Histochemische kleuring en beeldanalyse te kwantificeren van zetmeel in de eierstok Primordia van zoete kers tijdens de Winter-rustperiode te combineren

Samenvatting

Presenteren we een methodologie om te kwantificeren van het zetmeelgehalte in de eierstok primordia in zoete kers (Prunus avium L.) tijdens de winter-rustperiode met behulp van een systeem voor de analyse van afbeelding is gecombineerd met histochemische technieken.

Samenvatting

Veranderingen in zetmeel in kleine structuren zijn gekoppeld aan belangrijke gebeurtenissen tijdens verschillende plant ontwikkelings processen, waaronder de reproductieve fase van bestuiving tot bevruchting en het begin van de vruchtzetting. Echter variaties in zetmeel tijdens bloem differentiatie niet volledig bekend zijn, voornamelijk als gevolg van de moeilijkheid van het zetmeelgehalte in de met name kleine structuren van de bloem primordia kwantificeren. Hier beschrijven we een methode voor de kwantificering van zetmeel in de eierstok primordia van zoete kers (Prunus avium L.) met behulp van een systeem voor de analyse van afbeelding is gekoppeld aan de Microscoop, waarmee de betreffende de wijzigingen in de inhoud van de zetmeel met de verschillende fasen van ruststadia van herfst naar het voorjaar. Voor dit doel, wordt de status van de rustperiode van bloemknoppen bepaald door de evaluatie van de groei van de kiem van scheuten overgedragen aan gecontroleerde omstandigheden op verschillende momenten in de winter. Voor de kwantificering van zetmeel in de eierstok primordia, bloemknoppen zijn sequentieel verzameld, vaste, ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gekleurd met I₂Kl (kalium jodide-jodium). Preparaten worden waargenomen onder de Microscoop en geanalyseerd door een afbeelding-analyzer die duidelijk zetmeel van de achtergrond onderscheidt. Zetmeel inhoud waarden worden verkregen door het meten van de extinctie van de afbeelding die correspondeert met de gekleurde zetmeel, gelet op de som van de extinctie van elke pixel als een schatting van het zetmeelgehalte van het frame studeerde.

Inleiding

Gematigde houtachtige planten aan te passen aan de seizoenen door modulerende hun groei en ontwikkeling. Terwijl ze tijdens de lente en de zomer ontwikkelen, stoppen ze met groeien in het najaar te gaan slapend in winter¹. Hoewel ruststadia hen in staat stelt om te overleven bij lage wintertemperaturen, is koelen een voorwaarde voor een goede budburst in voorjaar². De belangrijke implicaties rustperiode in gematigde fruitteelt- en bosbouw van hebben geleid tot diverse inspanningen om te bepalen en te voorspellen de rustperiode periode³. In boom fruitsoorten, empirische experimenten overdracht van scheuten aan het dwingen van voorwaarden en statistische voorspellingen op basis van gegevens van de bloei zijn huidige benaderingen om te bepalen van de datum van het breken rustperiode, waarmee onderzoekers te schatten van de koeling eisen voor elke cultivar. Het bepalen van de status van de rustperiode op basis van biologische processen blijft echter onduidelijk³.

Bloei in gematigde fruitbomen, zoals zoete kers (Prunus avium L.), gebeurt eenmaal per jaar en duurt ongeveer twee weken. Echter beginnen bloemen te differentiëren en ontwikkelen van ongeveer 10 maanden eerder, tijdens de vorige zomer⁴. Bloem primordia stoppen met groeien in het najaar te blijven slapende binnen de knoppen in de winter. In deze periode moet elke cultivar accumuleren een bepaalde koelen vereiste voor goede bloei⁴. Ondanks het ontbreken van fenologische veranderingen in de knoppen in de winter, bloem primordia fysiologisch actief zijn tijdens de rustperiode en de accumulatie van koelen temperaturen heeft onlangs in verband gebracht met de dynamiek van de accumulatie van zetmeel of verkleinen binnen de cellen van de eierstok primordium, biedt een nieuwe aanpak voor ruststadia bepaling⁵. Echter, de geringe omvang en de locatie van de eierstok primordium vereisen een speciale methodologie.

Zetmeel is de grote opslag koolhydraat in houtige plant soorten⁶. Dus, veranderingen in zetmeel verband met de fysiologische activiteit van de weefsels van de bloem, die koolhydraten moeten ter ondersteuning van hun ontwikkeling^7,8. Verschillende belangrijke gebeurtenissen tijdens het reproductieve proces zijn ook gerelateerd aan variaties in zetmeelgehalte in verschillende bloemen structuren, zoals helmknop meiose⁹, de groei van de stuifmeel-buizen door middel van de stijl of zaadknop bevruchting¹⁰. Histochemische technieken zorgen ervoor dat het zetmeel in elke specifieke weefsel van de bloem primordia tijdens de rustperiode. Het probleem blijft echter in het kwantificeren van dat zetmeel om na haar patroon van accumulatie/daling in tijd of in het zetmeel vergelijken inhoud onder weefsels, cultivars of jaren. Dit is te wijten aan de kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar voor de analytische technieken¹¹. Als alternatief kan beeldanalyse gekoppeld aan microscopie¹² de kwantificering van het zetmeel in zeer kleine steekproeven van plant weefsel¹³.

Benaderingen combineren microscopie en beeld analyse zijn gebruikt voor het kwantificeren van de inhoud van verschillende onderdelen in plantaardige weefsels, zoals de callose¹⁴, slangen¹⁵, of¹⁶, door het meten van de grootte van het gebied geverfd door specifieke zetmeel vlekken. Voor zetmeel, dit kan worden gemakkelijk gedetecteerd met behulp van de kaliumjodide-jodium (ik₂KI) reactie¹⁷. Deze methode is zeer specifiek; Ik₂KI intercalates binnen de laminaire structuur van zetmeel korrels en vormt een donker blauwe of roodbruine kleur, afhankelijk van de inhoud van de amylose van de zetmeel-¹⁸. Secties gekleurd met I₂KI vlek Toon voldoende contrast tussen zetmeel en het weefsel van de achtergrond, waardoor de detectie van een ondubbelzinnige zetmeel en de daaropvolgende kwantificering door de afbeelding analyse systeem¹⁹. Hoewel deze kleurstof niet stoichiometrische is, is de accumulatie van jodium evenredig aan de lengte van het zetmeel-molecuul, die sterk van^{17 variëren kan}. Dus, de grootte van de gebrandschilderde gebied, uitgedrukt als het aantal pixels kan niet weerspiegelen nauwkeurig de inhoud van zetmeel, aangezien hoge verschillen in zetmeelgehalte kon worden gevonden tussen velden met gekleurde gebieden van vergelijkbare grootte. Als alternatief kan het zetmeelgehalte worden geëvalueerd door het meten van de extinctie van de gekleurde korrels op zwart-witafbeeldingen verkregen van de Microscoop, zoals het is gemeld in verschillende weefsels in abrikoos^{8,13 , 19}, avocado^10,20, en olijf²¹.

Hier beschrijven we een methodologie die de experimentele bepaling van de status van de rustperiode met de kwantificering van zetmeelgehalte in de eierstok primordium weefsel van herfst combineert naar het voorjaar in zoete kers, het aanbieden van een nieuwe tool voor het begrip en de voorspelling rustperiode op basis van de studie van de biologische mechanismen van gekoppeld rustperiode.

Protocol

1. ruststadia vastberadenheid en Plant materiaal collectie

1. Proef de bloemknoppen in het veld. Ruststadia studies zijn op lange termijn experimenten en vereisen volwassene bomen groot genoeg voor het verzamelen van de toppen en schiet alle winter zonder afbreuk te doen aan de bomen ontwikkeling in het volgende voorjaar. Speciale boomgaard beheer zou vereist afhankelijk van het opleidingssysteem; snoeien mag dus minder ernstig dan voor productiedoeleinden vruchten.
   1. Elke week, vanaf het begin van de herfst tot het begin van de knop pauze, verzamelen en weegt 10 bloemknoppen.
   2. De bloemknoppen bevestigen door ze te plaatsen in een 10-mL glazen buis met een dop en geniet van de monsters in een kleefpoeders oplossing van ethanol/azijnzuur (3:1) gedurende ten minste 24 uur bij 4 ° C. Vervolgens negeren de fixeer en toevoegen van 75% ethanol, royaal ervoor te zorgen dat het betrekking heeft op de monsters. De monsters kunnen worden bewaard in deze oplossing bij 4 ° C tot gebruik.
      Opmerking: Vacuüm infiltratie kan worden gebruikt om te verwijderen van de luchtbellen in de kiem en te voorkomen dat ze zweven. Dit vergemakkelijkt de penetratie van de fixeerspray in de weefsels, maar de structuur van de weefsels beschadigen. Proberen te vermijden indien niet nodig.
2. Proef de asperges in het veld.
   1. Elke week, vanaf het begin van de herfst tot het begin van de knop pauze, nemen drie scheuten van 15-30 cm lang en 5 mm diameter, bevattende ten minste 10 bloemknoppen elke. Plaats ze op water doordrenkte bloemist schuim in een zaal van de groei bij 22 ± 1 ° C met een lichte fotoperiode van 12u.
   2. Na 10 dagen in de kamer van de groei, kies en weeg 10 bloemknoppen van de scheuten.
3. Evalueren van de groei van de kiem en bepalen van de status van de rustperiode. De bemonstering moet worden aangepast aan de omstandigheden van de locatie. In de boomgaard-voorwaarden (Zaragoza (Spanje), 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W en 220 m boven zeeniveau), de bemonstering van de scheuten werd uitgevoerd van 30 November tot eind februari of begin maart.
   1. Wekelijks evalueren de reactie van de bloemknoppen aan de geschikte groei omstandigheden van de kamer, vanaf het begin van de herfst tot budburst in het voorjaar, door het vergelijken van het gewicht van de 10 knoppen geplukt uit het veld.
   2. Als er geen verschillen zijn of deze verschillen minder dan 30 zijn %, van mening dat de knoppen niet hebben voldaan aan hun koelen eisen en endodormant^{22 zijn}. Als de verschillen zijn meer dan 30%, kunt u overwegen dat de knoppen hebben voldaan aan hun koelen voorschriften en ecodormant²².

2. plant materiaal voorbereiding voor zetmeel kwantificering

1. Selecteer ongeveer zes vaste toppen van elke monsterneming datum (zie stap 1.1). Afhankelijk van de cultivars bevat elke zoete kers bloem bud maximaal vijf bloem primordia.
   1. Verwijderen van de schubben van de externe knop en plaats de kiem op een horlogemaker van glas met 75% ethanol te voorkomen uitdroogt.
   2. Ontleden van de kiem en extract van ten minste één bloem primordium per knop met de hulp van precisie pincet en een oogcontrole scalpel onder een stereoscopische Microscoop. De primordium van de bloem kan worden bewaard in een 10-mL glazen buis met 75% ethanol bij 4 ° C, of ga direct naar de volgende stap.
2. De monsters in een reeks van tertiaire butylalcohol uitdrogen.
   1. De 75% ethanol oplossing vervangen door 10 mL van 75% tertiaire butylalcohol (TBA) te royaal dekken de monsters en incubeer hen gedurende 1,5 uur. Een pipet van Pasteur annuleerteken zitten nuttig voor het negeren van de oplossing.
   2. Herhaal stap 2.2.1, TBA met stijgende concentraties (100%, 85% en 95% v/v; en 3 x met zuivere TBA) toe te voegen in een droogrek kachel bij 30 ° C met lucht extractie, aangezien puur TBA crystalizes bij kamertemperatuur (< 20 ° C) en zeer vluchtige en giftige is. Als TBA crystalizes met het monster, zou het de weefsels beschadigen.
3. De monsters in paraffine¹⁸insluiten.
   1. Smelt de paraffine door de invoering van de parels van de paraffine in de drogen kachel bij 60 ° C met lucht extractie de vorige dag. De parels van paraffine kunnen ook op een kookplaat worden gesmolten, maar ervoor zorgen dat de vloeibare paraffine bij 60 ° C en niet bij een hogere temperatuur, om te voorkomen dat weefselschade.
   2. De TBA vervangen door een mix van TBA en paraffine olie (1:1) en incubeer gedurende 24u binnen een droogrek kachel bij 60 ° C. Vervang vervolgens de mix van TBA en paraffineolie met zuivere paraffine smelten en incubeer gedurende ten minste 6 uur binnen een droogrek kachel bij 60 ° C. Herhaal het 2 x en de laatste wijziging voor ten minste 4-6 d uit te broeden.
   3. Plaats elk monster op een kleine metalen basis mal over een oppervlak van warmte, ingebed in paraffine, en tempo de insluiten cassette. Plaats deze over een koud oppervlak en het blok verwijderen zodra de was is gestold.
4. Afdeling en hydrateren van de voorbereidingen.
   1. Haupt van lijm bereiden: Los 1 g gewoon Knox gelatine in 100 mL gedestilleerd water bij 30 ° C; Voeg vervolgens 2 g van fenol losse kristallen (C₆H₅OH) en 15 mL glycerol. De Haupt van lijm verspreid over een glasplaatje met een borstel en voeg een druppel van een 1% formaldehyde-oplossing.
   2. Sectie elke paraffine blokkeren op 10 µm in een hiervoor microtoom en plaats van de secties op het glasplaatje bedekt met Haupt van lijm.
   3. Plaats het glas dia's met de secties over een oppervlak van warmte bij 35-40 ° C tot droog; vervolgens verplaatst u de glazen dia's naar een dia-rack.
   4. De dewax en rehydratatie oplossingen voor te bereiden. Plaats van 200 mL van Histoclear II in drie glazen-kleuring gerechten, een met Histoclear II:ethanol (1:1, v/v), een serie van ethanol (100%, 70%, 40%, v/v), en een laatste gedistilleerd water wassen.
   5. Dewax van de secties met drie wast, elke 5 min, in Histoclear II en Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Plaats de rek van de dia binnen de glas-kleuring gerechten, ervoor te zorgen dat de oplossing volledig heeft betrekking op de dia's, en vervolgens verplaatst het dia-rek van één oplossing naar de volgende.
   6. Hydrateren van de secties door de volgende reeks 2-min wast: een serie van ethanol (100%, 70%, 40%, v/v) en een definitieve gedistilleerd water wassen. Ten slotte droog glas dia's bij kamertemperatuur.
5. De secties¹⁸vlek.
   1. Ik₂KI vlek voor te bereiden: los 2 g kaliumjodide (KI) en 0.2 g van jodium (ik₂) in 100 mL gedestilleerd water. Toepassing van een daling van zoet ik₂KI over de sectie (s) voor 5 min en vervolgens de overmaat van de vlek te verwijderen door het absorberen van het met een vloeipapier. Ga snel naar de volgende stap.
   2. Toepassen van een kleine daling van een synthetische montage media, plaats een kleine glazen cover op bovenkant en hard drukken. Zodra de montage media droogt, observeren onder een heldere-veld Microscoop voor een voorafgaande beoordeling van het zetmeel van de eierstok.
      Opmerking: Deze stap is niet verplicht, hoewel een beter contrast tussen het zetmeel en de achtergrond wordt verkregen. Als de sectie opnieuw worden gebruikt met andere vlekken na zetmeel kwantificering moet, plaatst u het glas cover op de daling van de vlek en negeren de overmaat door het absorberen van het met een vloeipapier (zie 2.5.1). Daarna, na zetmeel kwantificering, wassen uit de ik₂KI vlek met gedestilleerd water en plaats de voorbereidingen op een vuurtje bij 35-40 ° C tot droog oppervlakte.

3. kwantificering van het zetmeelgehalte

1. Kalibreren van de optische voorwaarden.
   Opmerking: De detectie niveaus gebruikt door de afbeelding analyzer te detecteren het gebeitst zetmeel zijn rechtstreeks afhankelijk van de lichtomstandigheden en vergroting van de Microscoop; Dus, vast te stellen van de voorwaarden voor alle voorbereidingen geëvalueerd. De aanpassing die hier voorgesteld om de beschikbare Microscoop en de lichtomstandigheden aanpassen.
   1. Het middenrif diafragma op de 20 X vergroting en de helderheid of de lichtintensiteit aanpassen.
   2. Ervoor te zorgen dat er geen filters op de filterhouder zijn en selecteer een voorwaarde voor helder-veld in de Microscoop. Selecteer een geschikte vergroting (bv40 X voor zoete kers eierstok primordium).
2. Bepalen het algemene beeld inkoopvoorwaarden. Pas de instellingen van de camera met een gekleurd preparaat zonder weefsel via afbeelding | Overname | Pre weergave.
   1. Vaststellen van de helderheid op 50%, de winst op 1.0 x, en de indicatoren van de histogram de gamma waarde 1,00 en het contrast bij 0 - 100, voering met de grenzen van het histogram van de distributie helderheid.
   2. Activeren van de functie van overbelichting/onderbelichting en pas de belichtingstijd op de grens van overbelichting.
   3. De witbalans functie toepassen op de volledige afbeelding alle neutraal gekleurde componenten van de afbeelding zonder enige kleurtoon en de correctie van de arcering om aan te tonen het volledige beeld een gecorrigeerde en homogene installatiekopie maken.
3. Kalibreer het systeem van de analyse van het beeld te verkrijgen van de waarden van de besturingselementen van het grijze niveau (0, zwart, 255, wit) van verschillende optische dichtheid (OD) die worden verkregen door de waarden doorlatingsfactor (T).
   1. Verwerven van een afbeelding van een gekleurd preparaat zonder weefsel, rekening met de witte controle en meten van de grijze niveau van de zwart-wit beeld via maatregel | Maatregel grijs | Kalibreren van grijs | Referentiewaarde = 0 | Maatregel | Kalibreren | OK. Dit komt overeen met een lichtdoorlatendheid van 100%; Dus, een optische dichtheid van 0, volgens OD = 2 - Meld u T.
   2. Verwerven van een afbeelding van het zelfde preparaat met een 4N-filter, dat de hoeveelheid licht 4 vermindert x en maatregel het grijze niveau van de zwart-wit beeld via maatregel | Maatregel grijs | Kalibreren van grijs | Referentiewaarde = 0,6 | Maatregel | Kalibreren | OK. Dit komt overeen met een 25% lichtdoorlatendheid; Dus, een optische dichtheid van 0,6, volgens OD = 2 - Meld u T.
   3. Verwerven van een afbeelding van het zelfde preparaat zonder licht, weloverwogen zwart en de grijze meten van de zwart-wit beeld via maatregel | Maatregel grijs | Kalibreren van grijs | Referentiewaarde = 1 | Maatregel | Kalibreren | OK. Dit komt overeen met een 0% lichtdoorlatendheid; Dus, een optische dichtheid van 1, volgens OD = 2 - Meld u T.
4. Detecteren van zetmeel.
   1. Verwerven van een kleurenafbeelding van het veld om te meten in TIFF-indeling met een resolutie van minstens 300 dots per inch (dpi).
   2. Maak een binaire afbeelding die overeenkomt met de oppervlakte die gekleurd. De drie kleur drempels (waarden tussen 0 - 255 voor elk) totdat de binaire image precies de korrels van de gekleurde zetmeel waargenomen weerspiegelt, via afbeelding | Detecteren | Selecteer de drempels van rood, blauw en groen | OK. Herhaaldelijk visuele vergelijkingen in verschillende preparaten en weefsels te tunen van de uiteindelijke detectie niveaus maken Opslaan en gebruik deze niveaus voor alle voorbereidingen.
   3. Het zetmeel te kwantificeren. De oorspronkelijke kleurenafbeelding converteren naar een zwart-wit beeld met het systeem van de analyse van de afbeelding. De binaire image gebruiken als een bovenliggende masker aan de zwart-wit beeld via afbeelding | Binaire bewerken. Meten van de som van de extinctie van elke pixel onder het masker via maatregel | Grijs niveau | OK en deze waarde als het zetmeelgehalte op het gemeten gebied beschouwen.
   4. Herhaal stap 3.4.1 - 3.4.3 in vier plaatsen van de eierstok primordia om een representatieve waarde van de inhoud van de zetmeel in het ovarium van bloem primordia te verkrijgen.
   5. Herhaal stap 3.4.1 - 3.4.3 en 3.4.5 in verschillende bloemen verzamelen na elke stap.

Resultaten

Ruststadia studies vereisen de bepaling van het moment wanneer het koelen eisen is voldaan. Ondanks het ontbreken van fenologische veranderingen in de winter onder veldomstandigheden (figuur 1A) herstellen cherry bomen niet de capaciteit van de groei onder passende voorwaarden totdat ze een bepaalde periode onder lage temperaturen geven. De regelmatige overdracht van scheuten aan een gecontroleerde omstandigheden kamer (figuur 1B...

Discussie

Rustperiode in houtachtige planten presenteert duidelijke gevolgen in fruitteelt- en bosbouw in een veranderend klimaat, hoewel het biologische proces achter ruststadia onduidelijk blijft. Ruststadia studies kunnen vanuit verschillende gezichtspunten worden benaderd, maar het onderzoek op zoek naar een biologische marker voor de winter-rustperiode is toegenomen de laatste jaren. Echter, zijn de meeste pogingen om te vinden een duidelijke indicator weergeven wanneer een knop ruststadia heeft gebroken mislukte

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Roestvrij staal
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550