Methodenartikel

Absorberend Microbiopsy bemonsterings- en RNA extractie voor minimaal invasieve, gelijktijdige bloed en huid analyse

DOI:

10.3791/58614

⸱

21 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Future Industries Institute, University of South Australia, 2Faculty of Medicine, University of Queensland, 3Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Princess Alexandra Hospital, 5Australian Craniofacial Unit, Women's and Children's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel tonen we hoe de absorberende microbiopsy-techniek is uitgevoerd en hoe de steekproef kan worden gebruikt voor RNA extractie voor eenvoudige en gelijktijdige sampling van huid en bloed op een minimaal invasieve manier.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conventionele Huidbiopt beperkt het klinische onderzoek waarbij cosmetisch gevoelige zones of pediatric toepassingen vanwege haar invasiviteit. Hier beschrijven we het protocol voor het gebruik van een absorberende microneedle-apparaat, absorberende microbiopsy, voor minimaal invasieve bemonstering van huid en bloed mengsel. Ons doel is om te helpen bevorderen van snelle vorderingen bij klinisch onderzoek, de oprichting van biomarkers voor huidziekte en vermindering van het risico voor klinisch onderzoek deelnemers. In tegenstelling tot conventionele huid biopsie technieken, de absorberende microbiopsy kan worden uitgevoerd binnen seconden en vereist geen intensieve training dankzij het eenvoudige ontwerp. In dit verslag beschrijven we het gebruik van absorberende microbiopsy, met inbegrip van laden en de toepassing, op een vrijwilliger. Vervolgens laten we zien hoe RNA isoleren van de geabsorbeerde monster. Tot slot tonen wij het gebruik van kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) te meten van de mRNA niveaus van de expressie van zowel bloed (CD3E en CD19) en huid (KRT14 en TYR). De methoden die we beschrijven gebruiken uit de kits van de plank en reagentia. Dit protocol biedt een minimaal invasieve benadering voor gelijktijdige bemonstering van de huid en het bloed binnen dezelfde absorberende microbiopsy matrix. Wij hebben menselijke ethische commissies, clinici en vrijwilligers te steunen deze benadering van dermatologische onderzoek gevonden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidbiopt is één van de meest essentiële technieken in Dermatologie voor bemonstering van de huid en daaropvolgende diagnose van de ziekten van de huid door histopathologisch evaluatie. De biopsie techniek omvat een medische professional met een mes of punch biopsie te verwijderen van de verdachte laesie op de huid van de patiënt voor onderzoek1. Hoewel de techniek effectief is, is het zeer invasieve en klinisch onderzoek beperkt zoals het eindpunt doorgaans2,3van de technieken van de moleculaire biologie behelst. Moleculaire analyse van ziekten van de huid heeft de potentie om zeer specifieke biologische informeren dat histopathologisch analyse kan niet, aldus drug discovery en ziekte diagnose4,5te vergemakkelijken. Bovendien, de vraag van de steekproef in meest moleculaire technieken is relatief klein en leiden tot een vermindering van dierlijke gebruik en toestaan een grotere aantal replicatieonderzoeken. Daarom is er een duidelijke behoefte aan een alternatieve techniek die toelaat moleculaire analyse in klinisch onderzoek en verlaagt risico voor deelnemers.

Om aan te pakken die behoefte in het veld, heeft onze fractie een roman microneedle gebaseerde diagnostische platform, absorberende microbiopsy, waarmee de verzameling van een kleine hoeveelheid huid vermengd met bloed in een eenvoudige en minimaal invasieve manier6ontwikkeld. Het doel van deze publicatie is voor het beschrijven van de absorberende microbiopsy als een bemonstering instrument ter bevordering van moleculaire analyse door middel van RNA extractie in klinisch onderzoek.

Eerder, hebben we de eerste versie van microbiopsy, microbiopsy van de huid, die uit een microneedle gemaakt van een drie-lagen plaatstaal ontwerp bestaat te halen kleine stukjes van de huid weefsels7beschreven. De nieuwigheid van dit apparaat komt uit de meerdere contactpunten van de microneedle dat efficiënt weefsel extractie3 toelaat. In tegenstelling, een circulaire punch Huidbiopt biedt slechts één contactpunt en tranen gewoon de huid zonder het vastleggen van een monster in sommige gevallen. Op basis van de microbiopsy van de huid, ontwikkeld wij onlangs de absorberende microbiopsy die zowel bloed en huid bemonstering mogelijkheden heeft. Het apparaat heeft aangetoond dat haalbaar voor gebruik in resource-arme gebieden in een recente epidemiologische studie6.

Dankzij het eenvoudige ontwerp, de absorberende microbiopsy kan worden uitgevoerd binnen een paar seconden en vereist geen uitgebreide training. Bovendien, lokale verdoving is niet nodig, en de toepassing site veroorzaakt geen littekens. Dit protocol kan onderzoekers of medische professionals zonder relevante bemonstering opleiding om gerichte huid gegevens voor moleculaire analyse te verkrijgen. Wij verwachten microsampling apparaten tot routine in huid onderzoek in de toekomst.

Hoewel de microbiopsy in andere huid ziekte studies die moleculaire diagnostische technieken6,8,9,10, zoals humaan papillomavirus DNA detectie, dit protocol heeft gemeld is de eerste om aan te tonen van de details van de steekproef winning en verwerking technieken voor de absorberende microbiopsy. Verder, dit is het eerste verslag met een beschrijving van de relatieve gen expressie profilering van huid en bloedcellen in microbiopsy monsters.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd door Metro Zuid-Comité voor ethiek van menselijk onderzoek en de Universiteit van Queensland menselijke ethiek onderzoekscommissie (HREC-13-QPAH-551 en UQ2013001551) en de Universiteit van Zuid-Australië menselijke ethische Commissie (200607).

1. absorberend Microbiopsy fabricage

  1. Laser gesneden microneedle delen van 50 µm medical-grade roestvrij staal blad en absorberende laag (filtreerpapier), respectievelijk (Figuur 1).
    Opmerking: Andere delen, met inbegrip van de zuiger en het geval van het apparaat zijn gefabriceerd met rapid-prototyping technieken, zoals 3D printen.
  2. Geniet van alle onderdelen, met uitzondering van de absorberende laag, in 70% ethanol (EtOH) voor 5 min en lucht droog ze daarna gedurende 30 minuten.
  3. Het monteren van de drie-laag microneedle, met de absorberende laag in het midden (Figuur 1a).
  4. De gemonteerde microneedle invoegen in de gleuf van de zuiger.
  5. Zet op de lente en de plunjer invoegen het geval (Figuur 1 c). Vermijd het aanraken van om het even wat in de montage procedure om de naald kwaliteit microneedle.
  6. Het zegel van de geassembleerde absorberende microbiopsy in een pakket voor de sterilisatie van de γ-straling voordat u gebruikt.

2. de bemonstering met de absorberende Microbiopsy

  1. Draag wegwerphandschoenen, en spray handen en hulpmiddelen, zoals pincet, met 70% EtOH.
  2. Zuiveren van de site van de toepassing met een alcohol doekje.
  3. Verwijder de microbiopsy uit de γ-straling gesteriliseerde pakket zonder het aanraken van de microneedle in het proces.
  4. Laad het apparaat door te trekken van de plunjer voor het comprimeren van het voorjaar tot er een 'Klik' geluid en de plunjer-sloten op zijn plaats.
  5. Proberen het apparaat op de huid te bemonsteren, ervoor te zorgen dat de bemonstering gebied in een vaste positie.
  6. Controleer of het apparaat ongeveer loodrecht op de huid, breng dan ≥1 kg van geweld aan het apparaat op de huid.
    Opmerking: Kracht naar beneden in de huid nodig is om voldoende penetratie van de microneedle.
  7. Druk op de trigger en houden van het apparaat op hun plaats voor een minimum van 10 s voor het bloedmonster te worden geabsorbeerd.
    Opmerking: Als het apparaat wordt vrijgegeven vóór 10 s, er is minder monster gevangen.

3. RNA extractie

Opmerking: De RNA extractie procedures werden gewijzigd van fabrikanten protocol voor optimale isolatie van RNA uit microbiopsied monster. Alle reagentia en bij RNA extractie gebruikte kolom zijn opgenomen in de kit tenzij anders aangegeven.

  1. Trek de plunjer en absorberende microneedle uit de zaak door handen zachtjes. Zorg ervoor dat het uiteinde van de microneedle niet met iets in aanraking tijdens het verwijderen komt.
  2. Verwijder de absorberende microneedle uit de plunjer. Houd op de twee gaatjes in de microneedle met een paar steriel pincet en het uitlichten.
  3. Zet de intact microneedle in een tube van 2 mL microcentrifuge (niet uit de RNA isolatie kit; Zie Tabel van materialen) gevuld met 50 µL van extractie Buffer, met de kant van de naald naar beneden naar de bodem. U wilt monster verlies te minimaliseren, laat de buis op droog ijs gedurende 5 minuten voordat het monster wordt verwerkt.
  4. Vortex kort (3-5 s) te verwijderen een aantal van de bemonsterde materiaal van de tip.
  5. Incubeer de microneedle in de buis op een rocker gedurende 30 minuten bij 42 ° C.
    Opmerking: De bufferoplossing zal worden geabsorbeerd in de absorberende laag onmiddellijk.
  6. Plaats het bovenste gedeelte van het microneedle (de andere kant van de naald)-niveau met de bovenrand van de 2 mL microfuge buis met behulp van steriele pincet.
  7. Sluit het deksel van de buis zodat de bovenkant van de microneedle op zijn plaats tussen het GLB en de buis is gehouden.
  8. Draai de buis bij 16.000 x g of bij de maximumsnelheid voor 30 s tot het bemonsterde materiaal uit de absorberende laag van het apparaat verwijderen.
  9. Verwijder de microneedle zorgvuldig met pincet zonder dompelen terug in de bufferoplossing. Behouden van de buis en negeren de microneedle.
  10. Centrifugeer de monsters bij 3000 x g gedurende 2 min. Pipetteer het supernatant met het uitgepakte RNA zorgvuldig in een nieuwe microcentrifuge buis.
  11. Voeg 250 µL van Conditioning Buffer op de zuivering kolom filter membraan en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Centrifugeer de kolom in de collectie buis bij 16.000 x g of bij de maximumsnelheid voor 1 min.
  13. Voeg 50 µL van 70% in de verzamelde monster uit stap 3.9 EtOH. Meng goed door pipetteren zachtjes op en neer.
  14. Breng het mengsel (~ 100 µL) in de kolom van geconditioneerde zuivering.
  15. Centrifugeer gedurende 2 min op 100 x-g onmiddellijk gevolgd door een centrifugeren bij 16.000 x g gedurende 30 s om de doorstroming.
  16. Voeg 100 µL van Wash Buffer 1 (W1) in de kolom van de zuivering en centrifuge voor 1 min 8.000 x g.
  17. Bereid DNase-oplossing door het toevoegen van 5 µL van DNase ik Stock oplossing voor 35 µL van Buffer RDD in een aparte microcentrifuge buis voor elk monster. Meng door zachtjes omkeren.
    Opmerking: De DNase behandeling is om te worden uitgevoerd op de zuivering kolom, in plaats van in de PCR-plaat daarna, vanwege de hoeveelheid van het monster.
  18. Voeg 40 µL van DNase incubatie mix rechtstreeks in het membraan van de kolom zuivering. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  19. Voeg 40 µL van W1 in het membraan van de kolom zuivering. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 15 s.
  20. Pipetteer 100 µL van Wash Buffer 2 (W2) in de kolom zuivering na de DNase behandeling en centrifuge voor 1 min bij 8.000 x g.
  21. Voeg een andere 100 µL van W2 in de kolom zuivering en Centrifugeer gedurende 2 min op 16.000 x g. Check de zuivering kolom voor elke resterende was buffer. Opnieuw Centrifugeer bij 16.000 x g voor 1 min als elke was buffer blijft.
  22. De zuivering kolom overbrengen in een nieuwe microcentrifuge-tube voor 0,5 mL is geleverd in de kit.
  23. Pipetteer 11 µL van RNase-gratis water (niet aanwezig in het RNA isolatie kit), in plaats van de Buffer van de elutie (EB), direct op het membraan van de zuivering kolom. Raak het uiteinde van de pipet naar de oppervlakte van het membraan zachtjes terwijl verstrekking van het RNase-gratis water om ervoor te zorgen maximale absorptie van RNase-vrij water in het membraan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
  24. Centrifugeer de kolom voor 1 min op 1000 x g te verdelen het RNase-gratis water in de kolom, dan Centrifugeer gedurende 16.000 x g bij 1 min te elueren RNA.
    Opmerking: RNA kwantificering is niet aanbevolen vanwege de kleine hoeveelheid van het monster.
  25. Punt #1 stop: opslaan van de totale steekproef van RNA bij-80 ° C als cDNA synthese wordt niet onmiddellijk uitgevoerd.
    Opmerking: Vermijd bevriezing indien niet nodig gezien de lage concentratie van RNA monster.

4. cDNA synthese

  1. Ontdooi het bevroren monster op ijs (uit stap 3,25).
  2. Synthetiseren cDNA uit totaal RNA met cDNA synthese kit volgens onderstaande procedure.
  3. Voorbereiden van de reactie-mix: 11 µL van totale RNA, 4 µL van 5 x TransAmp Buffer, 1 µL van reverse-transcriptase, 4 µL van DNase/RNase-gratis water. Meng zachtjes door pipetteren.
  4. Uitvoeren van omgekeerde transcriptie op een thermische cycler apparaat: 25 ° C gedurende 10 min, 42 ° C gedurende 15 minuten, gevolgd door een laatste reverse-transcriptase inactivatie stap bij 85 ° C gedurende 5 min.
  5. Punt #2 stoppen: het omgekeerde getranscribeerde monster bij-80 ° C bewaren tot gebruik.

5. qPCR reactie en Data-analyse

Opmerking: De inleidingen voor qPCR reacties werden ontworpen om het beslaan van intron grenzen om te voorkomen dat de versterking van genomic DNA met behulp van de NCBI Primer BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Het referentie-gen gebruikt in deze studie is RPLP0 (Zie de sectie discussie voor meer informatie).

  1. Ontdooi het bevroren monster op ijs (uit stap 4.5).
  2. QPCR met de qPCR master mix kit volgens de onderstaande procedure uit te voeren.
  3. Bereiden van master mix met de achterban per reactie: 5 µL van 2 x qPCR reactie mix, 0.4 µL van 10 µM voorwaartse primer, 0.4 µL van 10 µM omgekeerde primer, 2.2 µL van DNase-gratis water. Meng zachtjes door pipetteren. Instellen van de monsters in triplicates.
  4. Pipetteer 8 µL van de master mix in ieder putje van een 384-well PCR plaat eerste en vervolgens 2 µL van cDNA van elk monster (in totaal 10 µL per putje).
    Opmerking: Geen sjabloon controle (NTC) en oncontroleerbaar reverse-transcriptase (-RT) worden opgenomen als negatieve controles.
  5. Afdichting van de plaat met zelfklevende film en kort centrifugeren.
  6. Voer de versterking-reactie op een real-time thermische cycler: 95 ° C gedurende 2 minuten (activering van de polymerase), gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 5 s (denaturatie), 60 ° C gedurende 10 s (gloeien) en 72 ° C gedurende 10 s (extensie).
  7. Bereken de concentratie van de RNA van monsters door interpoleren van een standaard curve bereid uit sjablonen met een bekende concentratie.
    1. Maak een Nieuw Experiment in de software.
    2. Klik op definiëren en instellen van normen te stellen seriële verwatering voor platen.
    3. Selecteer en de putten om normen en monsters te regelen. Klik op toepassen.
    4. Klik op analyseren in het tabblad resultaat te beoordelen van de standaard curve. Bevestigen van de helling, R2 waarde, versterking efficiëntie en fout aan de experimentele criteria voldoen.
    5. Controleer de hoeveelheid aan de onbekende monsters visueel op de standaard curve op basis van hun Ct-waarden.
      Opmerking: De bouw van standaard curve, met inbegrip van de keuze van de verdunningsfactor, wordt uitgevoerd volgens gepubliceerde protocollen11,12,13.
  8. Gen expressie analyses van mRNA uit te voeren met behulp van de methode van de ΔCt (Ct is genormaliseerd naar een verwijzing-gen).
    1. Aftrekken van de waarde van de Ct van target-gen van de Ct-waarde van referentie gen om de waarde van de ΔCt te verkrijgen.
    2. Het gemiddelde van de waarden van de ΔCt van technische wordt gerepliceerd.
    3. Uitzetten en analyseren van de genexpressie met statistieken software11,14 (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Als alternatief, de gen expressie analyse is uitgevoerd volgens gepubliceerde protocollen13.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerder hebben we gemeld dat de microneedle van de microbiopsy van de huid de huid ongeveer 500 µm diep7 doordringt. Het ontwerp van de microneedle van microbiopsy van de huid is zeer vergelijkbaar met degene op absorberend microbiopsy (Figuur 2a). Terwijl de absorberende microbiopsy bestond uit een absorberende laag in het midden voor de absorptie van het bloed, bevatte de huid microbiopsy een kanaal voor mechanische vastleggen van de huid weefsels. Het gebruik van absorberende laag ook geleid tot een klein verschil in de microneedle dimensie (absorberend: 1,50 x 0,50 x 0.21 mm vs huid: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).

Figuur 2b toont de toepassing sites 5 min na absorberend en microbiopsies van de huid op de linkerarm volar van mannelijke vrijwilliger van toepassing waren. Vanwege de gelijkenis tussen de twee microneedle ontwerpen waren de sites van de toepassing van beide apparaten vergelijkbaar, met kleine erytheem. Beide sites van toepassing waren niet merkbaar na 48u met links geen littekens achter. Dit ondersteunt de hypothese dat dit minimaal invasieve apparaat heeft het potentieel om te helpen meerdere sites van de toepassing van het scherm of op een regelmatige basis moeten worden uitgevoerd.

Figuur 2 c geeft een representatief beeld van de absorberende laag van de absorberende microbiopsy na wordt toegepast op de volar arm van een mannelijke vrijwilliger. Zoals in de afbeelding, een paar kleine stukjes van de huid, nabij de monding van de microneedle werden gevangen genomen en wat bloed werd opgenomen in het koffiefilter. Dit betekent dat het apparaat de huid doorgedrongen en zowel huid en bloed gelijktijdig binnen dezelfde absorberende microbiopsy matrix veroverde. Figuur 2d toont een na bemonstering huid microbiopsy, de vorige generatie van microbiopsy, voor de vergelijking. Het kanaal van de huid microbiopsy gevangen een klein stukje van de huid, maar de hoeveelheid bloed op de microneedle was klein ten opzichte van de absorberende microbiopsy. Beide sites van toepassing waren niet merkbaar binnen 48u. In het experiment, de absorberende microbiopsy is toegepast met een 10-s bedrijf tijd na toepassing, terwijl de huid microbiopsy werd onmiddellijk vrijgegeven na het toepassen van vanwege het verschil in ontwerp.

Zoals blijkt uit Figuur 3a, twee groepen van absorberende microbiopsy betrokken waren bij dit experiment op basis van het toepassingsprotocol: 'Onmiddellijke vrijlating' en ' 10-s bedrijf '. Voor de 'Onmiddellijke vrijlating' groep, werd het apparaat toegepast met behulp van hetzelfde oorspronkelijke huid microbiopsy protocol, met het apparaat wordt verwijderd van de site van de toepassing onmiddellijk na de toepassing. Voor het bedrijf ' 10-s' groep, het apparaat was op zijn plaats gehouden na de toepassing voor 10 s ter verbetering van de sample collectie. De twee groepen van absorberende microbiopsy waren ingesteld om aan te tonen hoe de aanpak van de toepassing van invloed kan zijn op het bedrag van de steekproef. De 10-s bedrijf tijd werd gekozen als een klinisch redelijke termijn om aan te tonen dat de toepassing tijd het bedrag van de terugvorderbare monster beïnvloedt.

Het bedrag van RNA hersteld van de twee groepen van de absorberende microbiopsy 0.33 ± 0.39 ng 'Onmiddellijke vrijlating' en 1.43 ± 0.88 ng waren voor ' 10-s bedrijf ' (Figuur 3a, n = 20), hetgeen wijst op een verhoging van de 4-fold met de extra bedrijf-tijd. Hiermee wordt aangegeven dat toepassing van het absorberend apparaat met de 10-s bedrijf tijd geleid tot meer RNA gehaald. Het verschil kan worden veroorzaakt door de aanwezigheid van verhoogde bloedmonster in de absorberende laag (Figuur 3 c). Inderdaad, de 'Onmiddellijke vrijlating' groep (Figuur 3b) mislukt voor het verzamelen van een soortgelijke hoeveelheid bloed met de absorberende laag in vergelijking met het bedrijf ' 10-s' groep (Figuur 3 c). Ook opgemerkt moet worden dat de meest onmiddellijk vrijgegeven microbiopsies dicht bij de x-as waren, suggereren ze waren van negatieve gebeurtenissen of een zeer lage hoeveelheid RNA weergegeven. Daarom is het resultaat gevalideerd de hypothese dat het bedrijf tijd zou een impact op de prestaties van het apparaat hebben als het kan duren voor het bloed worden opgevangen door de absorberende laag.

Aangezien het apparaat is ontworpen voor bloed en huid bemonstering, werd qPCR gebruikt voor het detecteren van de uitdrukking van de huid en het bloed biomarkers voor beide apparaten voor vergelijking. We gebruikten tyrosinase, TYR, als een biomarker voor melanocyten en KRT14 als een biomarker voor keratinocyten in de levensvatbare epidermis. Huid microbiopsy monsters werden opgenomen in het experiment voor vergelijking. Zoals afgebeeld in Figuur 4, hoewel huid en absorberende microbiopsies verschillend vanwege het verschil in ontwerp toegepast waren, de expressie niveaus voor zowel huid biomarkers TYR en KRT14 waren vergelijkbaar zijn voor beide apparaten zoals aangegeven door de gegevens. White blood cell biomarkers (CD3E, T-cellen en CD19, B-cellen) bleken vaker in absorberende microbiopsy monsters dan in huid microbiopsy monsters. Dit resultaat stelt dat de absorberende microbiopsy beter gepresteerd in de bloedinzameling, maar nog steeds de capaciteit onderhouden voor het vastleggen van de huid in vergelijking met de microbiopsy van de huid (n = 5).

figure-results-1
Figuur 1. De fabricage van absorberende microbiopsy. (a) de drie lagen microneedle. (b) alle onderdelen van het apparaat. (c) de geassembleerde absorberende microbiopsy. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2. De absorberende microbiopsy was in staat om vast te leggen van de huid en het bloed monsters tegelijk zonder een litteken op de linkerarm volar van mannelijke vrijwilliger. (a) een vergelijking tussen de microneedles van absorberend en huid microbiopsies. (b) toepassing sites links door absorberend en huid microbiopsies 5 min na toepassing. (c, d) Microneedles van absorberend en huid microbiopsies na toepassing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3. De absorberende microbiopsy veroverden meer bloed en RNA monster wanneer toegepast voor 10-s. (a) de tijd 10-s post application bedrijf resulteerde in een grotere hoeveelheid RNA dan onmiddellijk het vrijgeven van het apparaat (n = 20). Foutbalken S.D. vertegenwoordigen ten opzichte van de gemiddelde (***p< 0.0001). (b, c) Representatieve foto's van de absorberende microbiopsies na toepassing met 'Onmiddellijke vrijlating' en ' 10-s bedrijf ' benaderingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4. De vergelijking van mRNA niveaus van de expressie tussen huid en absorberende microbiopsies (n = 5). De genexpressie met referentie gen RPLP0had zijn genormaliseerd. Foutbalken S.D. vertegenwoordigen ten opzichte van de gemiddelde (*p< 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze resultaten tonen aan dat de absorberende microbiopsy kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor eenvoudige en minimaal invasieve bemonstering van huid en bloed mengsel voor moleculaire karakterisering. Device-toepassing overeenkomstig onze protocol is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten zoals aangegeven door het verschil in RNA bedrag teruggevorderd met verschillende toepassingsprotocollen (Figuur 3). Zodra het monster wordt geëxtraheerd, is het latere monster verwerking stap voor RNA extractie zeer vergelijkbaar met gevestigde protocollen15,16. Bovendien van de eerste stappen in RNA extractie die zijn aangepast voor de absorberende microbiopsy, is een andere belangrijke wijziging het gebruik van RNase-gratis water ter verbetering van de resultaten voor downstream toepassingen. Bovendien is het vermeldenswaard dat het gen van de verwijzing in deze studie gebruikt RPLP0. RPLP0, waarvan de functie goed-gekend voor verschillende cellen en weefsel typen17 is, werd gerapporteerd als een geschikte referentiemiddelen gen voor gebruik in niet-melanoom huidkanker en voorstadia laesies18.

Een van de belangrijkste beperkingen van het apparaat is de verwijdering van de microbiopsy van het apparaat, dat is tijdrovend en potentieel verhoogt de kans op verlies van de steekproef, vooral voor gevoelige monsters zoals RNA. Echter kan het probleem worden verholpen door het vooraf koeling alle steriele processing tools, zoals de 2 mL microcentrifuge buizen, op droog ijs.

Het gebruik van de absorberende microbiopsy is eenvoudig en vereist geen intensieve training. Conventionele biopsie is niet nodig als microbiopsy moleculaire karakterisering met gevestigde moleculaire diagnostiek technieken, zoals RT-qPCR toelaat. Om verder te kwantificeren en de bemonstering aantonen van absorberende microbiopsy, was vorige literatuur die RNA extractie van menselijke huidweefsel onderzocht. Punch van een typische 3.0 of 4.0 mm huid biopsie, drie studies hebben gemeld de uitgepakte RNA bedragen varieerden van 50 tot 200 ng per mg huid weefsel19,20,21. Vergelijken met de 1,43 ng van RNA die was hersteld van de absorberende microbiopsy gemiddeld (Figuur 3), het gewicht van de bemonsterde huid weefsels naar bereik verwachting van 0,29-115 µg op basis van de dezelfde verhouding van het RNA-naar-weefsel van huid punch biopsie studies.

Dit protocol is niet zonder potentiële valkuilen, hoewel sommige van de problemen kan gemakkelijk worden overwonnen. Bijvoorbeeld, voorgesteld de RNA extractie gegevens een aanzienlijke variatie zelfs met de 10-s bedrijf tijd (Figuur 3). Om het probleem, omvat één mogelijke oplossing het optimaliseren van het toepassingsprotocol. Parameters zoals kracht toegepast op de huid en houden tijd moet worden getest en geoptimaliseerd voor het verminderen van de variaties in de extractie van het monster. De andere potentieel probleem is het verwijderen van microbiopsy van het apparaat, dat kan van invloed zijn de integriteit van de steekproef en het herstel. Hoewel het verwijderen van de microbiopsy voor RNA extractie een effectieve aanpak is, de gehele procedure is vervelend en het monster kan worden blootgesteld aan vervuiling in het proces. De wijziging van het protocol van de processing monster is daarom zeer gewenst om de integriteit van het monster en monster verlies te voorkomen.

Zodra de bovengenoemde twee kwesties worden aangepakt, wordt verwacht dat het apparaat een standaardhulpmiddel voor klinisch onderzoek zullen worden. Het is belangrijk op te merken dat het apparaat gelijktijdig zowel huid en bloed monster vangt en dit moet rekening worden gehouden bij het analyseren van gen expressie gegevens. Kortom, beschrijft dit protocol de details van de absorberende microbiopsy uitvoeren als een eenvoudig en minimaal invasieve hulpmiddel voor gecombineerde huid en bloedmonsters en het daaropvolgende monster verwerking voor relatieve gen expressie profilering.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen erkennen NHMRC Fellowships APP1109749 en APP1111216, Universiteit van Queensland Centennial beurs en internationaal postdoctoraal onderzoek beurs.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absorberende microbiopsie fabricage en bemonstering
Absorberende MicrobiopsieTrajan Scientific and MedicalN/Ahttps://www.trajanscimed.com/
Whatman filterpapier, Grade 1Sigma AldrichWHA1001325N/A
RNA extractie
PicoPure RNA Isolation KitThermoFisherKIT0214Inclusief alle bufferoplossingen zoals beschreven in het protocol
UltraPure DNase/RNase-Free Gedestilleerde WaterThermoFisher10977015Verbetering van RNA kwaliteit in RNA elutie stap
2.0 mL Microcentrifugebuis, sterieleThomas Scientific1226S74N/A
Microcentrifuge 5415REppendorfZ605212N/A
cDNA synthese
SensiFAST cDNA Synthesis KitBiolineBIO-65053N/A
CFX96 Touch Real-Time PCR Detectie SysteemBio-Rad1855196N/A
qPCR reactie en data-analyse
SensiFAST SYBR Lo-ROX KitBiolineBIO-94005Inclusief reagentia zoals beschreven in qPCR reactiestappen
MicroAmp Optische Adhesief FilmThermoFisher Scientific4311971N/A
MicroAmp Optische 384-Well ReactieplaatThermoFisher Scientific4343370N/A
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SysteemThermoFisher Scientific4485694N/A
GraphPad Prism (v6.04)GraphPadN/A; Windows versiePlotting en statistische analyse in qPCR data-analyse stappen
PCR primers
RPLP0 FSigma AldrichN/AATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 RSigma AldrichN/ACAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR FSigma AldrichN/ATCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
TYR RSigma AldrichN/AAAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 FSigma AldrichN/ACCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 RSigma AldrichN/AACA CCA CCT TGC CAT CG
CD3E FSigma AldrichN/ACAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E RSigma AldrichN/AGTT CTC CAG AGG GTC AGA TG
CD19 FSigma AldrichN/ATTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 RSigma AldrichN/AGCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
  2. Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
  3. Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
  4. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
  5. Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
  6. Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
  7. Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
  8. Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
  9. Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334(2017).
  10. Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107(2013).
  11. GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  13. Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
  14. GraphPad Statistics Guide. , (1995).
  15. Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
  16. Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
  17. Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
  18. Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631(2017).
  19. Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
  20. Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438(2011).
  21. Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Minimaal invasieve bemonsteringbloed huidanalyseRT qPCRmicronaaldapparaathuidbiomarkersgenexpressieprofileringcentrifugebuiszuiveringskolom

Gerelateerde artikelen