Morfometrische Protocol voor de objectieve beoordeling van de Blastocyst gedrag tijdens verglazing en opwarming van de aarde stappen

Summary

Hier presenteren we een time-lapse Morfometrische protocol te volgen van de intensiteit van de blastocyst krimp en re-expansie tijdens previtrification interventies en na opwarming van de aarde herstel. De toepassing van het protocol is mogelijk in in vitro bevruchting laboratoria die toegerust zijn met time-lapse microscopen en wordt aanbevolen bij de ontwikkeling van een optimale blastocyst verglazing methode.

Abstract

Dit artikel beschrijft de noninvasive methode van de blastocyst morphometry op basis van time-lapse microphotography voor de nauwkeurige controle van de een blastocyst volume wijzigen tijdens de afzonderlijke fasen vóór en na de verglazing. De methode kan zinvol zijn in het zoeken naar de meest optimale timing van de blastocyst blootstelling aan verschillende concentraties van cryoprotectant door het observeren van de blastocyst krimp en re-expansie in verschillende pre en post verglazing fasen. Met deze methode, kan het blastocyst verglazing protocol worden geoptimaliseerd. Voor een betere demonstratie van het nut van deze Morfometrische-methode, worden twee verschillende blastocyst voorbereiding protocollen voor verglazing vergeleken; één met het gebruik van een kunstmatige blastocoel samenvouwen en één zonder deze interventie voordat verglazing. Zowel de veranderingen van het volume van de blastocysten worden gevolgd door time-lapse microphotography gemeten door foto-editing softwaretools. De metingen zijn verricht elke 20 seconden in fasen van previtrification en elke 5 minuten gedurende de post opwarming van de aarde. De veranderingen van de afmetingen van de blastocyst per tijdseenheid worden weergegeven als geïllustreerd in lijn diagrammen. De resultaten tonen een lange evenwichtsinstelling previtrification fase waarin de intact blastocyst eerst krimpt en vervolgens langzaam vullingen de blastocoel, invoeren van verglazing met een vloeistof gevulde blastocoel. De kunstmatig samengevouwen blastocyst blijft in zijn gekrompen stadium door de gehele evenwichtsinstelling fase. Tijdens de fase van de verglazing verandert het ook niet haar volume. Aangezien de blastocyst morphometry een constant volume van het kunstmatig samengevouwen blastocysten tijdens de stap van de previtrification toont, het lijkt erop dat dit stadium kan korter. Het beschreven protocol biedt vele extra vergelijkende parameters van de blastocyst gedrag tijdens en na de cryopreservatie op basis van de snelheid en de intensiteit van de veranderingen van het volume, het aantal gedeeltelijke blastocoel contracties of totale blastocyst stort en de tijd tot een totale blastocoel re-uitbreiding of tot broedeieren.

Introduction

Cryopreservatie van embryo voor inplanting van het in vitro bevruchting programma (IVF) is tegenwoordig een gangbare praktijk in de meeste IVF-laboratoria. Het langzame embryo bevriezing van de methode begon te worden klinisch gebruikt in 1985, met de introductie van specifieke cryoprotectant en computergestuurde diepvriezers, waardoor de gecontroleerde koeling van embryo's tot-7 ° C, wanneer het ijs nucleatie (zaaien) was geïnduceerd in de omliggende cryoprotective middellange¹. Door continue afkoeling, de ijskristallen zou groeien, waardoor de hyperosmolality van de resterende vloeibare fractie en, bijgevolg, de uitdroging en krimp v....

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de nationale Commissie voor medische ethiek op 19 April 2016 (No. 0120-204/2016-2).

1. de opzet van de Microscoop opnamesysteem

1. Uitschakelen van de verwarmingsplaat van de Microscoop.
2. Vóór elke behandeling, een momentopname van een blastocyst onder een camera uitgeruste omgekeerde Microscoop. Vergeet niet om de opmerking de vergroting waartegen de blastocyst werd opgenomen.

2. selectie en Prepreparation van blastocysten voor verglazing

1. Selecteer alleen volledig uitgevouwen dag-5 of dag-6 blastocysten voor cryopreser....

Results

In een demonstratie toonden we een blastocyst morfodynamica in slechts één previtrification en één na opwarming van de aarde fase. Een verschil in van de blastocyst volume aan het einde van de evenwichtsinstelling fase en aan het begin van het herstel in een kweekvloeistof toonde de intensiteit van embryo krimp, oftewel, in feite, de intensiteit van embryo behoud tegen ijs kristallisatie.

Als het kan worden opgemerkt uit

Discussion

Het protocol voor de observatie van de blastocyst morfodynamica tijdens en na cryopreservatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van soortgelijke instrumenten en softwarehulpmiddelen van andere fabrikanten. Time-lapse systemen aangepast voor embryologie toestaan de continue monitoring van embryo-ontwikkeling. Het doel van dit werk was de introductie van de kwantificering van de blastocyst gedrag tijdens de voorbereiding van blastocysten voor verglazing en na hun opwarming van de aarde. Dit werd gedaan door de objectiev.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope Eclipse TE2000-U	Nikon, Japan	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Denmark	/
Digital camera DC1	Research Instruments, Origio, Denmark	/
Digital camera DC2	Research Instruments, Origio, Denmark	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Denmark	/	microscope recording software
Incubator with 6% CO2, 5% O2	Binder, Germany	/
Primo Vision microscope	Vitrolife, Sweden	16600
Primo Vision Capture software	Vitrolife, Sweden	16608	time-lapse recording software
Adobe Photoshop CS6 Extended software	Adobe Systems Incorporated, USA	/	video analysis software
VirtualDub	Avery Lee	/	video editing software
Microsoft Office Excell	Microsoft, USA	/	spreadsheet editor
PrimoVision culture dish	Vitrolife, Sweden	16604
G2-plus medium	Vitrolife, Sweden	10132	cultivation medium for blastocyst stage embryos
Human Serum Albumins	Vitrolife, Sweden	10064
Paraffin oil	Vitrolife, Sweden	10029
Equilibration solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90131
Vitrification solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90132
Thawing solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90134
Dilution solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90135
Washing solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90136
HSV Vitrification straws	CryoBio System, France	025246, 025249, 025250, 025248
Liquid nitrogen	/
Cryo vessel Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Germany	229286
Cryo tank	Cryotherm, Germany
Forceps	/	/
Scisors	/	/
Pippete for blastocyst manipulation	Gynetics, Belgium	ID275/10	diameter 275 µm
Pipette for oocyte denudation	Vitromed, Germany	V-DEN-135	diameter 135 µm
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Digital interval timer Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA	/	statistical analysis software
Self adjusting wire stripper	Knipex, Germany	1262180