CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Samenvatting

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

Samenvatting

Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) integreert zijn proviraal DNA niet-willekeurig in het genoom van de cel host op terugkerende sites en genomische hotspots. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van nieuwe in vitro modellen voor HIV-infectie met gekozen genomic integratie sites met behulp van CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering technologie. Met deze methode kan een verslaggever opeenvolging van keuze worden geïntegreerd in een gerichte, gekozen genomic locus, als gevolg van de integratie van klinisch relevante sites.

In het protocol, worden het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever en kiezen voor een doel-site en gRNA-sequence beschreven. Een targeting vector met homologie armen is gebouwd en in Jurkat T cellen transfected. De verslaggever-reeks is gericht op de geselecteerde genomic site door homologe recombinatie vergemakkelijkt door een Cas9-gemedieerde dubbel-strand break op de doelsite. Eencellige klonen zijn gegenereerd en gescreend voor het targeten van gebeurtenissen door stroom cytometry en PCR. Geselecteerde klonen zijn dan uitgebreid en de juiste targeting is geverifieerd door PCR, sequencing en Southern blotting. Potentiële uit doelsoort zijn gebeurtenissen van CRISPR-Cas9-gemedieerde genoom engineering worden geanalyseerd.

Met behulp van dit protocol, de nieuwe cel cultuur systemen kan dat model HIV-infectie op klinisch relevante integratie sites worden gegenereerd. Hoewel de generatie van eencellige klonen en verificatie van de juiste verslaggever reeks integratie tijdrovend is, zijn de resulterende klonale lijnen krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van functioneel proviraal integratie site keuze.

Inleiding

Integratie van proviraal DNA in het genoom van de host na infectie is een cruciale stap in de levenscyclus van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV). Na de integratie, HIV blijft door de oprichting van latentie in langlevende CD4 + T cel subsets zoals geheugen CD4 + T cellen. HIV integratie lijkt te zijn non-random^1,2. Een aantal genomic hotspots met productlevering geïntegreerde proviraal DNA is vastgesteld in verschillende studies door de sequencing van integratie sites in acuut en chronisch geïnfecteerde individuen^2,3,

Protocol

1. gericht op de strategie voor genoom Engineering en Targeting Vector (tv)-ontwerp

Opmerking: De eerste stap van genoom engineering impliceert selectie en generatie van de nodige instrumenten voor CRISPR-Cas9-gemedieerde targeting. Selectie van een genomic integratie site locus, keuze van celtype voor targeting, en het ontwerp van een HIV-afgeleide verslaggever voor integratie moeten voorafgaan aan deze stap. Dit protocol beschrijft doelgerichtheid van een HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA minimale verslaggever in Jurkat doelcellen. Een stroomschema van de workflow voor CRISPR-Cas9-gebaseerde targeting, generatie, screening en verific....

Resultaten

In dit representatieve experiment hebben wij besloten te richten op een minimale HIV-1-afgeleide verslaggever die bestaat uit een LTR, volgorde tdTomato-codering en polyA-signaal volgorde naar twee loci in intron 5 van de BACH2 gen¹⁷. De loci voor targeting werden gekozen op basis van nabijheid naar gepubliceerde terugkerende integratie sites gevonden in verschillende studies op primaire T-cellen van HIV-geïnfecteerde patiënten^2,<.......

Discussie

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van HIV-1-afgeleide Jurkat verslaggever modellen met gekozen proviraal integratie sites CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom engineering toe te passen.

Verschillende punten van het protocol vereist zorgvuldige aandacht tijdens de planningsfase. Ten eerste de locus worden gericht moet worden zorgvuldig gekozen, zoals sommige loci gemakkelijker te richten dan anderen wellicht (bijvoorbeeld, afhankelijk van de status van de chromatine van de r.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector voor expressie van SpCas9 en gRNA
pMK	GeneArt		expressievector voor zoogdieren voor klonen
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	expressievector voor zoogdieren voor klonen
BbsI	New England Biolabs	R0539S	restrictie-enzym
NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5520S	Assembling-klonering kit gebruikt voor het genereren van doelvector
TaqPlus Precision PCR System	Agilent Technologies	600210	DNA-polymerase met proof-leesactiviteit gebruikt voor amplificatie van homologiearmen (stap 1.2.2.2), verificatie van integratiesite en reportersequentie (stap 3.3.3 en 3.3.5), generatie van genomische sonde voor Southern blot (stap 3.4.1.5) en analyse van off-target-gebeurtenissen (stap 3.5.4)
96-well tissue culture plate (round-bottom)	TPP	92097	weefselkweekplaten voor verdunningsbeplating
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530 L	DNA-polymerase gebruikt voor detectie van targeting-gebeurtenissen (stap 2.4.2) en generatie van reporter-specifieke sonde voor Southern blot (stap 3.4.1.4)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimethylsulfoxide als PCR-additief
Magnesium Chloride (MgCl2) Solution	New England Biolabs	B9021S	MgCl2-oplossing als PCR-additief
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S	dNTP-mengsel met 10 mM van elke nt voor PCR-reacties
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	klaar-voor-gebruik PCR-mix gebruikt voor screening PCR (stap 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	DNA-isolatie- en zuiveringskit
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	PCR-zuiveringskit
RPMI 1640 without glutamine	Lonza	BE12-167F	celkweekmedium
Fetal Bovine Serum South Africa Charge	PAN Biotech	P123002	aanvulling celkweekmedium
L-glutamine	Biochrom	K 0282	aanvulling celkweekmedium
Penicillin/Streptomycin 10.000 U/mL/ 10.000 µg/mL	Biochrom	A 2212	aanvulling celkweekmedium
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media	Thermo Fisher Scientific	31985062	celkweekmedium met verlaagde serumconcentratie, geoptimaliseerd voor transfectie
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	transfectie reagens
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	celkweekreagens
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	celkweekreagens
Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm	Millex	SLGP033RB	filtereenheid voor steriele filtratie
Heracell 150i incubator	Thermo Fisher Scientific	51026280	weefselkweekincubator
Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	positief geladen nylonmembraan voor DNA- en RNA-blotting
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	UV-crosslinker
High Prime	Roche	11585592001	kit voor het labelen van DNA met radioactief dCTP met behulp van willekeurige oligonucleotiden als primers
illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns	GE Healthcare	28-9034-08	chromatografie-spinkolommen voor zuivering van gelabeld DNA