnaast is de moleculaire seks-bepaling cascade onderzochte⁷geweest. Deze soort heeft zich ontwikkeld van een ongewone reproductiesysteem die gebruikmaakt van zowel de gynogenesis als de androgenesis (Figuur 1B)^8,9. De meeste nieuwe koninginnen en mannetjes klonaal geproduceerd van de moeders en vaders genomen, respectievelijk. Bovendien, werknemers en sommige koninginnen seksueel worden geproduceerd⁸. Deze reproductiesysteem is bijzonder goed geschikt voor genetische studies omdat de inteelt kruisen geproduceerd met behulp van seksueel geproduceerd koninginnen en mannetjes genetisch gelijkwaardig is aan een klassieke backcross zijn. Aangezien seksueel geproduceerde queens verschillen morfologisch uit queens geproduceerd van moederlijk genoom¹⁰ (Figuur 1B), is uitvoeren en evalueren van inteelt kruisen sterk vereenvoudigd met behulp van deze methode.

In dit artikel, de methoden voor de vaststelling van laboratorium kolonies voor Overstekende test, kruist toepassing van inteelt met behulp van full-sib paren en het evalueren van het succes van deze kruisen met behulp van genotypering van leden van de kolonie en dissectie van mannelijke nakomelingen geslachtsorganen worden beschreven in V. emeryi.

Ongeacht de reproductiesysteem werkzaam, is toepassing van inteelt kruisen vaak de eerste essentiële stap aan een onderzoek naar geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen). Bijvoorbeeld in Cardiocondyla obscuriortoont het bijna volledig ontbreken van diploïde mannetjes na 10 generaties van full-sib paring in het laboratorium gebrek aan CSD locus¹¹. Het is mogelijk om te voorspellen van het aantal CSD loci van de verhouding tussen mannetjes geproduceerd in inteelt kruisen^6,12,13.

Protocol

1. field van de collectie en het onderhoud van V. Emeryi kolonies in het laboratorium

Opmerking: Nesten van V. emeryi zijn gevonden in rottende logboeken en gevallen secundaire bossen via rottend boom-branchesin in heel Japan. Deze soort bevat twee soorten koloniën, dat wil zeggen, (1) kolonies produceren alleen lange-gevleugelde koninginnen en (2) de kolonies vooral de productie van korte-gevleugelde koninginnen naast kleine aantal lange-gevleugelde koninginnen^8,14. We verzameld in dit protocol, het laatstgenoemde type van kolonies in de Japanse prefectuur Ishikawa.

1. V. emeryi kolonies verzamelen in de vroege zomer.
   Opmerking: Voor het verkrijgen van voldoende aantal seksuele individuen tijdens het reproductieve seizoen, kolonies met meer dan 300 individuen hebben de voorkeur.
2. De mier specimens van de verzamelde takken overbrengen naar het nest van een kunstmatige gips met een glazen cover met behulp van een aspirator (Figuur 2, links).
3. Handhaven kolonies in het kunstmatig nest bij 25 ° C onder een 16:8 h licht/donker cyclus. Leidingwater voorzien van een wash-fles te nat van de pleister.
   1. Voeg ongeveer 100 mg van droge cricket poeder gewikkeld in aluminiumfolie en een bruine suiker water gevulde tip (20 µL tip) om de andere dag tot nieuwe reproductives (F₁ gevleugelde-queens en F₁ mannetjes) ontstaan.

2. experimenteel laboratorium kruisen

Opmerking: Nieuwe reproductives beginnen te ontstaan uit de late zomer en het najaar (Figuur 3). Lange-gevleugelde koninginnen seksueel worden geproduceerd, en korte-gevleugelde koninginnen klonaal worden geproduceerd en hebben het moederlijk genoom (Figuur 1). Gebruik lange-gevleugelde koninginnen en mannetjes voor inteelt kruisen.

1. Om te stoppen met personen uit het verplaatsen, plaatst u kolonies in een voortdurende omgeving kamer bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
2. Verwijder de medio-benen van 30 werknemers die gebruikmaken van de verlostang onder een stereoscopische Microscoop en ze vervolgens overbrengen naar de nieuwe kleinere gips nest (Figuur 2, rechts) voor inteelt kruisen.
   Opmerking: De poten zijn verwijderd om te onderscheiden van de huidige werknemers van de werknemers die zal worden geproduceerd door de latere inteelt kruisen.
3. Voeg 3-4 larven of poppen in een nest van de pleister met werknemers.
   Opmerking: Werknemers in de F₀ queens-minder kolonie verkennend activiteit weergeven. Larven of poppen kunnen effectief aantrekken voor deze werknemers en de nieuwe reproductives in het centrum van de kolonie tijdens kruising test. Dientengevolge, houden omstandigheden van de experimentele kolonie dicht bij de normale kolonie.
4. Pipetteer een lange-winged koningin en een man in een nest van de pleister bereid in stap 2.3 voor inteelt kruisen.
5. Houd de kolonies bij 25 ° C onder een 16:8 h licht/donker cyclus met voedsel en water zoals beschreven in punt 1.3 totdat de koningin verliest haar vleugels en leggen eieren.
   Let op: Dit duurt een week tot een maand.
6. Controleer de experimentele kolonie elke dag onder een stereoscopische Microscoop. Na uitvoeren van inteelt tussen de nakomelingen van F_{1 kruist} , kunnen de eieren onder een stereoscopische Microscoop worden waargenomen.
7. Na de F begint₁ koningin legt eieren, F₁ mannetjes en larven of poppen toegevoegd in stap 2.3 van het nest om te voorkomen dat het mengen van de F-₁ -generatie (mannetjes en vrouwtjes gebruikt voor inteelt kruisen) en de F₂ generatie (nakomelingen verwijderen geproduceerd uit inteelt kruisen).
   Opmerking: Als er weinig mannetjes in de kolonie, het is mogelijk voor het opwekken van inteelt kruisen met behulp van één mannetje en 1 tot en met 3 Koninginnen in de dezelfde experimentele kolonie.
8. Houd kolonies onder de dezelfde conditionsas beschreven in punt 1.3, totdat F₂ nakomelingen ontstaan.
   Opmerking: Overdracht F₁ koningin en F₂ nakomelingen in nieuwe grotere gips nest (Figuur 2, links) voor lange termijn kolonie houden.

3. evaluatie van inteelt succes

1. DNA-extractie en de genotypering van de ouderlijke generatie (F,₀)
   1. Verwijderen van een been van een F₀ koningin met pincet en breng het been naar een 1,5 mL microtube met 100 µL van chelatie agent.
   2. Onder een stereoscopische Microscoop, een vrouwelijke buik in glazen schotel gevuld met 300 µL van ultrazuiver water met behulp van de verlostang ontleden en isoleren van de spermatheca met het sperma van de erop mannetjes.
   3. Schil weg het weefsel van de spermatheca en isoleren van het sperma uit het weefsel van de vrouw met behulp van insect pins.
      Opmerking: Om te vergemakkelijken zaadextractie uit de spermatheca, slaan vrouwelijke exemplaren in 100% EtOH voor meer dan één dag vóór de dissectie.
   4. Met behulp van een micropipet, breng het sperma in een 1,5 mL microtube met 100 µL van chelatie agent.
   5. Incubeer monsters van F₀ koningin en het sperma bereid in stap 3.1.1 en 3.1.3, respectievelijk, bij 95 ° C gedurende 20 min. Flash Centrifugeer de microtube en bewaren bij 4 ° C.
   6. Elders beschreven genotype alle monsters met methode⁴.
2. DNA-extractie uit het paar van mieren gebruikt voor inteelt kruisen (F-₁)
   1. Na bevestiging van de eiproductie door de sib F₁ koningin gekruist, pak het DNA van de koningin met haar vleugels schuur of een half been en genotype met behulp van dezelfde methode zoals beschreven in sectie 3.1 hierboven.
   2. Uittreksel van DNA van F₁ man met één been en genotype ze met behulp van dezelfde methode zoals beschreven in sectie 3.1 hierboven.
      Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen in 100% EtOH vóór de extractie van DNA en DNA in chelatie agent kan worden opgeslagen voor twee maanden bij 4 ° C.
3. Evaluatie van de mannelijke vruchtbaarheid bij mannen geproduceerd uit inteelt kruisen
   Opmerking: Diploïde mannetjes geproduceerd uit inteelt kruisen zijn vaak steriele.
   1. Ontleden interne voortplantingsorganen in een glazen schaal met 400 µL van PBS oplossing met pincet.
   2. Verwijder van PBS en voeg 4% paraformaldehyde (PFA) met behulp van een micropipet.
   3. Het oplossen van het weefsel door het broeden in PFA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C).
   4. Wassen weefsel 5 keer met 400 µL van PBS met behulp van een micropipet.
   5. Verdun de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing tot 1 µg/mL in PBS.
   6. Verwijder van PBS en voeg ongeveer 300 µL van deze verdunde DAPI kleurstofoplossing aan weefsel.
   7. Incubeer 15 min onder donkere omstandigheden bij kamertemperatuur (15-25 ° C).
   8. Wassen van weefsel 5 keer met 400 µL van PBS en overdracht van weefsel in midden van dia glas met pincet.
   9. Mount weefsel op montage middellange met Tetramethylrhodamine TRITC-geconjugeerd phalloidin.
   10. Observeren monsters door confocale laser scanning microscoop 20 X of 63 X objectieven.
   11. Gebruik een 405 nm excitatie laser en een hybride detector op 410-530 nm voor de DAPI detectie.
   12. Gebruik een 561 nm excitatie laser en een hybride detector op 565-650 nm voor de detectie van de TRITC.
   13. Gebruik een scan snelheid van 400 Hz (400 lijnen/s) met een resolutie van 1024 × 1024 pixels.
   14. Opnamen met behulp van een softwareplatform.

Resultaten

Resultaten van microsatelliet analyse met behulp van F₀ en F₁ generaties is gebleken dat inteelt kruisen met succes werden geproduceerd (Figuur 4)⁶. Als gevolg van inteelt kruisen, werden erop queens verkregen binnen een maand de experimentele kruising kolonies tot stand te brengen. Een kwart (27.1 ± 8.91% SD) van alle nakomelingen (F₂) uit de inteelt kruisen was man, terwijl de rest vrouwelijk (werknem...

Discussie

Dit artikel demonstreert protocollen die kunnen worden gebruikt voor het opwekken van inteelt kruisen en evalueren van het voorkomen van inteelt in de mier V. emeryi. In de experimenten is genotypering van de individuen gebruikt voor kruisen nodig om ervoor te zorgen dat inteelt kruisen succesvol waren. De effectiviteit van deze kruising tests is echter duidelijk zoals diploïde mannetjes kunnen worden geproduceerd gedurende het hele jaar, terwijl haploïde mannetjes kunnen alleen worden geproduceerd in de herfst ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plaster powder	N/A	N/A	Elke merk kan worden gebruikt
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Elke merk kan worden gebruikt
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Elke merk kan worden gebruikt
Brown shuger	N/A	N/A	Elke merk kan worden gebruikt
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Grootte varieert per aantal mieren
Incbator			Elke merk kan worden gebruikt
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Elke merk kan worden gebruikt
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Neem direct contact op met de constructeur voormeer informatie.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Neem direct contact op met de constructeur voormeer informatie.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Neem direct contact op met de constructeur voormeer informatie.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Neem direct contact op met de constructeur voormeer informatie.
Leica HyDTM	Leica		Neem direct contact op met de constructeur voormeer informatie.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Neem direct contact op met de constructeur voormeer informatie.