Ontwikkeling en het gebruik van de Angiographic van het konijn VX2 Model voor leverkanker

Samenvatting

Het doel van dit artikel is bedoeld als een primer voor de ontwikkeling en het gebruik van de VX2 carcinoom konijn model voor leverkanker.

Samenvatting

De konijn VX2 tumor is een dierlijk model vaak gebruikt voor translationeel onderzoek met betrekking tot hepatocellulaire carcinoom (HCC) op het gebied van Interventionele radiologie. Dit model maakt gebruik van een anaplastic plaveiselcelcarcinoom is gemakkelijk en betrouwbaar doorvoeren in de skeletspieren van donor konijnen voor uiteindelijke oogst en allograft innesteling in de lever van naïeve ontvangers. Deze tumor graft groeit snel in de lever van geadresseerden konijnen in een angiographically identificeerbare tumor gekenmerkt door een necrotische kern omgeven door een haalbare hypervascular-capsule. De fysieke grootte van de anatomie van het konijn is voldoende om vasculaire instrumentatie toestaan voor de toepassing en het testen van verschillende Interventionele technieken. Ondanks deze voordelen bestaat er een gebrek aan technische middelen om op te treden als een concrete verwijzing voor onderzoekers die werken met het model. Hierin presenteren wij een uitgebreide visuele schets voor de technische aspecten van de ontwikkeling, groei, voortplanting en angiographic gebruik van het konijn VX2 tumor model voor gebruik door beginnende en ervaren onderzoekers gelijk.

Inleiding

Het konijn VX2 tumor model heeft een rol gespeeld in de experimentele oncologie sinds haar ontwikkeling in 1935^1,2. Deze tumor is een virus-geïnduceerde anaplastic plaveiselcelcarcinoom gekenmerkt door hypervascularity, snelle groei en gemakkelijke vermeerdering in skeletspieren^3,4. Terwijl het konijn VX2 tumor model is gebruikt om te onderzoeken van een veelheid aan kanker^5,6,7,8; de focus van deze paper is leverkanker⁹.

Het doel van de beschreven methode is om een model van primaire leverkanker of hepatocellulaire carcinoom (HCC), die kan worden gebruikt door Interventionele radiologen voor translationeel onderzoek. Het kan worden gebruikt voor farmacokinetisch onderzoek, therapeutische onderzoeken en ablatieve methode voor het testen van^{10,11,12,13,14,15}.

De methode gedetailleerd hierin levert meerdere voordelen ten opzichte van andere modellen binnen de dezelfde sfeer zoals knaagdieren modellen zoals ratten, muizen, en woodchucks, of grotere modellen zoals primaten¹⁶. Een van de belangrijkste voordelen is de snelle en betrouwbare tumorgroei waarmee onderzoekers om een actieve tumor lijn binnen een maand na de eerste hind-limb propagatie¹⁷. Bovendien heeft deze tumor eenvoudig sonographic zichtbaarheid en de periferie van een hypervascular die het mogelijk voor zowel transarterial regionale behandelingen en ablatieve therapieën maakt. Tot slot, en dit is het belangrijkst, staat de grootte van het konijn therapieën haalbaar en technisch gemakkelijk gebruik van vasculaire instrumentatie¹⁸.

Protocol

Het volgende protocol volgt alle vereisten en richtlijnen opgelegd door de Universiteit van Illinois - Chicago. Het werd beoordeeld en goedgekeurd door de lokale institutionele Animal Care en gebruik Comité voorafgaand aan de uitvoering.

1. VX2 Hind-Limb Tumor ontwikkeling

1. Schaffen de VX2 tumor cellijn van het nationaal kanker instituut divisie van kanker behandeling diagnose en behandeling Tumor/cel lijn Repository.
   Opmerking: Op dit moment, de catalogus van de bestelling kan worden gevonden op de volgende link: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Ter voorbereiding van de celsuspensie van injectie, plaatst u het bevroren VX2 monster en methylcellulose medium in lauw water totdat ze hebben ontdooid.
   1. Gecombineerd 0.5\u20121 mL van de ontdooide celsuspensie en een gelijke hoeveelheid ontdooide methylcellulose medium in een 5-mL spuit.
      Opmerking: Het kan helpen om een 21 of 22 G naald aan de celsuspensie gecombineerd en een grotere spoorbreedte naald naar het medium methylcellulose gecombineerd te gebruiken. Plaats de spuiten op ijs.
3. Voorbereiden op de hind-limb tumor donor konijn inoculatie van celsuspensie, beginnend met sedatie met behulp van 1 mg/kg acepromazine en 0,02 mg/kg buprenorfine intramuscularly gegeven. De inoculatie site (hind-limb) scheren met tondeuse en schoon de geschoren zijn met een alcohol - of jodium-gebaseerde agent.
   Opmerking: Meloxicam kan worden gegeven bij een dosis van 0,2 mg/kg subcutaan voor analgesie. Konijn vacht is moeilijk te scheren. Het wordt aanbevolen dat de onderzoeker uitvoeren meerdere pasjes, eerst gericht op clearing een bulk van de vacht en vervolgens te drukken de clippers tegen de huid en gaan tegen de korrel.
4. Een naald 16 G hechten aan de 5 mL spuit met de celsuspensie en injecteren 1 mL van de suspensie in de buik van de hind-limb spier van de donor konijn, ongeveer 1 cm diep. Zorg ervoor dat het bewaken van de nervus ischiadicus uitgevoerd binnen een tastbaar groef langs het dijbeen.
   Opmerking: Verse VX2 met succes inoculates 88% van onderwerpen terwijl ingevroren en gedooid VX2 alleen succesvol 33% van de tijd-^{19 is}.
   Let op: De VX2 tumor groeit snel. Bijwerkingen die kunnen worden opgemerkt als de tumor vordert zijn: verhoogde ademhaling, lethargie, verminderde alertheid, en/of gedragsveranderingen (b.v., ongebruikelijke agressiviteit). Daarom zijn aanbevelingen voor de dieren om nauwlettend te volgen en te plannen voor tumor oogst binnen twee weken na inoculatie.

2. VX2 Hind-Limb tumorgroei en oogsten

Opmerking: Ervan uitgaande dat succesvolle inenting, moet er een tastbaar (3\u20124 cm) tumor knobbeltje op de injectieplaats binnen 2 weken. Meestal zullen deze knobbel voelbaar ongeveer 1 week; het is echter beter te laten de tumor groeien te voorzien van voldoende weefsel collectie. Meestal zullen deze knobbel stevig, indurated en verheven boven het niveau van de spier. Als

1. De geënte gebied op 2 weken na inoculatie palperen. Als geen tumorgroei wordt ontdekt op 2 weken, stap 1 opnieuw uitvoeren. Zie Figuur 1.
   Opmerking: De aanwezigheid van de tumor kan ook worden beoordeeld via echografie. Terwijl er geen studies om te evalueren van het verschil in tumor groei statistieken wanneer doorgegeven uit bevroren voorraad in vergelijking met verse voorraad, het is onze ervaring dat de bevroren voorraad tumor iets langzamer groeit geweest en zullen detecteerbare na zijn verse voorraad contra deel. Hoe dan ook, moet beide methoden een oogstbare tumor opleveren door 2 weken.
2. De hind-limb tumor donor voorbereiden tumor oogst. Anesthetize het konijn met 45 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine. Euthanaseren met een intraveneuze (IV) dosis natrium pentobarbital meer dan 390 mg/kg.
3. Zodra het konijn heeft geweest euthanized, beginnen de tumor oogsten door het verwijderen van de huidweefsels en onderhuidse weefsels overliggende de knobbel van de tumor met behulp van een scalpel met welke grootte mes de onderzoeker goeddunkt. Zie Figuur 2.
4. Zodra de tumor knobbeltje is geconstateerd in de spier hind-limb, verwijderen de tumor en bloc met brede kromlijnige marges. Voor dit, knip de tendinous koppelingseisen punten aan de proximale en distale uiteinden van de van de spier en vervolgens het spoor het scalpel blad langs het onderliggende bot. Bisect het transplanteren model bloot van de tumor en de capsule necrotische kern. Zie Figuur 3.
   Opmerking: De VX2 tumor heeft een zeer necrotische kern. Zorg ervoor dat u juiste oogbescherming en andere persoonlijke beschermingsmiddelen wanneer oogsten van de tumor, aangezien de eventuele schade aan de capsule van de tumor kan leiden tot hoge druk uitwerpen van necrotisch debris.
5. Voorzichtig schrapen de necrotische kern met een stomp voorwerp (bijvoorbeeld pincet, hemostats) de tumor schoon te maken. Dit moet zorgen voor betere visualisatie van de capsule van de tumor en het overgangspunt tussen de capsule en de omringende spieren. Zie Figuur 4.
6. Uit dit voorbeeld, oogst verschillende stukken van de tumor ongeveer 1\u20122 mm³ en ze onmiddellijk opslaan in een kopje met kamertemperatuur steriele zoutoplossing.
   Opmerking: Deze tumor monsters zal worden gebruikt voor latere Intrahepatische implantatie.
7. Plaats van de resterende tumor in een steriele petrischaal en baden het met Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM). Als dit exemplaar op ijs koud wordt gehouden, kan het worden behouden voor de verwerking tot 2\u20123 h later.

3. lever Tumor implantatie via laparotomie

1. Het ontvangende konijn voorbereiden laparotomie. Anesthetize van het ontvangende konijn met ketamine 45 mg/kg en 5 mg/kg xylazine voor inductie gevolgd door intubatie en onderhoud met 1%--3% Isofluraan als nodig. Wanneer het konijn is verdoofd, scheren de chirurgische site met behulp van tondeuses. Reinig het gebied van de incisie met drievoudige wassen met betadine scrub, 70% ethanol oplossing en betadine oplossing, en het abdomen op een steriele chirurgische wijze draperen.
2. Starten met een #15-mes, de laparotomie doordat een kleine neerwaartse verticale middellijn incisie door de rabbit's huid vanaf de xiphoid process. Dit gemakkelijk moet worden gepalpeerd en de neiging te worden ongeveer de grootte van een Amerikaanse cent. Zie Figuur 5.
3. Weerspiegelen van de huid en identificeren de linea alba. Dit moet een reflecterende witte band van weefsel reizen ondeugdelijkheid in de schouderstreek. Gebruik van botte dissectie doorkruisen op weg naar de linea alba en het blootstellen van het buikvlies. Zie Figuur 6.
   Opmerking: Het buikvlies is gemakkelijk worden geïdentificeerd omdat het zal worden direct overliggende de darm, die kan worden gezien met de ademhaling.
   Let op: Het buikvlies neigt te zijn aanhangend aan de onderliggende darm als gevolg van oppervlaktespanning. Met behulp van stomp trauma om te ontleden de linea alba helpt bij het verdrijven van het risico van de onderliggende darm perforeren.
4. Zodra het buikvlies is blootgesteld, zorgvuldig ontleden door middel van het invoeren van de peritoneale holte. De lever kan nu worden geïdentificeerd. Ga beter de abdominale ruimte, breiden de middellijn incisie 1\u20122 cm ondeugdelijkheid via de huid, spier en buikvlies.
   Opmerking: Uitbreiding van de middellijn incisie kan gemakkelijk en veilig gebeuren door zorgvuldig een gebogen hemostat invoegen in de peritoneale ruimte met het gebogen uiteinde oppervlakkig naar het buikvlies gericht. Vervolgens opent de hemostat lichtjes en gebruik een mes om cute het weefsel tussen de twee takken van de hemostat.
5. Identificeer de linker kwab van de lever om te kiezen een site voor de inplanting van de tumor. De linker kwab is infero-lateral aan de mediale kwab, die in de schouderstreek zit.
6. Voordat u probeert te trekken van de lever uit de peritoneale ruimte, plaatst u een droog stuk gaas aan de inferieure aspect van de incisie.
   Opmerking: De gaas zorgt een aanhangend oppervlak om de lever op te leggen om te voorkomen dat het terug in de buik intrekken.
7. Met behulp van atraumatische pincet of een stukje natte gaas over de vingers, zorgvuldig trekken de linker kwab van de lever uit de buik door de incisie en leg het neer op het droge gaas eerder geplaatst. Zie Figuur 7.
   Let op: De lever capsule is gevoelig en kan gemakkelijk scheuren. Het is cruciaal voor het zacht worden bij de behandeling van dit orgaan om te voorkomen dat de kapselvorming bloeden, lever kneuzingen en/of eventuele hemoperitoneum.
   Opmerking: Meestal de lever zal verklaren zich visueel bij binnenkomst de peritoneale ruimte; echter, als het konijn van maag opgezwollen, de lever kan worden geduwd cranially uit het zicht. Als dit het geval, til voorzichtig de buikwand met een botte sonde. In dit scenario, de lever heeft de neiging zich te houden aan de ventrale aspect van het middenrif als gevolg van oppervlaktespanning zo zorgvuldig aparte de lever met een botte sonde en het moet losmaken. Gebruik vervolgens atraumatische pincet te trekken van de lever uit.
8. Op dit punt, de tumor weefsel voorbereiden implantatie en plaats een stukje natte gaas over de lever te beschermen.
9. Selecteer een 1\u20122 mm³ stukje tumor weefsel dat werd gegenereerd tijdens stap 2.6 voor inplanting in de lever. Zie Figuur 8.
10. Met behulp van een #11-mes, doorprikken het leverweefsel bij een hoek van 45° maken een 0.5 cm diepe zak, niet om te penetreren het dorsale aspect van de lever capsule verzorgen. Laat het blad staan na het maken van het lek. Zie Figuur 9.
11. Til voorzichtig het mes in ventrale richting tot het maken van een klein zakje in de lever bed. Neem het stuk van de tumor met pincet, plaats van de tumor stuk in deze zak en verwijder het blad.
    Opmerking: Het blad kan worden verwijderd vóór de invoegen de tumor stukje, echter de lever zal bloeden en dit kan obscure de punctie-site waardoor het moeilijk te identificeren.
    Let op: Zorg ervoor dat Minimaliseer contact van de tumor met enige andere structuren om te voorkomen dat onbedoelde tumor zaaien. Dit kan ook worden vermeden door afgezien van ieder gereedschap gebruikt om te helpen met implantatie daarna.
12. Op dit punt, plaatst een stuk van hemostatische agent zoals gel schuim, op de zak van de tumor te bevorderen van hemostase en om te voorkomen dat uitwerpen van de tumor stuk.
13. De lever op de buik, terugkomen zodra hemostase is bevestigd.
14. Sluit de buikwand met 3-0 polydioxanone hechtdraad op een conus naald met behulp van een eenvoudige continu steek en sluit de huid met 4-0 polyglactin 910 hechtingen op een scherpe naald met continu subcuticular steek.
    Let op: Bij het sluiten van de buikwand, wees voorzichtig niet te beschadigen de majus of andere structuren van de darm in een hechtdraad gooien.
    Opmerking: Hoewel deze tumor ten minste 2 weken duurt worden definitief röntgenologisch identificeerbare, afmeting is bereikt een 1.5\u20122 cm doorsnede op 3 weken van de groei. Wees voorzichtig niet te laten de hepatische tumor groeien afgelopen weken 3.5\u20124, omdat de tumor een exophytic massa en agressief verspreid lokaal vormen zal.

4. VX2 Tumor schorsing voorbereiding

1. Plaats een 40 µm zeef in de monding van een tube van 50 mL conische propyleen. De tumor uit stap 2.7, gebruiken een #15-mes om schrapen het oppervlak van de tumor voor het verzamelen van levensvatbare tumor en plaats deze scrapings in de zeef.
2. Wassen van de levensvatbare tumor scrapings door een zeef met behulp van DMEM en vervolgens Centrifugeer de propyleen buis van 1600 toeren per minuut gedurende 8 minuten.
3. Nadat de centrifuge voltooid is, verwijdert u het supernatant en verwerp het. Voeg vervolgens methylcellulose aan de resterende cel blok bij een volumetrische verhouding van 1:1.
4. Deze schorsing injecteren een hind-limb donor konijn na stappen 1.3\u20121.4. Plaats de resterende schorsing in 1 mL aliquots in cryogene buizen en bevriezen ze in vloeibare stikstof voor later gebruik.

5. angiographic gebruik van de VX2 lever Tumor

1. Het konijn bereiden zoals beschreven in stap 3.1.
2. Palperen de femorale groef in de lies. Wanneer de groef is geconstateerd, moet een lineaire incisie van 2\u20123 cm langs de groef. Zie Figuur 10.
3. Botte dissectie, zoek en isoleren van de femorale bundel met de femorale ader slagader en de zenuwen. Zie Figuur 11.
4. Nogmaals, gebruik botte dissectie te scheiden van de femorale slagader van de rest van de structuren in de bundel en isoleren van de slagader bovenop de handgreep van een scalpel. Zie Figuur 12.
5. Met een 3-Frans introducer kit, gebruiken de Seldingertechniek om toegang te krijgen met een naald. Invoegen van een guidewire en verwijder de naald om de 3-Frans schede in het schip. Zie Figuur 13.
   Let op: Vermijd het gebruik van buitensporig geweld bij het bevorderen van de 3-Frans schede, aangezien dit in transect van de femorale slagader resulteren kan.
6. Selecteer onder fluoroscopic begeleiding en met behulp van een katheter, guidewire en iohexol contrast agent voor de coeliakie kofferbak — zich doorgaans op het niveau van de T12 — en vervolgens door de katheter in de linker hepatische slagader via het gemeenschappelijk hepatische en goede hepatische.
7. Op dit punt, het beheren van de agent van keuze door de katheter. Zodra de agent wordt toegediend, verwijderen van de katheter.
8. Met 3-0 zijde hechtdraad, afbinden de femorale slagader proximally en distally naar de invoegpositie van de schede. Zorg ervoor dat de knoop aan de schede proximale scherpen als het wordt genomen om te voorkomen dat het bloeden.
9. Sluit de insnijding van de lies met 4-0 polyglactin 910 hechtingen op een scherpe naald met behulp van een subcuticular steek.
10. Standaard post-operatieve zorg en monitor dierlijke herstel te handhaven. Euthanasie uit te voeren en zo nodig gebruik van standaardtechnieken van de necropsie.

Resultaten

Wanneer we kijken naar Figuur 1, is het duidelijk dat de quadricep van het konijn wordt vergroot. Daarnaast zijn meerdere kleine discrete knobbeltjes, meestal correleren met tumorgroei door middel van de fascia, zichtbaar. Bij palpatie, moet de ingespoten ledematen worden weergegeven dan de ledemaat niet-ingespoten. Als een onderzoeker meer definitieve verzekering van aanwezigheid van de tumor vereist, kan echografie imaging worden gebruikt voor identificatie...

Discussie

De eerste kritieke stap in de methodologie van de tumor VX2 is succesvolle voortplanting van een tumor in de hind-limb van een donor-konijn. Verwijzen naar de eerste alinea in de sectie "Vertegenwoordiger resultaten" voor meer informatie over deze stap.

De volgende kritieke stap is ervoor te zorgen dat de levensvatbare tumor capsule op de juiste manier wordt geïdentificeerd. Niet alleen zal dit noodzakelijk is voor de voorbereiding van de opschorting van de tumor, maar het is ook belangrijk vo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510