Photobleaching maakt super resolutie beeldvorming van de FtsZ Ring in de Cyanobacterium Prochlorococcus

Samenvatting

Hier beschrijven we een photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van cyanobacteriën. Na photobleaching, wordt stochastische optische wederopbouw microscopie gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale Super resolutiebeelden van de cyanobacteriën FtsZ ring.

Samenvatting

Super resolutie microscopie is wijd verbeid gebruikt om eiwitinteractie en subcellular structuren in vele organismen te studeren. In fotosynthetische organismen, is de resolutie van de laterale van super resolutie beeldvorming echter alleen ~ 100 nm. De lage resolutie is vooral te wijten aan de achtergrond van de hoge autofluorescence van fotosynthetische cellen veroorzaakt door hoge intensiteit lasers die vereist voor super-resolutie beeldvorming, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM zijn). Hier beschrijven we een photobleaching-bijgewoonde STORM methode die ontwikkeld werd onlangs voor de mariene picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Na photobleaching, de autofluorescence van Prochlorococcus is effectief verminderd zodat die STORM kan worden uitgevoerd met een laterale resolutie van ~ 10 nm. Met behulp van deze methode, wij verwerven de in vivo driedimensionale (3-D)-organisatie van het FtsZ eiwit en karakteriseren van vier verschillende FtsZ ring morphologies tijdens de celcyclus van Prochlorococcus. De methode we hier beschrijven zouden kunnen worden vastgesteld voor de super resolutie beeldvorming van andere fotosynthetische organismen.

Inleiding

Super resolutie microscopies kunnen breken de grens van de diffractie van licht en bieden een beeld binnen sub diffractie resoluties (< 200 nm). Ze hebben veel gebruikt in vele organismen eiwit lokalisatie en subcellular structuren te bestuderen. Grote super resolutie Microscopie methodes omvatten gestructureerde verlichting microscopie (SIM), gestimuleerd emissie uitputting microscopie (STED), STORM en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM). De mechanismen en de toepassingen van deze super resolutie microscopen geweest herzien elders^1,2.

STORM kan bereiken een resolutie zo h....

Protocol

1. voorbereiding en fixatie van de proeven

1. 1 mL van een Prochlorococcus MED4 tot 5 mL van de zeewater gebaseerde Pro99 middellange¹²beënten. Grow Prochlorococcus culturen bij 23 ° C onder het licht met een intensiteit van 35 µmol fotonen/m²s. vijf dagen later, verzamelen van 1 mL van de cultuur in een 1.5-mL-buis.
   Opmerking: Vijf dagen na de inenting, Prochlorococcus MED4 zal bereiken de late fase van de log, met ongeveer 10⁸ cellen/mL, die geschikt is voor beeldvorming van de STORM.
2. Voeg 100 µL van vers bereid uit 25% paraformaldehyde (PFA) (m/v) formaldehyde en 2 µL van 5....

Resultaten

STORM behaalt super resolutie beeldvorming door het activeren van individuele photoswitchable fluorophores stochastically. De locatie van elke fluorophore wordt geregistreerd en een super resolutiebeeld is dan opgebouwd op basis van deze locaties⁴. De nauwkeurigheid van de locatie van de fluorophore is daarom belangrijk voor de wederopbouw van de super-resolutie afbeelding. De spectra van de absorptie van Prochlorococcus piek bij 447 nm en 680 nm,en Pr.......

Discussie

In dit protocol, beschreven we een procedure aanzienlijk verminderen de autofluorescence van de cyanobacterium Prochlorococcus (Figuur 3 c) en, vervolgens, immunokleuring de eiwitten in de cellen, waardoor ons te gebruiken om te bestuderen van de 3D-FtsZ STORM ring morphologies in Prochlorococcus (Figuur 4). Dit protocol kan worden vastgesteld voor super-resolutie beeldvorming in andere fotosynthetische organismen.

E.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polystyrene particles	Spherotech	PP-20-10	2,0-2,4 µm
Coverslip	Marienfeld	0111580	18 mm ∅, Dikte No. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P9155	mol wt 70.000-150.000
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehyde solution, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA Disodium Salt, 2-hydrate	Gold biotechnology	E-210-500
Trizma base	Sigma	T1503
Lysozyme	Sigma	L6876
Goat serum	Sigma	G9023
anti-Anabaena FtsZ antibody	Agrisera	AS07217
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Life Technologies	A-21039	geconjugeerd met Alexa Fluor 750
D-Glucose Anhydrous	Fisher Scientific	D16-1
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Methyl Viologen	Sigma-Aldrich	856177
Cyclooctatetraene	Sigma-Aldrich	138924
tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	646547
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
XD-300 Xenon light source			250 W
STORM microscope	NBI	SRiS microscope
Rohdea	NBI	SRiS 3.0	software voor beeldverwerving
Luna	NBI	SRiS 3.0	software voor correctie van drift
QuickPALM			https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis
3D Viewer			http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home