Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kinase en pyrophosphokinase enzymen overbrengen in de gamma-fosfaat of het beta-gamma pyrofosfaat deel van nucleotide trifosfaat precursors substraten gefosforyleerd producten te maken. Het gebruik van γ -32- P label NTP precursoren zorgt voor de gelijktijdige opvolging van substraat gebruik en product vorming door radiografie. Dunnelaagchromatografie (TLC) op cellulose platen kan snelle scheiding en gevoelige kwantificering van substraat en product. Presenteren we een methode voor het gebruik van de dunne-laag chromatografie te assay de pyrophosphokinase activiteit van een gezuiverde (p) ppGpp synthetase. Deze methode is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de activiteit van cyclische nucleotide en dinucleotide synthetases en is in grote lijnen geschikt voor het karakteriseren van de activiteit van een enzym dat een nucleotide trifosfaat obligatie ontstabiel of overdraagt van een terminal fosfaat uit een fosfaat donor aan een andere molecule.
Inleiding
Kinase en pyrophosphokinase (of diphospho-kinase) enzymen overbrengen fosfaten uit nucleotide trifosfaat (NTP) precursoren substraat moleculen. De substraten kunnen omvatten andere nucleotiden, aminozuren of eiwitten, koolhydraten en vetten1. Bioinformatic analyses kunnen soms voorspellen van een enzym cognaat substraat of substraten op basis van de gelijkenis met gekarakteriseerd enzymen experimentele validatie is echter nog steeds nodig. Ook de affiniteit van een enzym voor haar substrate(s) en het tarief waartegen het katalyseert de fosfor-overdracht-reactie, en de effecten van cofactoren, remmers, of andere enzym effectoren moeten experimen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. afleidbare overexpressie van een Histidine-gelabelde proteïnen
- Amplify rsh van C. difficile R20291 genomic DNA.
- Gebruik van een polymerase van hifi- en volg de instructies van de fabrikant.
- Versterken van C. difficile rsh gebruikend inleidingen
rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) en
rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), waarin een C-terminal hexahistidine code wordt ingevoerd.
Opmerking: De KpnI- en PstI knippen van sites in de primer sequenties zijn vet. - De vector pMMBneo verteren en het PCR-product van rsh-his6 met P....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Presenteren we een methode voor de zuivering van de affiniteit van een (p) ppGpp synthetase van Clostridium difficile en de beoordeling van de enzymatische activiteit. Figuur 1 toont de eiwitreiniging bereikt door metalen affiniteitchromatografie. Het tweede deel van de elutie (E2) van deze reiniging was dialyzed en gebruikt voor de bepaling van de enzymatische activiteit. Figuur 2 geeft het nodige voorbereiden en uitvoe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier melden we de zuivering van zijn-gelabeld RSH van C. difficile en presenteer een methode voor de kwantificering van de activiteit met behulp van radiolabeled Dunnelaagchromatografie. Deze methode is eerder gebruikt om de activiteiten beoordelen van diguanylate cyclase enzymen van C. difficile, evenals (p) ppGpp synthetase, nucleotide cyclase, kinase en fosfodiësterase enzymen uit andere organismen11,12 ,13.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIAID 1K22AI118929-01. EBP werd gesteund door een subsidie van zomer Research Fellowship programma uit de Office of Research bij Old Dominion University, Norfolk, Virginia, Verenigde Staten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Induceerbare overexpressie van een histidine-getagd eiwit | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extractie Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restrictie-enzym | NEB | R0142S | |
| PstI restrictie-enzym | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competente E. coli (Hoge Efficiëntie) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competente E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge met JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | - | |
| Microcentrifuge met D3024/D3024R rotor | Scilogex | - | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | - | |
| Ultrasoon processor | Sonics | VC-750 | |
| Eiwit zuivering door nikkel affiniteitschromatografie | |||
| Ni-NTA hars | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Wegwerp Zwaartekracht kolommen, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialyse apparaat (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Elektroforese Cel | BioRad | 1658004 | |
| Eiwit activiteitstest door dunne laag chromatografie | |||
| Dunne laag chromatograaf (TLC) ontwikkelingstank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethyleenimine (PEI)-cellulose platen (20 cm x 20 cm, 100 μm dikte) met polyester ondersteuning | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lood, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-trifosfaat (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-difosfaat dinatriumzout (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Opslag fosfor scherm | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Scherm | |
| Storm 860 fosforimager | GE Healthcare Life Sciences | - |
Referenties
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6(2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
