Hier presenteren we een time-lapse Morfometrische protocol te volgen van de intensiteit van de blastocyst krimp en re-expansie tijdens previtrification interventies en na opwarming van de aarde herstel. De toepassing van het protocol is mogelijk in in vitro bevruchting laboratoria die toegerust zijn met time-lapse microscopen en wordt aanbevolen bij de ontwikkeling van een optimale blastocyst verglazing methode.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Morfometrische Protocol voor de objectieve beoordeling van de Blastocyst gedrag tijdens verglazing en opwarming van de aarde stappen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit artikel beschrijft de noninvasive methode van de blastocyst morphometry op basis van time-lapse microphotography voor de nauwkeurige controle van de een blastocyst volume wijzigen tijdens de afzonderlijke fasen vóór en na de verglazing. De methode kan zinvol zijn in het zoeken naar de meest optimale timing van de blastocyst blootstelling aan verschillende concentraties van cryoprotectant door het observeren van de blastocyst krimp en re-expansie in verschillende pre en post verglazing fasen. Met deze methode, kan het blastocyst verglazing protocol worden geoptimaliseerd. Voor een betere demonstratie van het nut van deze Morfometrische-methode, worden twee verschillende blastocyst voorbereiding protocollen voor verglazing vergeleken; één met het gebruik van een kunstmatige blastocoel samenvouwen en één zonder deze interventie voordat verglazing. Zowel de veranderingen van het volume van de blastocysten worden gevolgd door time-lapse microphotography gemeten door foto-editing softwaretools. De metingen zijn verricht elke 20 seconden in fasen van previtrification en elke 5 minuten gedurende de post opwarming van de aarde. De veranderingen van de afmetingen van de blastocyst per tijdseenheid worden weergegeven als geïllustreerd in lijn diagrammen. De resultaten tonen een lange evenwichtsinstelling previtrification fase waarin de intact blastocyst eerst krimpt en vervolgens langzaam vullingen de blastocoel, invoeren van verglazing met een vloeistof gevulde blastocoel. De kunstmatig samengevouwen blastocyst blijft in zijn gekrompen stadium door de gehele evenwichtsinstelling fase. Tijdens de fase van de verglazing verandert het ook niet haar volume. Aangezien de blastocyst morphometry een constant volume van het kunstmatig samengevouwen blastocysten tijdens de stap van de previtrification toont, het lijkt erop dat dit stadium kan korter. Het beschreven protocol biedt vele extra vergelijkende parameters van de blastocyst gedrag tijdens en na de cryopreservatie op basis van de snelheid en de intensiteit van de veranderingen van het volume, het aantal gedeeltelijke blastocoel contracties of totale blastocyst stort en de tijd tot een totale blastocoel re-uitbreiding of tot broedeieren.
Inleiding
Cryopreservatie van embryo voor inplanting van het in vitro bevruchting programma (IVF) is tegenwoordig een gangbare praktijk in de meeste IVF-laboratoria. Het langzame embryo bevriezing van de methode begon te worden klinisch gebruikt in 1985, met de introductie van specifieke cryoprotectant en computergestuurde diepvriezers, waardoor de gecontroleerde koeling van embryo's tot-7 ° C, wanneer het ijs nucleatie (zaaien) was geïnduceerd in de omliggende cryoprotective middellange1. Door continue afkoeling, de ijskristallen zou groeien, waardoor de hyperosmolality van de resterende vloeibare fractie en, bijgevolg, de uitdroging en krimp van de embryonale stamcellen. Bij-30 ° C of -80 ° C, zou de embryo's worden ondergedompeld in de vloeibare stikstof voor langere opslag. Wat er met de embryo's of eicellen gebeurde tijdens de koeling kan alleen door speciaal aangepast cryomicroscopes, die heeft bijgedragen tot het verbeteren van cryopreservatie protocollen2worden nageleefd. Het invriezen van blastocysten, een hogere volumes en meer vloeistof-bevatte embryonale stadium, gaf minder veelbelovende klinische resultaten in die dagen3.
De doorbraak in de cryopreservatie van de blastocyst was de introductie van de verglazing methode, waar de uitdroging van de cellen plaatsgevonden heeft voordat u te koelen met behulp van hoge concentraties van cryoprotectant4. De verwijdering van de vloeistof uit de blastocoel vóór verglazing kan ook worden bereikt door het maken van een mechanische opening tussen twee trophectoderm cellen5. Hoewel de overlevingskansen van de onmiddellijke blastocyst na de verglazing en opwarming van de aarde hoger is dan 90%, en de klinische uitkomst na is de overdracht van de blastocyst verglaasd/opgewarmd in de baarmoederholte bijna vergelijkbaar met resultaten na de overdracht van de vers embryo's, deze methode cryopreservatie is nog geen gestandaardiseerde6,7. Verglazing protocollen, is afhankelijk van (a) de aard en de concentratie van de cryoprotectant, (b) het aantal previtrification stappen, (c) de duur van afzonderlijke stappen, (d) het gebruik van een kunstmatige blastocoel samen te vouwen voordat verglazing of niet, (e). instortende methoden, (f) de uitbreiding van de blastocyst stadium en (g) de evenwichtsinstelling/verglazing temperatuur op die de embryo's moet verglaasd8. Aangezien cryoprotectant kunnen giftig voor de cellen, moet de blastocyst blootstellingstijd om deze oplossingen goed worden gedefinieerd. Echter, sommige cryopreservatie media fabrikanten zeer flexibel protocollen.
De belangstelling van wetenschappers is meestal gericht op het bestuderen van de blastocyst re-uitbreiding capaciteit met het oog op het vinden van nieuwe biomarkers met een betere voorspelling van implantatie6,9,10. Hoe menselijke blastocysten bij de verschillende stappen uitdrogen van het toevoegen van cryoprotectant voordat verglazing en wat gebeurt er met blastocysten na verglazing en opwarming van de aarde, als cryoprotectant moeten worden verwijderd uit de cellen, en hoe de blastocysten hydrateren en opnieuw uitbreiden na de opwarming van de aarde, is niet goed beschreven noch begrepen. De ontwikkeling van een methodologie voor de objectieve en gekwantificeerde controle van blastocyst gedrag tijdens verschillende cryopreservatie stappen is dus reden.
Met time-lapse microscopen van verschillende fabrikanten is het nu mogelijk om te controleren van het gedrag van de blastocyst in pre en post verglazing fasen. Door extra informatica-instrumenten, kunnen metingen van hun grootte (morphometry) ook worden uitgevoerd. Door het meten van de afname of toename in grootte van de embryo's op een bepaald moment, is het mogelijk te objectiveren van de beoordeling van de morfodynamiek van embryo's tijdens dehydratie en rehydratie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de nationale Commissie voor medische ethiek op 19 April 2016 (No. 0120-204/2016-2).
1. de opzet van de Microscoop opnamesysteem
- Uitschakelen van de verwarmingsplaat van de Microscoop.
- Vóór elke behandeling, een momentopname van een blastocyst onder een camera uitgeruste omgekeerde Microscoop. Vergeet niet om de opmerking de vergroting waartegen de blastocyst werd opgenomen.
2. selectie en Prepreparation van blastocysten voor verglazing
- Selecteer alleen volledig uitgevouwen dag-5 of dag-6 blastocysten voor cryopreservatie met ten minste een paar inner cell mass (ICM) cellen en samenhangende trophectoderm.
- Voor laser behandeld blastocysten met een samengevouwen blastocoel, onderwerp een blastocyst aan een korte laser pulse (0.4 - 0.7 ms) met een gat diameter variërend van 4.3 tot 9,4 µm, tangentieel gericht op de zona zitten en op een kruising van twee aangrenzende trophectodermal cellen. Het toestaan van de blastocyst geheel of gedeeltelijk instorten gedurende 5 minuten.
- Voor onbehandelde blastocysten met een intact blastocoel, verrichten geen specifieke behandeling voor verglazing.
Opmerking: Deze blastocysten worden beschouwd intact.
3. voorbereiding op Cryoprotectant en een petrischaal voor de evenwichtsinstelling fase
- Gebruik pithe pipet voor oöcyt denudatie (diameter 135 µm) te vullen aseptisch evenwichtsinstelling media (M-199 HEPES-buffer medium met 7,5% DMSO, 7,5% ethyleen glycol, 20% DSS) in de gaten van de ruimte van de microdroplet van een 9-well petrischaal speciaal ontworpen voor time-lapse microscopie en opname.
Opmerking: Oöcyt denudatie is een proces van het verwijderen van cumulus cellen rondom de oöcyt. Het gebruik van een pipet voor oöcyt denudatie zal bijdragen tot de oprichting van luchtbellen vermijden. - Overlay van het microdroplet gebied met 30 µL van evenwichtsinstelling media.
4. overdracht van de Blastocyst in oplossing
- Een laser-behandeld of intact blastocyst onderdompelen in het medium van de evenwichtsinstelling naar de onderkant van het gebied van de microdroplet van de microdroplet schotel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (evenwichtsinstelling fase).
- Start een aftelprocedure 10-min zodra de blastocyst wordt overgebracht naar het medium van de evenwichtsinstelling.
5. opname van de Blastocyst op de evenwichtsinstelling fase
- De microdroplet-schotel met de blastocyst overbrengen in een Microscoop camera-uitgerust. Gebruik de dezelfde vergroting zoals eerder voor het nemen van een momentopname van de dezelfde blastocyst. Standpunt de microdroplet schotel zodat de blastocyst bevindt zich ongeveer in het midden van de opname.
- Start de opname met de Microscoop opnamesoftware. Opmerking de afteltijd waartegen het opnemen wordt gestart.
Opmerking: Zie representatieve resultaten voor de opnames van een intact (Figuur 1, Video 1) en een samengevouwen blastocyst (Figuur 2, Video 2) tijdens de 10-min-blootstelling aan een oplossing.
6. verglazing van de Blastocyst
- Aseptisch afzien een daling van de 50-µL van verglazing oplossing (M-199 HEPES-buffer gemiddeld met 15% DMSO, 15% ethyleenglycol, 20% DSS, 0.5 M sacharose) in een petrischaal 2 min vóór het einde van de countdown.
- Stop de opname wanneer het aftellen van 10-min eindigt en snel overbrengen van de blastocyst verglazing oplossing voor 30 s bij kamertemperatuur.
- Pipetteer zachtjes de blastocyst ten minste 1 x binnen de verglazing oplossing.
- Gebruik een verglazing stro voor het laden van de blastocyst. Laden, verzegelen en duik de verglazing stro in vloeibare stikstof (LN) binnen 80 s, niet meer dan 110 s na de eerste blootstelling aan de verglazing oplossing.
7. video-Editing van de opgenomen Blastocyst tijdens de evenwichtsinstelling fase
- Een opgenomen video bestand in video-editing software importeren.
- Verplaats de schuifregelaar van de tijdlijn naar 20 s. Opmerking het framenummer op dit moment.
Opmerking: Dit nummer zal worden gebruikt om geen onnodige videoframes decimeren. Alleen frames elke 20 s zal worden gebruikt. - Klik op het tabblad Video , vervolgens framesnelheid.... Onder Frame rate conversion, Controleer het Decimate door veld en voer de eerder bekende framenummer. Bevestig door op OKte klikken. Klik op bestand → exporteren → Afbeeldingsvolgorde.
- Kies JPEG als de outputformaat, stel de map om de opgeslagen volgorde van afbeeldingen en klik op OK.
Opmerking: Dit zal een map maken met maximaal 30 beelden van de opgenomen blastocyst in volgorde tijdens de fase van de evenwichtsinstelling van verglazing.
8. de metingen van de Blastocyst van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van installatiekopieën die zijn gemaakt tijdens de evenwichtsinstelling fase
- Open de video analysesoftware. Klik op het tabblad van het venster en selecteer tijdlijn.
- Klik op de film strip teken in het deelvenster tijdlijn en kies ... Voeg Media toe te voegen een beeld van de blastocyst vóór de fase van de evenwichtsinstelling van verglazing — en vóór de interventie van de laser, als er om het even welk.
Opmerking: Deze afbeelding is zichtbaar de blastocyst op haar meest uitvouwstatus en de oppervlakte van de dwarsdoorsnede als referentie zal dienen. - De Afbeeldingsvolgorde van de overeenkomstige blastocyst gegenereerd eerder met video-editing software (van de evenwichtsinstelling fase van verglazing) toevoegen.
- Ga naar afbeelding → analyse → Gegevenspunten selecteren → aangepast om de gegevenspunten selecteren -venster te openen.
- Hef de selectie van alle gegevenspunten, dan selecteert u alleen gebied, en Bevestig door op OKte klikken.
- Verplaats de schuifregelaar van de tijdlijn in het tijdlijnvenster naar de eerste afbeelding.
- Klik op het tabblad van het venster en kies Opties.
Opmerking: Dit zal het deelvenster Gereedschappen aan de linkerkant activeren. - Kies het gereedschap Snelle selectie.
- Positie van de marker van de tool binnen de blastocyst aanraken van de rand van de blastocyst. Een overzicht van de blastocyst door het plaatsen van de markering van de tool op de buitenste rand van de blastocyst, te klikken en de linkermuisknop ingedrukt te houden en te slepen van de tool markering langs de buitenste rand van de blastocyst tot de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de hele blastocyst is geselecteerd.
Opmerking: Zona zitten is niet een deel van de meting, dus het moet uitgesloten (Figuur 5). - In het tijdlijnvenster, klik op het Metingslogbestand en druk op de knop Metingen opnemen .
Opmerking: Dit behaalt het geselecteerde gebied. - Terugkeren naar de tijdlijn, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en kies selectie opheffen.
- Verplaats de schuifregelaar van de tijdlijn naar de volgende afbeelding en klik op de bijbehorende tegel eronder.
- Een overzicht van de blastocyst in de nieuwe afbeelding met het gereedschap Snelle selectie. Herhaal de meting.
- Herhaal deze procedure (stappen 8,9-8.13) beeld per beeld totdat alle beelden transversale gebieden worden gemeten en geregistreerd.
- Op het einde, ga naar het logboek van de metingen, selecteer alle metingen onder de variabele gebied en in een txt-bestand te exporteren.
Opmerking: De eenheden van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede zijn vierkante pixels.
9. het uitgeven van het gegevensbestand met de opgenomen Blastocyst transversale gebieden van beelden gemaakt tijdens de evenwichtsinstelling fase
- De gegevens van de opgenomen blastocyst transversale gebieden van het txt-bestand overbrengen naar een spreadsheet-editor.
- Gebruik de eerste doorsnede waarde als referentiewaarde 1 en express (transformatie) alle andere waarden als een fractie van die referentiewaarde.
- Maak een nieuwe variabele Area_r en plakken de transcoded gebied waarden (met uitzondering van de refe-rentiewaarde) eronder.
- Naast de Area_r-variabele, maak een variabele tijd en de eerste tijdswaarde toe te voegen.
Opmerking: De eerste tijd waarde voor de tijd die verstreken vanaf het moment dat de blastocyst werd blootgesteld aan de evenwichtsinstelling oplossing aan het begin van de opname onder een Microscoop camera-uitgerust. - Elke volgende waarde van de achtereenvolgende keer berekenen door bijvoeging 20 s op de vorige tijdswaarde.
Opmerking: Dit is het tijdsinterval gebruikt bij uitroeit geen onnodige videoframes gemaakt tijdens de opname.
10. opwarming van de Blastocyst
- Voorbereiden op media opwarming van de aarde.
- Een dag voordat de blastocyst, opwarming van de aarde afzien aseptisch drie 150 µL druppels voor herstel medium in een 4-well schotel. Ook afzien aseptisch herstel medium in een microdroplet 9-well schotel speciaal ontworpen voor time-lapse microscopie en opnemen. Bestrijk het herstel medium met paraffineolie en preincubate het bij 37 ° C met 6% CO2 en 5% O2.
Opmerking: Herstel medium is het medium van een teelt voor blastocyst-stadium embryo's met toegevoegde menselijk serum albumine (HSA). De HSA in het herstel medium moet 12 mg/mL. Vul de gaten in de 9-well schotel, een pipet voor oöcyt denudatie gebruiken om te voorkomen dat de oprichting van luchtbellen, dan het microdroplet gebied met 30 µL van herstel medium overlay. - Op de dag van de opwarming van de aarde de blastocyst, aseptisch afzien van 500 µL van het ontdooien van de oplossing (TS) in een enkele put van een 4-well schotel en laat ze warm tot 37 ° C in een broedstoof zonder CO2.
- Bij kamertemperatuur, aseptisch afzien een 50-µL druppel verdunning oplossing (DS) en twee 50-µL druppels van de oplossing (WS) wassen in een steriele petrischaal. Bestrijk de DS en de WS1 WS2 druppels met paraffineolie.
Opmerking: In plaats van een petrischaaltje, een 4-well schotel kan ook worden gebruikt.
- Een dag voordat de blastocyst, opwarming van de aarde afzien aseptisch drie 150 µL druppels voor herstel medium in een 4-well schotel. Ook afzien aseptisch herstel medium in een microdroplet 9-well schotel speciaal ontworpen voor time-lapse microscopie en opnemen. Bestrijk het herstel medium met paraffineolie en preincubate het bij 37 ° C met 6% CO2 en 5% O2.
- Warm de blastocyst.
- De HSV stro inleven in de verglaasd blastocyst het stro snel overbrengen in een LN gevulde draagbare reservoir ter voorbereiding van de opwarming van de aarde procedure te worden verwijderd uit de LN-opslag.
- Til het stro met een tang, net genoeg om de gekleurde behandeling staaf bloot te stellen. Gebruik een zelf aanpassen draad-stripper te snijden het stro op de hoogte van de gekleurde behandeling staaf.
- Het grijpen van de staaf van de behandeling en uittreksel uit het stro met een snelle, maar gecontroleerde beweging, en duik onmiddellijk de gebogen spatel van de staaf van de behandeling in de 37 ° C TS.
- Zachtjes swirl de staaf van de behandeling als u wilt loskoppelen van de blastocyst en laat het voor een totaal van 1 min in TS.
- Bij kamertemperatuur, overbrengen in de blastocyst opeenvolgend DS, WS1 en WS2 voor 4 min in elk medium.
- Nadat de procedure is opwarming van de aarde, de blastocyst overbrengen in een 4-well schotel met herstel medium en wassen het in alle drie druppels door zachtjes pipetteren het.
Opmerking: Het wassen wordt uitgevoerd in ongeveer 1 minuut. - De blastocyst overbrengen in de time-lapse 9-well schotel met herstel medium. Plaats de 9-well schotel onder een time-lapse camera in een incubator (bij 37 ° C met 6% CO2 en 5% O2).
Opmerking: De opwarming van de aarde procedure thrê, die nog steeds met het plaatsen van de schotel 9-well onder een time-lapse camera in een incubator, duurt ongeveer 17 min.
11. time-lapse opname van de Blastocyst Re-expansie tijdens het herstel na opwarming van de aarde
- Time-lapse opname-software worden uitgevoerd.
- Kies een camera opname.
- Druk op de knop Live-ISO modus .
- Plaats de muiscursor op de afbeelding en gebruik de scroll-knop om het te vergroten. Klik en houd de linkermuisknop ingedrukt en beweeg de cursor naar de plaats van de put met de blastocyst in het midden van het scherm.
- Gebruik de groene pijlen van omhoog / omlaag om zich te concentreren op het vlak van de opname van de blastocyst onder bundeling. Stel onder de lichtintensiteit, de lichtintensiteit.
- Klik op de knop van de Microscoop parameters om de blootstellingstijd en Gamma.
- Druk op sluiten live modus.
- Druk op de knop Start project en de projectgegevens invoeren, selecteer het type van cultuur schotel (3 x 3 of 4 x 4) en uncheck alle posities behalve degene worden geregistreerd.
- Stel de timing vangen een foto te nemen elke 5 min.
- Beginnen met opnemen door op de knop goedkeuren . Het opnemen van ten minste 150 min.
- Stop de opname door op de knop stoppen van project .
Opmerking: Zie de representatieve resultaten van de opname van een intact (Figuur 3) en een samengevouwen blastocyst (Figuur 4) tijdens de herstelperiode na opwarming van de aarde.
12. videobewerking van de opgenomen Blastocyst tijdens de Re-uitbreiding na opwarming van de aarde
- Ga naar de projectmap en zoek opgenomen beelden zijn ongeveer 80 KB in grootte.
- Een andere map en deze beelden te brengen erin. Wijzig de naam van de afbeeldingen in getallen volgens de tijd gemaakt. Ze importeren in de video-editing software als een reeks afbeeldingen.
- Ga naar tabblad Video → Filter → toevoegen en selecteer Null transform filter.
- Klik op de knop bijsnijden op de rechterkant en bijsnijden van de afbeelding, waardoor alleen het veld zichtbaar met de opgenomen blastocyst. Bevestig met OK en weer OK.
- Klik op bestand → exporteren → Afbeeldingsvolgorde. Kies JPEG als de outputformaat, stel de map om de opgeslagen volgorde van afbeeldingen en klik op OK.
Opmerking: Dit zal afmetingen (bijgesneden) van foto's voorbereid voor verdere metingen in de video-analysesoftware creëren.
13. het opzetten van een metingsschaal in Video analysesoftware voor de afbeeldingen die zijn gemaakt met de Time-lapse opname-Software
- De Analysator van de time-lapse opnamesoftware worden uitgevoerd.
- Open het project met de opgenomen blastocyst.
- Klik op de Analyseer knop op het veld met de opgenomen blastocyst.
Opmerking: Een nieuw analyseren-venster wordt geopend. Klik op de knop van de meting te tonen het meetgereedschap. - Gebruik het meetgereedschap voor het meten van de breedte van de hele afbeelding.
- Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en sla het op. Controleer in de eigenschappen, de breedte van de afbeelding in pixels.
- Verdeel de werkelijke breedte van de afbeelding met de breedte in pixels.
Opmerking: Dit wordt berekend met de werkelijke lengte van één pixel in dit beeld. - De video analysesoftware uitvoeren.
- Klik op het tabblad van het venster en selecteer tijdlijn.
- In het deelvenster tijdlijn, klik op de film strip teken en kies Media toevoegen toe te voegen van de reeks van de afbeeldingen van de post warme opnieuw groeiende blastocyst.
- Klik op beeld → analyse → Metingsschaal instellen → aangepaste metingsschaal venster te openen. Voer bij de pixellengte, 1; voor de logische lengte, voer de eerder berekende werkelijke lengte van een pixel (stap 13,6); Logische eenheden, voer voor µm. opslaan de voorinstelling.
14. de metingen van de Blastocyst van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van installatiekopieën die zijn gemaakt tijdens de Re-uitbreiding na warm
- Zodra de metingsschaal is ingesteld en de reeks van de afbeeldingen geïmporteerd, meten van de blastocyst transversale gebieden dezelfde manier zoals beschreven in stap 8, met het enige verschil is dat de gemeten transversale gebieden in deze metingen eenheden in µm2 hebben .
15. het uitgeven van het gegevensbestand met de opgenomen Blastocyst transversale gebieden van beelden gemaakt tijdens de Re-uitbreiding na warm
- De gegevens van de opgenomen blastocyst transversale gebieden van het txt-bestand overbrengen naar een spreadsheet-editor.
- Maak een variabele tijd naast de variabele gebied en de eerste tijdswaarde toe te voegen.
Opmerking: In dit geval, de eerste tijdswaarde is ingesteld op 0 minuten, dat is het begin van de time-lapse opname. Elke volgende waarde van de achtereenvolgende keer wordt berekend door toevoeging van 5 minuten naar de vorige tijdswaarde. Vijf minuten is het interval tussen twee opeenvolgende time-lapse opnames gebruikt.
16. het creëren van een lijn-Diagram
- Importeer de gegevens werkbladbestand in statistische analysesoftware voor het maken van een complot van de tijd van de blastocyst van oppervlakte van de dwarsdoorsnede veranderingen in de tijd tijdens de fase van de equilibratietijd voor de verglazing of re-uitbreiding na opwarming van de aarde.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In een demonstratie toonden we een blastocyst morfodynamica in slechts één previtrification en één na opwarming van de aarde fase. Een verschil in van de blastocyst volume aan het einde van de evenwichtsinstelling fase en aan het begin van het herstel in een kweekvloeistof toonde de intensiteit van embryo krimp, oftewel, in feite, de intensiteit van embryo behoud tegen ijs kristallisatie.
Als het kan worden opgemerkt uit
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol voor de observatie van de blastocyst morfodynamica tijdens en na cryopreservatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van soortgelijke instrumenten en softwarehulpmiddelen van andere fabrikanten. Time-lapse systemen aangepast voor embryologie toestaan de continue monitoring van embryo-ontwikkeling. Het doel van dit werk was de introductie van de kwantificering van de blastocyst gedrag tijdens de voorbereiding van blastocysten voor verglazing en na hun opwarming van de aarde. Dit werd gedaan door de objectiev...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk is een onderdeel van programma P3-0327 en onderzoek onderzoeksproject J3-7177, opgericht door de Sloveense Research Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope opnamesoftware |
| Incubator met 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse opnamesoftware |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | videoanalysesoftware |
| VirtualDub | Avery Lee | / | videobewerkingssoftware |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision kweekschaal | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | kweekmedium voor blastocyst stadium embryo's |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffineolie | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibratieoplossingsmedium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrificatieoplossingsmedium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Ontdoopoplossingsmedium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Verdunningsoplossingsmedium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Wasoplossingsmedium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrificatie rietjes | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Vloeibare stikstof | / | ||
| Cryo vat Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Pincet | / | / | |
| Schaar | / | / | |
| Pipetto voor blastocyst manipulatie | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipet voor occyte denudatie | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digitale intervaltimer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistische analysesoftware |
| Zelf aanpassende draadstripper | Knipex, Germany | 1262180 |
Referenties
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647(1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99(2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
