Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren

Samenvatting

Hier presenteren we een methode om te isoleren van de bijnieren van muizen, repareren de weefsels, sectie hen en uitvoeren immunofluorescentie kleuring.

Samenvatting

Immunofluorescentie is een gevestigde techniek voor de detectie van antigenen in weefsel met de tewerkstelling van fluorescerende-geconjugeerde antilichamen en heeft een breed spectrum van toepassingen. Detectie van antigenen zorgt voor karakterisering en de identificatie van meerdere celtypen. Gelegen boven de nieren en ingekapseld door een laag mesenchymale cellen, is de bijnier een endocriene orgel, gecomponeerd door twee verschillende weefsels met verschillende embryologische oorsprong, de mesonephric tussentijdse mesoderm afkomstige buitenste cortex en de neurale Crest-afgeleide innerlijke medulla. De bijnierschors scheidt steroïden (dat wil zeggen, mineralocorticoids, glucocorticoïden, geslachtshormonen) Overwegende dat de medulla bijnier catecholamines (dat wil zeggen, adrenaline, noradrenaline produceert). Terwijl de bijnier onderzoek, is het belangrijk om te kunnen onderscheiden van unieke cellen met verschillende functies. Hier bieden we een protocol ontwikkeld in ons laboratorium dat een reeks opeenvolgende stappen die nodig zijn beschrijft voor het verkrijgen van de immunofluorescentie kleuring te karakteriseren van de celtypes van de bijnier. Eerst richten we ons op de dissectie van de muis bijnieren, de microscopische verwijdering van vet van periadrenal gevolgd door de fixatie, verwerking en paraffine inbedding van het weefsel. Vervolgens beschrijven we afdelen van het weefsel blokken met een roterende microtoom. Tot slot, we detail een protocol voor immunefluorescentie verkleuring van de bijnieren die we hebben ontwikkeld om te minimaliseren van zowel de niet-specifieke antilichaam binding en de autofluorescence met het oog op een optimale signaal.

Inleiding

Immunohistochemistry is een techniek voor het opsporen van weefsel componenten met het gebruik van antilichamen tegen specifieke cellulaire moleculen en latere kleuring technieken te detecteren de geconjugeerde antilichamen¹. Deze procedure immunohistochemische vereist specifieke fixatie en verwerking van weefsels die vaak empirisch bepaald voor het specifieke antigeen, weefsel en antilichaam gebruikt². Fixatie is van cruciaal belang voor het behoud van de "originele" toestand van het weefsel en daardoor handhaven intact cellulaire en subcellular structuren en expressiepatronen. Verdere zijn verwerking en procedures te embedding verplicht te stellen van het weefsel voor segmenteren in dunne plakjes, die worden gebruikt voor histologische studies waarbij immunohistochemistry.

Immunokleuring kan worden uitgevoerd met chromogenic of fluorescerende detectie. Chromogenic detectie vereist het gebruik van een enzym een oplosbare substraat omzetten in een onoplosbare gekleurde product. Terwijl dit enzym kan worden geconjugeerd met het herkennen van het antigeen (primair antilichaam) antilichaam, is het vaker geconjugeerd met het herkennen van het primaire antilichaam (dat wil zeggen, het secundaire antilichaam) antilichaam. Deze techniek is zeer gevoelig; de gekleurde product dat verkregen wordt uit de enzymatische reactie is van photostable en vereist alleen een helderveld Microscoop voor imaging. Echter chromogenic immunokleuring mogelijk niet geschikt wanneer het proberen om te visualiseren van twee eiwitten die mede lokaliseren, aangezien de afzetting van één kleur de afzetting van de andere maskeren kan. In het geval van co kleuring, heeft immunofluorescentie bewezen voordeliger. De komst van immunofluorescentie wordt toegeschreven aan Albert Coons en collega's, die een systeem ontwikkelde voor het identificeren van weefsel antigenen met antistoffen gemarkeerd met fluoresceïne en hen visualiseren in het verdeelde weefsels onder ultraviolet licht³. Fluorescentie detectie is gebaseerd op een met een fluorophore die licht na excitatie uitzendt geconjugeerd antilichaam. Omdat er verschillende fluorophores met emissies bij verschillende golflengtes (met weinig of geen overlapping), deze detectiemethode is ideaal voor de studies van meerdere eiwitten.

De bijnier is een gepaarde orgaan gelegen boven de nieren en gekenmerkt door twee embryologisch afzonderlijke componenten, omgeven door een mesenchymale capsule. De buitenste bijnierschors, afgeleid van de mesonephric van de tussenliggende mesoderm, scheidt steroïdhormonen terwijl de innerlijke medulla, afgeleid van de neurale crest, produceert catecholamines waaronder adrenaline, noradrenaline en dopamine. De bijnierschors wordt histologisch en functioneel opgedeeld in drie concentrische zones, met elke zone verschillende klassen van steroïdhormonen afscheidende: de buitenste zona glomerulosa (zG) produceert mineralocorticoids die elektroliet homeostase regelen en intravasculaire volume; de middelste zona fasciculata (zF), scheidt direct onder de zG, glucocorticoïden die de stressrespons via de mobilisatie van energie winkels bemiddelen te verhogen van plasma glucose; en de innerlijke zona reticularis (zR), die synthetiseert sex steroïde precursoren (dat wil zeggen, Dehydroepiandrosteron (DHEAS))⁴.

Afwisseling in adrenocortical zonering aanwezig tussen soorten is: bijvoorbeeld, Mus musculus ontbreekt de zR. De unieke postnatale X-zone van M. musculus is een overblijfsel van de foetale cortex gekenmerkt door kleine lipide-armen cellen met acidophilic cytoplasms⁵. De X-zone verdwijnt in de puberteit in mannelijke muizen en na de eerste zwangerschap in vrouwelijke muizen of geleidelijk ontaardt in niet-gefokt vrouwtjes^6,7. Bovendien, de tortuosity en de dikte van de zG exposities gekenmerkt variatie tussen soorten zoals organisatie van perifere stuurpen en voorlopercellen cellen in en grenzend aan de zG. De rat, in tegenstelling tot andere knaagdieren, heeft een zichtbare ongedifferentieerde zone (zU) tussen de zG en zF die functioneert als een zone van de cel van de stam en/of een zone van voorbijgaande aard progenitoren frequentiebanden te versterken. De zU is uniek voor ratten of gewoon een meer georganiseerde prominent cluster van cellen is onbekend^8,9.

Cellen van de bijnierschors lipide druppeltjes die slaan cholesterol esters die als de voorloper van alle steroïdhormonen^{10,11 dienen}.  De term "steroidogenesis" definieert het procedé van vervaardiging van steroïdhormonen uit cholesterol via een reeks enzymatische reacties die betrekking hebben op de activiteit van steroidogenic factor 1 (SF1), waarvan de expressie een marker van steroidogenic potentieel is. In de bijnier is Sf1 expressie alleen in de cellen van de cortex¹²aanwezig. Een interessant onderzoek gevonden de uitdrukking van endogene Biotine in de adrenocortical cellen met steroidogenic potentiële¹³. Hoewel dit kan de oorzaak van een hogere achtergrond in Biotine/streptavidine gebaseerde kleuring methoden, als gevolg van de opsporing van endogene Biotine door antilichaam geconjugeerd met daar, kon dit kenmerk ook worden gebruikt om te onderscheiden van de steroidogenic cellen uit andere populaties in de bijnier, dat wil zeggen, endotheel, kapselvorming en medulla cellen.

De medulla bijnier wordt geïnnerveerd door sympathieke preganglionic neuronen, en wordt gekenmerkt door basofiele cellen met een korrelig cytoplasma met adrenaline en noradrenaline. Medulla cellen heten "chromaffin" als gevolg van het hoge gehalte aan catecholaminen die een bruin pigment na oxidatie^{14 vormen}. Tyrosine hydroxylase (TH) is het enzym dat katalyseert de snelheidslimieten stap in de synthese van catecholamines en in de bijnier, alleen in de medulla¹⁵wordt uitgedrukt.

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van muis bijnieren, de verwerking ervan voor het inbedden in paraffine en segmenteren, en een methode voor het uitvoeren van immunofluorescentie kleuring op bijnier secties teneinde de cellulaire typen vormen de bijnierschors en medulla. Dit protocol is een standaard in ons laboratorium voor immunokleuring met meerdere antilichamen routinematig gebruikt in ons onderzoek.

Protocol

Alle methodes werden uitgevoerd overeenkomstig institutioneel goedgekeurde protocollen onder de auspiciën van het Comité van de Universiteit voor gebruik en verzorging van dieren aan de Universiteit van Michigan.

1. voorbereiding op de operatie

1. Bereiden op de dag vóór de operatie, 4% paraformaldehyde (PFA) / fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). In het geval van bevroren aliquots, gaat u verder met een ontdooien en bewaren bij 4 ° C.
   Opmerking: 4% PFA is niet stabiel gedurende meer dan 48 uur.
   Let op: PFA is giftig, contact met huid en ogen vermijden en gooi in een juiste container.
2. Op de dag van de operatie, bereiden de chirurgische instrumenten door het steriliseren van de schaar en pincet met 70% ethanol (EtOH) en laat ze drogen op een keukenrol.
3. Plaats een 24-well plaat gevuld met 1 x PBS (1 mL/putje is voldoende) in een ijsemmer.
   Opmerking: Bijnieren zal worden gehouden in dit gerecht multi goed cultuur na de operatie.

2. de bijnier dissectie

1. Euthanaseren de muis na standaardprotocollen goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Een secundaire methode voor euthanasie om dood (bijvoorbeeld onthoofding) is vereist.
   1. Voor euthanasie door Isofluraan overdosis, plaatst u de muisaanwijzer in een kamer gevuld met Isofluraan dampen totdat ademhaling ophoudt, dan verwijderen van de muis uit de zaal, leg het op een oppervlak en uitvoeren van cervicale dislocatie.
      Opmerking: De meeste euthanasie methoden veroorzaken nood aan het dier en zijn niet geschikt voor onderzoek van de stress omdat ze de storende variabele van de activering van de hypofyse-bijnier as en Wallenberg catecholamine release kunnen toevoegen. In dit geval is onthoofding de voorgestelde techniek te nemen.
2. Leggen van het muis liggende, steriliseren van de incisie gebied op de buik en flanken met 70% EtOH.
   Opmerking: Terwijl scheren van de vacht tot steriliteit leiden zal, voor deze bepaalde toepassing het is niet nodig.
3. Snijden van de huid in het midden van de buik met behulp van schaar, scheiden van de huid van het buikvlies, deskin van de muis door knijpen van de huid rond de cut en trekken het in twee tegenovergestelde richtingen (caudal en rostraal). Knip het buikvlies tot het bereiken van de posterieure linker- en flanken.
4. Verwijder het stekje lymfkliertest bijnier rond het omliggende vetweefsel en plaatst u deze in de 24-multiwell plaat gevuld met 1 x PBS en gehouden op ijs.

3. Peri-bijnier vet verwijderen

1. Onder een Microscoop ontleden, plaats de bijnier op een glas basis of een petrischaal op de plaat van de fase, positie van de lichtbron, selecteert u de vergroting en past de focus voor een duidelijk zicht op de gehele bijnier.
   Opmerking: De vergroting gebruikt kan variëren afhankelijk van persoonlijke voorkeuren. Een totale vergroting van 30 X met een plan lens 1 X, 3 X zoom en 10 X oculair kunt visualiseren van de hele klier met een goede gezichtsveld.
2. Verwijder snel de aangrenzende vet weefsel met twee naalden in 25 G, het vermijden van uitdroging van de bijnier. Als dit gebeurt voordat alle vet wordt verwijderd, zet de bijnier terug in de put met 1 x PBS voor 1-2 min, en gaat u verder met het vet verwijderingsproces.
3. Wassen 2 x voor elke 2 min in 1 x PBS.

4. de weefsels verwerking en insluiten

1. Bevestigen van de weefsels in 4% PFA/PBS bij 4 ° C op een rockende platform voor 2 h.
2. Verwijderen van de 4% PFA en wassen de weefsels met 1 x PBS, 3 x 15 min bij 4 ° C.
   Let op: PFA is giftig en is een gevaarlijke afvalstoffen; worden moet behandeld met de nodige voorzichtigheid onder een chemische motorkap en verwijderd in een gevaarlijk afval container.
3. Incubeer de bijnieren in 50% EtOH bij 4 ° C op een rockende platform voor 2 h.
4. Incubeer de bijnieren in 70% EtOH bij 4 ° C op een rockende platform voor een minimum van 2 h.
   Opmerking: Als u niet verdergaat met weefsel verwerking voor het insluiten, kunnen de bijnieren worden opgeslagen in 70% EtOH bij 4 ° C. Het vermijden van langdurige opslag in 70% levert EtOH en over te gaan tot het weefsel zo spoedig mogelijk verwerken betere kwaliteit monsters.
5. De bijnier voorbereiden weefsel verwerking door het te verpakken in gaas en het omsluiten van een cassette te embedding weefsel. Plaats de cassette in een pot gevuld met 70% EtOH en bewaren bij 4 ° C tot klaar om naar de processor weefsel. Plaats de cassette in de processor van de weefsel geprogrammeerd zoals vermeld in tabel 1 en start het programma.
6. Breng de cassette in een insluiten station gevuld met gesmolten paraffine bij 65 ° C. Als een koeling station niet beschikbaar is, plaatst u een koude koeling lade ernaast.
7. Label een insluiten schimmel en open het weefsel cassette te embedding. Met behulp van een paar pincet, uitpakken het gaas en plaats de bijnier zachtjes in de gewenste positie in het midden van de basis in de insluiten schimmel. Giet de gesmolten paraffine op de bijnier. Indien nodig, houdt u de bijnier met een tang om haar positie in de mal anders het kan verplaatsen binnen de mal veilig stellen.
8. Zachtjes bewegen de insluiten schimmel aan het Dienblad van de koeling en wachten tot de verharding van de paraffine. Na dat, ter vergemakkelijking van afdelen, slaan insluiten mallen op een koele plaats.

5. afdelen met Rotary Microtome

1. Controleer de microtoom is schoon voordat u begint, borstel weg alle afgedankte paraffine residuen, zorgen dat het mes (of mes) is aangescherpt, olie de interne mechanisme en de blok-houder volledig intrekken indien nodig.
2. Label van een reeks Microscoop dia (positief geladen of bekleed om weefsel verlies te voorkomen (Zie Tabel van materialen)), leg ze op een warmere diareeks bij 37 ° C, en afzien van sommige gesteriliseerde met autoclaaf type 1 ultrazuiver water op de top van elke dia.
3. Sectie dikte vastgesteldop 5 µm.
4. De microtoom blade invoegen in de meshouder, de hoek van het mes, ervoor te zorgen dat het mes stevig in de houder is beveiligd en controleren van de goedkeuring van de paraffine blok en de houder van het blok.
5. De blok-houder brengen haar hoogste positie en, indien mogelijk, operationele handgreepsteun vergrendelen, de paraffine blok uit de mal te verwijderen en leg deze in de blok-houder stevig vastzetten met de klem. De hoek van de middenlijn van het blad met de geconfronteerd oppervlak van het blok moet ongeveer 20°. Zo nodig passen de paraffine-blok.
   Let op: Het mes is scherp.
6. Als eerder is vergrendeld, ontgrendelen het handwiel en lager de paraffine blok totdat haar gezicht niveau met de rand van het blad microtoom is. Draai het wieltje van de hand met een gestage ritme. Uitvoeren van initiële trimmen te ruimen de paraffine en bloot de bijnier.
7. Houd het handwiel te draaien, en afdeling tot het einde van de bijnier. Gebruik een helderveld of ontrafeling van Microscoop om te controleren op de aanwezigheid van weefsel in de secties. Loskoppelen van het lint van het mes en met de hulp van een ander paar pincet plaats het op het water gelegd op het glasplaatje. Het kan zinvol zijn om de plaats van het lint op een oppervlak, zorgvuldig uitrekken en dit vervolgens op de dia koppelen.
8. Laat die de dia's droog op de hete plaat. Vervolgens leg ze plat op een dia lade en bak bij 37 ° C's nachts of langer als het water is nog steeds aanwezig. Eenmaal droog, kunt u de dia's opslaan in een dia doos bij kamertemperatuur.
9. Alle gebruikte apparatuur opgeborgen en reinig de microtoom.

6. immunofluorescentie

1. Selecteer de dia's voor immunokleuring en plaats ze in een dia houder.
2. Op een hete plaat, brengen een bekerglas gevuld met 0,01 M citraat bij pH 2.0 aan de kook. Het volume van de buffer is afhankelijk van de grootte van het bekerglas en moet volstaan voor de dekking van de secties op de dia's tijdens het koken (sommige verdamping moet rekening worden gehouden). Dek het bekerglas af met aluminiumfolie.
   Opmerking: Andere methoden voor het ophalen van het antigeen zijn beschikbaar (Zie discussie).
3. Deparaffinize van de dia's in 100% xyleen 2 x voor elke 5 min. Hydrateren van de dia's met behulp van de volgende reeks: 100% EtOH 2 x voor 5 min, 70% EtOH 2 x voor 5 min, typ 1 ultrazuiver water gedurende 5 minuten.
   Opmerking: Na deparaffinization, is het belangrijk om niet laten de secties uitdrogen: weefselsecties moeten altijd worden bedekt met buffers of oplossingen tot het einde van de procedure of de structuur van het weefsel kan worden beschadigd.
4. Voor het ophalen van het antigeen, plaats van dia's in een metalen dia houder en plaatst u deze in het bekerglas met kokend citraat zonder de aluminiumfolie. Laat het gedurende 10 minuten koken.
5. Neem het bekerglas van de verwarmingsplaat en laat het afkoelen voor 20 min. ervoor te zorgen dat de bijnier secties zijn nog steeds bedekt met de buffer.
6. Bereid de blokkerende oplossing. Als met behulp van de verkrijgbare kleuring ingezet voor de Vertegenwoordiger resultaten Kit (Zie de Tabel van materialen), in een buis toevoegen 1,25 mL 1 x PBS, 1 druppel (gelijk aan ongeveer 45 µL) van muis Ig blokkeren reagens, en 5% van de normale geit serum. De blokkerende oplossing bij 4 ° C of op ijs tijdens het werken opslaan.
   Opmerking: Het serum gebruikt hangt af van het secundaire antilichaam host soorten. Hier zijn secundaire antilichamen opgegroeid in geit gebruikt. Voor andere antilichamen, kunnen verschillende serum concentraties nodig zijn. Empirisch bepalen de juiste serumconcentratie door het testen van verschillende concentraties.
7. Breng de dia's in een pot van de Coplin met 1 x PBS en wastafel 3 x 10 minuten, elk op een rocker met zachte rockende.
8. Voorbereiden op een bevochtigde kamer de kleuring.
9. Zacht, afschudden de PBS van de ene dia; Veeg de onderkant van de dia met een pluisvrije doekje te verwijderen van de overtollige PBS.
10. Met behulp van een speciale markering voor dia's met hydrofobe eigenschappen, teken een cirkel rond elke bijnier sectie, ervoor te zorgen dat het glasoppervlak droog is om te voorkomen dat de verspreiding van de oplossing van de inkt naar de sectie. Indien nodig, zorgvuldig veeg droog het oppervlak. Plaats de dia in de bevochtigde zaal.
11. Snel, Pipeteer 50 µL (of genoeg ter dekking van de secties) van het blokkeren van de oplossing op elke sectie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Het blokkeren van benodigde volume van de oplossing variëren; het is belangrijk dat de secties komen ruimschoots aan bod met de oplossing.
12. Bereid de verdunningsmiddel oplossing uit de verkrijgbare kit met 7,5 mL 1 x PBS, 600 µL van eiwit concentreren stock oplossing en 5% normaal geit serum (of elke andere serum en concentratie in de blokkerende oplossing gebruikt). De verdunningsmiddel oplossing bij 4 ° C of op ijs tijdens het werken opslaan.
13. Het bereiden van de oplossingen van de primair antilichaam de primaire antilichamen op de juiste concentraties in de verdunningsmiddel oplossing te verdunnen. Voor co kleuring, voeg een aliquoot gedeelte van elke antilichaam in een nieuwe buis, en meng zachtjes. Plaats antilichamen en antilichaam oplossingen op ijs tot klaar voor gebruik.
    Opmerking: Hier wij werkzaam anti-SF1 antilichaam opgegroeid in konijn en een anti-TH antilichaam aan de orde gesteld in de muis. Ter voorbereiding van het antilichaam volgen werkende oplossingen zoals voorgeschreven.
    1. Toevoegen voor SF1 werkende oplossing, in één buis, 1 µL van anti-SF1 antilichaam aan 999 µL van verdunningsmiddel oplossing (eindconcentratie van 1,5 µg/mL). Voor TH werkoplossing, in een buis, voeg 1 µL anti-TH antilichaam in 499 µL van verdunningsmiddel oplossing (geschatte eindconcentratie van 2-6 µg/mL).
    2. Voor SF1 + TH antilichaam werken mix, in een verse buis, Pipetteer 250 µL van SF1 werkoplossing en 250 µL van TH werkende oplossing. Meng zachtjes door pipetteren. Opslaan op het ijs.
14. Overdracht van de dia's in een pot van de Coplin met 1 x PBS en 3 x voor elke 5 min op een rocker met zachte rockende wassen.
15. Plaats de dia's terug in de bevochtigde kamer na het afvegen van de overmaat van PBS, Pipet de SF1 + TH een antilichaam werken mix (of andere oplossing primair antilichaam) op elke sectie sluit de bevochtigde kamer en laten overnachten bij 4 ° C.
16. De volgende dag, door de dia's in een Coplin jar bevattende 1 x PBS en 3 x voor 15 min te wassen op een rocker met zachte rockende te verplaatsen.
17. Bereid de oplossing van de secundair antilichaam in de verdunningsmiddel oplossing om met de juiste concentratie tijdens het wassen van de dia's. Als mede kleuring wilt uitvoeren, toevoegen gelijke hoeveelheid elke secundair antilichaam-oplossing in een nieuwe buis. Meng zachtjes door pipetteren. Opslaan op het ijs. De buizen beschermen tegen licht en bewaren in de ijskast tot klaar voor gebruik.
    Opmerking: De secundaire antilichamen gebruikt hier 488 nm fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden-antimuis opgegroeid in geit en 549 fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden anti-konijn opgegroeid in geit. Het secundaire antilichaam-oplossing was bereid door toevoeging van 0,5 µL van elke secundair antilichaam in 799 µL van verdunningsmiddel oplossing (eindconcentraties van 1.2 µg/mL).
18. Plaats van de dia's terug in de bevochtigde kamer na het verwijderen van teveel aan PBS, snel Pipetteer de secundair antilichaam-oplossing op de bijnier secties, sluit de bevochtigde kamer en beschermen tegen licht. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
19. Wassen van de dia's in een Coplin pot met 1 x PBS en 3 x voor 15 min te wassen op een rocker met zachte rockende, ervoor zorgend om hen te beschermen tegen licht.
20. Voorbereiden op de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing nucleaire kleuring: 1 µL van de DAPI (20 mg/mL) in 1 mL 1 x PBS.
    Opmerking: Blue-belichting fluorescerende nucleaire counterstain kan ook worden bereikt met behulp van Hoechst kleurstof.
21. Pipetteer DAPI oplossing op de bijnier secties, cover door licht en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
22. Wassen van de dia's in een Coplin pot met 1 x PBS en 3 x gedurende 5 minuten wassen op een rocker met zachte rockende terwijl de bescherming van de dia's van licht.
23. In een gebied dat beschermd tegen direct licht, vast een glas cover en Pipetteer 60 µL of ongeveer 3 druppels voor montage agent geschikt voor immunofluorescentie langs het oppervlak van het glas van de cover.
24. Veeg voorzichtig de achterkant van een dia met een pluisvrije doekje, positie de dia naar beneden richting het glas cover en parallel, zodat de weefselsecties het glas van de cover met de agent van de montage op het gezicht. Licht druk op de dia op de cover glas en ervoor te zorgen dat er geen luchtbel tussen de dia en het glas cover opgesloten ligt.
    1. Indien nodig, verdere pressiemiddelen om de luchtbellen en de overdaad aan montage agent te verwijderen.
25. Vaststellen van de dia in een donkere container en uitharding bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur (of de tijd vermeld in het informatiebestand van de montage-agent gebruikt) en vervolgens overgaan tot imaging.

7. imaging

Opmerking: Een fluorescentie Microscoop aangesloten op een camera is vereist voor het opsporen en vastleggen van de fluorescentie die wordt uitgestraald door de weefsels na excitatie bij bepaalde golflengten. Hoewel duidelijk is, is het belangrijk om te onthouden om te kiezen van de secundaire geconjugeerd antilichaam met fluorochromes waarvan excitatie en emissie spectra verenigbaar zijn met de apparatuur beschikbaar. Imaging-instellingen is afhankelijk van de Microscoop en de software die wordt gebruikt voor het vastleggen van beelden. Er zijn enkele basisregels die gelden voor imaging-bijnier secties, zoals ervoor te zorgen dat de belichtingstijd, camera instellingen krijgen en lichtbron intensiteit constant worden gehouden.

1. De lichtbron en de camera inschakelen, start de imaging software na aanwijzingen van de fabrikant.
   Opmerking: De volgorde van deze acties kan verschillen afhankelijk van de gebruikte apparatuur.
2. Beveiligen van de dia in het werkgebied, open de sluiter, en op zoek naar de Microscoop oculairs nucleaire kleuring (DAPI) kanaal en lage zoomfactor (4 X) om te identificeren het weefsel op de dia: bijnier secties zijn klein, en hun visualisatie kan enige tijd nodig.
3. Ga naar een hogere vergroting (10 X), focus, en sluit de sluiter.
   Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat onnodig lange expositie onder het licht dat leiden photobleaching tot kan, wat resulteert in verlies van signaal.
4. Met behulp van de opdrachten van de software, selecteer het doel (10 X) en het kanaal in gebruik (DAPI), belichtingstijd aanpassen (1 s, kan worden aangepast als het signaal te sterk of zwak). Indien beschikbaar, set weggooien voor levende imaging (geen overname) te '2 X 2', conversie winnen tot 'midden', uitlezing snelheid tot ' 20 MHz'. Als de software gebruikt de schaal bar niet wordt weergegeven aan het einde van de beeldvorming, selecteer de optie schaal bar in het menu en plaatst de bar waar gewenst.
5. Open de sluiter, opnieuw de focus indien nodig aanpassen en schakelen kanalen (FITC, TRITC, DAPI). Als de Microscoop is niet geautomatiseerd, neem een foto van de bijnier in elk kanaal zonder te verplaatsen van het podium en zorg ervoor om de selectie van het kanaal in gebruik te passen. Sluit de sluiter eenmaal klaar.
   Opmerking: Noteer de instellingen werkzaam in het geval dat de software wordt niet automatisch opgeslagen met hen.
6. De foto's opslaan.
   Opmerking: Samengevoegde afbeeldingen kunnen worden vaak gemaakt met behulp van de Microscoop software of andere grafische editor softwarepakketten.
7. Herhaal imaging voor andere gebieden van de sectie en/of met een hogere vergroting.
   Opmerking: Een 20 X vergroting vaak vereist een kortere belichtingstijd (dat wil zeggen, 800 ms).
8. Aan het einde van beeldvorming, zet u alle apparatuur in de juiste volgorde.

Resultaten

Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van het gehele protocol hierboven beschreven. Bijnieren worden geoogst van muizen, aangrenzende adipeus weefsel is verwijderd onder een Microscoop ontleden en de bijnier worden dan opgelost met 4% PFA. Na deze stap, zijn bijnieren verwerkt en ingesloten in paraffine en gesegmenteerd met een microtoom aan het orgel snijd in dunne plakjes die worden afgezet op Microscoop dia's. Na het drogen van de afdelingen, immuno...

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de bijnieren muis samen met de voorbereiding en verkleuring van de verdeelde paraffine-ingebedde muis bijnieren.

Vergeleken met andere protocollen die we getest, heeft dit immunofluorescentie protocol geschikt voor de meerderheid van de antilichamen gebruikt in ons laboratorium bewezen. In bepaalde gevallen kan het echter enkele aanpassingen om de kleuring resultaten te verbeteren. Een variabele die gemakkelijk kan worden bewerkt en gete...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology Co.	0412B
Disposable needles 25 G x 5/8"	Exel International	26403
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	Paraffin voor weefselinbedding
Shandon biopsie cassettes II met bevestigd deksel	Thermo scientific	1001097	Cassettes voor weefselverwerking
High Profile Microtome Blades	Accu-Edge	4685	Weggeef stalen roestvrijstalen bladen
Peel-a-way wegwerpbare kunststof weefselinbeddingsmalen	Polysciences Inc.	18986	Afgeknot, 22 mm vierkante bovenkant taps tot 12 mm bodem
Superfrost Plus Microscoopglazen	Fisherbrand	12-550-15	75 mm x 25 mm x 1 mm
Xyleen	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 Proof Ethanol	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gaasjes	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3" x 3. Sterile latexvrije gaasjes
M.O.M kit	Vector laboratories	BMK-2202	Voor het detecteren van primaire muisantilichamen op muisweefsel
KimWipes	Kimtech	34155	Doekjes 4,4 inch x 8,4 inch
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	Pen om op glazen te tekenen
Microscoop dekglaas	Fisherbrand	12-544-D	Grootte: 22 x 50 x 1,5
DAPI	Sigma	D9542	(Bereid in 20 mg/mL voorraad)
ProLong Gold antifade reagens	Molecular Probes	P36930	Bevestigingsmiddel voor immunofluorescentie
X-cite serie 120Q	Lumen Dynamics		Lichtbron
Coolsnap Myo	Photometrics		Camera
Optiphot-2	Nikon		Microscoop
Microtoom	American Optical
Weefsel inbedder	Leica	EG1150 H
Weefsel processor	Leica	ASP300S
Normaal geitenserum	Sigma	G9023
Muis anti-TH	Millipore	MAB318	Primair antilichaam
Konijn anti-SF1	Ab proteintech group (PTGlabs)	op maat gemaakt	Primair antilichaam
Alexa-488 Muis IgG  gevormd geit	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Secundair antilichaam
Dylight-549 Konijn IgG gevormd geit	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	Secundair antilichaam
Citraat zuur watervrij	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basisonderzoek	Nikon		Software voor beeldvorming