Methodenartikel

Digitale analyse van immunokleuring van ZW10 interactie eiwit in menselijke Long weefsels

4.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58551

⸱

1 mei 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

In dit artikel

Samenvatting

ZW10 interactie eiwit (ZWINT) neemt deel aan de mitotische spil controlepost en de pathogenese van carcinoom. Hier introduceren we een methodologie van de immunokleuring van ZWINT in menselijke longkanker weefsels, gevolgd door het digitaal scannen van hele dia's en beeldanalyse. Deze methodologie kan digitale beelden van hoge kwaliteit en betrouwbare resultaten bieden.

Samenvatting

Het doel van deze studie is om een methodologie van de immuunkleuring van menselijke Long weefsels te introduceren, gevolgd door een digitale scan van de hele dia en beeldanalyse. Digitaal scannen is een snelle manier om een stapel dia's te scannen en digitale beelden met hoge kwaliteit te produceren. Het kan overeenstemmende resultaten opleveren met conventionele Lichtmicroscopie (CLM) door pathologen. Bovendien maakt de beschikbaarheid van digitale beelden het mogelijk dat dezelfde Slide gelijktijdig kan worden waargenomen door meerdere mensen. Bovendien kunnen digitale afbeeldingen van dia's in een database worden opgeslagen, wat betekent dat de verslechtering op de lange termijn van glaasjes wordt vermeden. De beperkingen van deze techniek zijn als volgt. Ten eerste heeft het kwalitatief hoogwaardig geprepareerd weefsel en de originele immunohistochemie (IHC) glijbanen nodig, zonder enige beschadiging of overtollig afdichtings residu. Tweede, tumor of nontumor gebieden moeten worden gespecificeerd door ervaren pathologen vóór de analyse met behulp van software, om verwarring over de tumor of nontumor gebieden tijdens het scoren te voorkomen. Ten derde moet de operator de kleurreproductie tijdens het digitaliseringsproces in volledige diabeeldvorming controleren.

Inleiding

ZW10 interactie eiwit (zwint) is een noodzakelijk onderdeel van het kinetochoor complex dat betrokken is bij de mitotische spil controlepunt1,2,3. Er is gemeld dat de uitputting van zwint leidt tot afwijkende voortijdige chromosoomsegregatie1,2,3. Recente studies hebben gesuggereerd dat zwint is betrokken bij de pathogenese van meerdere tumoren door het bevorderen van de proliferatie van tumorcellen4,5. Eerder rapporteerden we de overexpressie van ZWINT in longkanker5. Het is algemeen aanvaard dat de analyse van dia's door pathologen die CLM gebruiken, tijdrovend is en niet kwantitatief6,7,8. Bovendien kan de verslechtering van de opgeslagen glaasjes het onmogelijk maken om eerder gemaakte dia's te intrekken. De opkomende methode van computergebaseerde, digitale whole-Slide Imaging (WSI) kan deze beperkingen6,7,8overwinnen.

Daartoe beschrijven we een methodologie van de immunokleuring van ZWINT in menselijke longkanker weefsels, in combinatie met digitale scanning van de hele dia en software-gebaseerde beeldanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze methodologie is de productie van overeenstemmende resultaten met clm. Deze technologie kan op grote schaal worden gebruikt op het gebied van pathologische scoring van hematoxyline-eosine kleuring (H & E) en IHC, fluorescentie in situ HYBRIDISATIE (vis), weefsel micro ARRAYS (TMA), en het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de ethische commissie van Zhongnan Hospital van Wuhan University en Renmin Hospital van Wuhan University.

1. voorbereiding van de IHC-glijbanen

  1. Fixeer het longweefsel monster door het menselijke longweefsel fragment (ongeveer 3 x 3 cm) in 4% Paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor 24 uur bij kamertemperatuur (RT) onder te dompelen.
  2. Dehydraat het weefsel in 80%, 95%, en 100% ethanol gedurende 15 min, 20 min, en 20 min, respectievelijk, bij kamertemperatuur. Tot slot, dompel het weefsel in 100% xyleen 3x voor 20 min elk bij kamertemperatuur.
  3. Voor inbedding, dompel het weefsel in paraffine (63 ° c) gedurende 30 min. Verander de paraffine en dompel het weefsel opnieuw op voor nog eens 45 min. Tot slot, verander de paraffine opnieuw en dompel het weefsel in het voor een extra 1 h.
  4. Gebruik een roterende microtoom om het weefsel in 5 μm dikke delen te snijden en plaats ze op 20 μg/mL poly-L-lysine-gecoate dia's.
  5. Voor het Dewaxing, plaats de glaasjes in een 65 ° c oven voor 2 h en dompel vervolgens de delen in dimethylbenzeen gedurende 15 minuten, gevolgd door onderdompelen in 100% xyleen gedurende 15 min.
  6. Hydrateer de dia's met de weefsel secties 2x voor 5 min in 100% ethanol, gevolgd door een behandeling met een serie verdunde ethanol van 5 min in 95% ethanol, 5 min in 80% ethanol, 5 min in 70% ethanol, en 5 min in 50% ethanol.
  7. Antigeen reparatie uitvoeren.
    1. Verdun citroenzuur reparatie vloeistof (20x) tot 1x met dubbel gedistilleerd H2o (DDH2o).
    2. Plaats de dia's met de weefsel secties en de 1x citroenzuur reparatie vloeistof (300 mL) in een antigeen reparatievak en verwarm ze vervolgens in de magnetron met hoog vermogen gedurende 2 minuten, gevolgd door verwarming op laag vermogen om het koken gedurende 6 minuten te ondersteunen.
    3. Laat de secties natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur.
    4. Vervang de citroenzuur reparatie vloeistof met 0,01 M PBS, was de secties 3x, elke keer gedurende 5 minuten, in het roterende Shaker bij kamertemperatuur.
  8. Elimineer de endogene peroxidase.
    1. Verdun 30% van H2o2 tot 3% met DDH2o, voeg het toe aan de glaasjes (zorg ervoor dat het alle weefsels bedekt) en inbroed de glaasjes in een natte doos bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
      Let op: de natte doos is een plastic doos van 10 x 15 cm en kan water bevatten.
    2. Was de dia's 3x, elke keer gedurende 5 minuten, met 0,01 M PBS in het roterende Shaker bij kamertemperatuur.
  9. Blokkeer het niet-specifieke antigeen.
    1. Verdun het geconcentreerde, normale geiten serum tot 10% geit serum met PBS met 0,1% Tween 20 (PBST).
    2. Voeg 10% geit serum toe aan de glijbanen en inbroed ze in de natte doos bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      Opmerking: het geiten serum moet alle weefsels in de glaasjes bedekken.
  10. Vlekken op de weefsels.
    1. Inbroed de glaasjes met konijn anti-humaan anti-ZWINT antilichaam (1:50) bij 4 °C 's nachts.
    2. Was de dia's 3x, elke keer gedurende 5 minuten, met 0,01 M PBST (1 mL 0,1% Tween 20 in 1.000 mL PBS) in het roterende Shaker bij kamertemperatuur.
    3. Inbroed de glaasjes met secundair antilichaam (anti-konijn detectiesysteem, 1:200) gedurende 30 min bij 37 °C.
    4. Was de dia's 3x, elke keer gedurende 5 minuten, met 0,01 M PBST in het roterende Shaker.
  11. Om de immunokleuring te visualiseren, voeg de glaasjes toe aan 300 μL vers 3, 3-diaminobenzidine en was de glijbaan met kraanwater bij kamertemperatuur.
    Opmerking: de mate van het verven wordt gecontroleerd onder een microscoop (vergroting 10X-40X).
  12. Het weefsel tegen vlekken. Vlek de dia's met een hematoxyline-kleurings oplossing gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en was de dia's vervolgens met kraanwater gedurende 15 minuten.
    Opmerking: de Nucleus wordt blauw weergegeven onder de Microscoop (vergroting 10X-40X). Als de mate van blauwe kleuring krachtiger is, kan zout-alcohol differentiatie voor 3-5 s worden gebruikt, gevolgd door het weefsel gedurende 15 minuten terug te spoelen naar blauw met kraanwater om de prominente kleuring van het weefsel te vergemakkelijken.
  13. Dehydraat de glaasjes 5 min in 50% ethanol, 5 min in 70% ethanol, 2x in 80% ethanol gedurende 5 min, 5 min in 95% ethanol, en ten slotte 2x voor 5 min elk in 100% ethanol bij kamertemperatuur.
  14. Voor transparantie, dompel de weefsel secties in een tank met 100% xyleen gedurende 15 minuten en breng de secties over naar een andere tank met 100% xyleen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Neem voor het afdichten 50-100 μL neutrale gom en voeg 5% xyleen toe aan het mengsel (Vermijd mengen in bellen). Voeg 15 μL van het bovengenoemde mengsel toe aan de longweefsel secties. Sluit de folie af met afdekglas en druk zachtjes op de bellen.

2. automatische volledige Slide scanning van IHC slides

  1. Laat de verzegelde glaasjes gedurende 12 uur op kamertemperatuur drogen om ze droog te maken.
  2. Selecteer de optie helderveld handmatig en voer de handmatige scan interface in.
  3. Wijzig de naam van de dia's en selecteer een opslagpad voor de afbeeldingen.
  4. Stel het scangebied in en kies de optie Scan samples met behulp van door de gebruiker ingestelde drempels. De drempel is ongeveer 50 met een scangebied uitbreidings waarde van 200 μm.
  5. Stel de waarde voor de scan focus in, selecteer automatisch de focus — het varieert van 1050 tot 2650 — en selecteer ten slotte de modus voor één laag.
  6. Laad de IHC-dia's op het werkstation en start het automatisch scannen.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de dia's niet beschadigd zijn. Houd de dia's schoon en doorschijnend en Vermijd stof, confetti en overtollige Afdicht resten op de dia's. De glazen glijbaan en dekglaasje moeten verstoken zijn van markeringen. Reinig de glaasjes niet met xyleen. De grootte van de dia's wordt aangegeven in tabel 1.
  7. Scan de volledige weefsel sectie automatisch op een dia met een vergroting van 20X, 40X of 100X.
  8. Verzamel en bewaar de afbeeldingen aan het einde van het scannen van de hele dia.

3. analyse van de slides door Imaging software

  1. Start de histopathologische beeldanalyse software en selecteer lokale computer.
  2. Open het bestand waarin de scangegevens worden opgeslagen.
  3. Selecteer het gewenste zoomniveau van bereik 2X tot 40X.
  4. Pas de kleur aan om het optimale contrast in te stellen via kleuraanpassingin-/uitschakelen.
  5. Cirkel handmatig en noem de gedeelten van de interesse op elke afbeelding.
    Let op: u bijvoorbeeld een gebied omcirkelen en het als tumor gebiednoemen.
  6. Selecteer plugins en QC. Op dit moment, scenario Builder verschijnt.
  7. Selecteer dichtheids Quant en pas de detectie balk aan.
    Opmerking: dit proces moet zorgvuldig worden uitgevoerd. De balk met blauwe tolerantie wordt gebruikt om de kleur van de cellulaire kern aan te passen. De balk met bruine tolerantie wordt gebruikt om de verzadiging van de vulkleur in de afbeelding aan te passen. De resultaten van de beelden na aanpassingen moeten consistent zijn met de oorspronkelijke tegenhangers.
  8. Pas de Score niveaus aan om de kleurings intensiteit van de omcirkelde gebieden te laten lijken op die van de originele afbeeldingen.
    Opmerking: donker bruin duidt op sterk positief, bruinachtig geel is matig positief, licht geel is zwak positief en wit is negatief.
  9. Sla het model op en geef het een naam als bestand. Pas het model toe op andere dia's en selecteer geselecteerde aantekening".
  10. Laat de software automatisch de H-Score berekenen voor de omcirkelde gebieden in de afbeelding.

4. kwantificering van de scores met behulp van het H-scoring systeem9,10

  1. Bereken het percentage van de immunokleuring en de kleurings intensiteit (0: negatief, 1 +: zwak, 2 +: matig, 3 +: sterk).
  2. Gebruik een scorings systeem (H-Score) om de pathologische scores van de tumor en aangrenzende nontumor gebieden te berekenen.
    Opmerking: H-Score = (% van cellen met zwakke intensiteit x 1) + (% van cellen met matige intensiteit x 2) + (% van cellen met sterke intensiteit x 3). Daarom is de maximale H-Score 300 als 100% van de cellen met een sterke intensiteit wordt gekwantificeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben de expressieniveaus van ZWINT gemeten in 28 paren van niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-specimens (tumor en aangrenzende nontumor weefsels), waaronder 14 plaveiselcel carcinomen (Scc's) en 14 adenocarcinomen (ADCs), door IHC. De digitale afbeeldingen van hoge kwaliteit (Figuur 1a) worden digitaal gescand op de dia's. De resultaten toonden aan dat de H-Score van de longkanker significant hoger was dan die van aangrenzende niet-kanker weefsels (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Scannen in hele dia's wordt een hot topic voor het robuuste scannen en produceren van afbeeldingen van hoge kwaliteit voor klinische en onderzoeksdoeleinden11,12,13. Afbeeldingen kunnen worden geproduceerd door dia-Scanning microscopen binnen minuten11,12,13. Door toepassing van deze methodologie, we verkregen van hoge kwaliteit beelden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project werd gesteund door de National Natural Foundation of China (nr. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 en 81501352) en de natuurlijke Stichting van de provincie Hubei (China) (nr. 2017CFB631). De auteurs uiten hun waardering voor Guo Qin, Chang min, Li Hui, en hun collega's bij Wuhan Google Biological Technology Co., LTD voor hun technische ondersteuning. De auteurs bedanken ook Mohammed Jamal voor de taal bewerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Pannoramic MIDI3D HISTECHCat: PMIDI-040709Een geautomatiseerde digitale diascanner met een opmerkelijke reeks functies: capaciteit voor 12 dia's, fluorescentiescanning en nog veel meer.
QuantCenter3D HISTECHGedownload van de officiële website van het bedrijfHet raamwerk voor de beeldanalysetoepassingen van 3DHISTCH.
LEICA RM2235Leica MicrosystemsCat: 14050038604De verbeterde precisie van de nieuwe accessoires zal gemak toevoegen aan de block to knife-aanpak evenals specimenoriëntatie.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibodyAbcamCat: ab197794Immunohistochemische analyse van ZWINT in menselijk longweefsel.
Anti-rabbit secondary antibodyWuhan Goodbio TechnologyCat:GB23303-1Secundaire antilichaam voor IHC-kleuring.
Phosphate-buffered salineWuhan Goodbio TechnologyCat:G0002Een oplossing die een fosfaatbuffer bevat.
OLYMPUS CX23OLYMPUSCat:6M87620Microscoop voor detectie van H&E of IHC-dia's.
DimethylbenzeneShanghai Lingfeng Chemical ReagentCat:1330-20-7Een kleurloze, ontvlambare vloeistof die wordt gebruikt als oplosmiddel en verhelderend middel bij de bereiding van weefselsecties voor microscopisch onderzoek.
Hematoxylin Staining SolutionWuhan Servicebio technologyCat:G1039Het wordt vaak gebruikt voor histologische studies, kleurt vaak de kernen van cellen blauw.
Tween 20BaitgCat:2005-64-5Het is een polysorbaat-type niet-ionogene oppervlakteactieve stof die wordt gevormd door de ethoxylering van sorbitan vóór de toevoeging van laurinezuur. Het wordt gebruikt als detergens en emulgator in farmacologische toepassingen.
Citric acid repair liquidWuhan Servicebio technologyCat:G1202Het wordt gebruikt om antigeen te repareren na fixatie tijdens de IHC-procedure.
LEICA ASP200sLeicaCat: 14048043626Het is ontworpen voor routine en onderzoek in histopathologie van maximaal 200 cassettes.
LEICA Arcadia HLeicaCat: 14039354103Het is een verwarmde paraffine-inbeddingsstation en zorgt voor eenvoudige bediening en nauwkeurige controle, resulterend in verbeterde kwaliteit, een vlotte workflow en betrouwbaarheid.
LEICA Arcadia CLeicaCat: 14039354102Het is een koude plaat die meer dan 60/65 cassettes op zijn grote werkoppervlak houdt. Het is ontworpen met een omgevingsadaptief controlemodule om ervoor te zorgen dat de bedrijfstemperatuur altijd gestabiliseerd is op -6°C.
CaseViewer Software3DHISTECH
```

Referenties

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Whole slide scanningdigitale beeldanalyseweefselpreparatieantigeen retrievalantilichaamlabelingDAB kleuringhematoxyline tegenkleuringAPE scoreberekeningZWINT expressie

Gerelateerde artikelen