Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hoge frequentie echografie voor de analyse van de ontwikkeling van de foetus en placenta In Vivo

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58616

⸱

8 november 2018

 ,  , 
1Experimental Obstetrics and Gynecology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University, 2Institute of Molecular and Clinical Immunology, Medical Faculty, Otto-von-Guericke University

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de techniek van de hoge frequentie echografie voor in vivo analyse van foetussen in muizen. Met deze methode kunt de opvolging van foetussen en de analyse van de placenta parameters evenals moederlijk en foetaal bloedstroom in de gehele zwangerschap.

Samenvatting

Echografie imaging is een wijdverbreide methode gebruikt voor het opsporen van afwijkingen van het orgel en tumoren in menselijke en dierlijke weefsels. De methode is niet-invasief, onschuldig en pijnloos, en de toepassing is eenvoudig, snel en overal, zelfs met mobiele apparaten kan worden gedaan. Tijdens de zwangerschap, wordt de echografie beeldvorming bij gebruikt om nauwlettend op foetale ontwikkeling. De techniek is belangrijk om te evalueren van de uteriene groei beperking (IUGR), een complicatie van de zwangerschap met korte - en lange termijn gevolgen voor de gezondheid voor zowel de moeder als de foetus. Inzicht in het proces van IUGR is onontbeerlijk voor de ontwikkeling van effectieve therapeutische strategieën.

Het systeem van de echografie gebruikt in dit manuscript is een ultrasoon apparaat geproduceerd voor de analyse van kleine dieren en kan worden gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, met inbegrip van onderzoek van de zwangerschap. Hier beschrijven we het gebruik van het systeem voor in-vivo analyse van foetussen van natural killer (NK) cellen/mestcel (MC)-deficiënte moeders die bevallen van groei-beperkte pups. Het protocol bevat voorbereiding van het systeem, behandeling van de muizen vóór en tijdens de metingen en het gebruik van de B-modus, kleur doppler modus en pulse-Golf doppler. De grootte van de foetale placenta grootte en bloedtoevoer naar de foetus werden geanalyseerd. We vonden verminderde implantatie maten en kleinere placentas in NK/MC-deficiënte muizen van middellange dracht vanaf. Bovendien, MC/NK-deficiency werd geassocieerd met afwezig en omgekeerd einde diastolische flow in de foetale Arteria umbilicalis(UmA) en een verhoogde weerstand-index. De methoden die worden beschreven in het protocol kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor verwante en niet-gerelateerd onderzoeksonderwerpen.

Inleiding

Echografie is correcte golven met frequenties boven het hoorbare bereik van het menselijk oor, hoger is dan ongeveer 20 kHz1. Dieren zoals vleermuizen, wales, dolfijnen2,3,4van de muizen, ratten5en mouse lemurs6 alle gebruiken echografie voor oriëntatie of communicatie. Mensen profiteren van echografie voor verschillende technische en medische toepassingen. Een ultrasoon apparaat is in staat te maken van de geluidsgolf en distribueren en vertegenwoordigen het signaal. Als echografie obstakel aangetroffen, het geluid wordt weerspiegeld, wordt geabsorbeerd of doorheen kan gaan. De toepassing van echografie een beeldvorming methode, echografie, genaamd wordt gebruikt voor de analyse van biologische weefsels in mens- of diergeneeskunde als het hart (echocardiografie)7,8, Long9, schildklier10 , nieren11en13van de12,van urine en reproductieve traktaten; opsporen van galstenen14 en tumoren15; en de evaluatie van de perfusie van bloedvaten of organen16,17. Echografie is een standaardmethode in prenatale zorg tijdens de zwangerschap en foetaal ontwikkelingsstoornissen of bijzondere waardeverminderingen kunnen vroeg worden herkend. In het bijzonder wordt de groei van een foetus strikt toegezien op gezette tijden te erkennen van een mogelijke IUGR. Ten slotte, foetaal bloedstroom kan worden gecontroleerd, omdat dit op groei beperkingen18,19,20,21 wijzen kan.

Een groot voordeel voor echografie imaging in vergelijking met andere methoden zoals radiografie is het geluid de onschadelijkheid van de weefsels te analyseren. Deze makkelijke en snelle methode is niet-invasief, pijnloos, en kan een aantal keren gebruikt. De eerste uitgave van een ultrasoon apparaat is duur; echter zijn de verbruiksgoederen nodig goedkoop. Het systeem van de echografie gebruikt in dit manuscript is geschikt voor een scala van diermodellen (dat wil zeggen, muizen en vissen) terwijl voor de mens een ultrasoon apparaat een frequentie van 3-15 mHz vereist, een frequentie van 15-70 mHz vereist is voor muizen.

Het huidige manuscript wordt een protocol voor het gebruik van B-modus, doppler kleurmodus en pulse-Golf doppler beschreven. Voorbereiding van de muizen evenals de prestaties, de data acquisitie, en de opslag in de beschrijving verwijst. Deze methode met succes toegepast op verschillende muis stammen helemaal zwangerschapsduur dagen geweest en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de foetale en placenta ontwikkeling alsmede moederlijk en foetaal bloedparameters. Hier, worden alle toepassingen uitgelegd op basis van onze studies met zwangere MC/NK-deficiënte en bestrijding van muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

1. experimentele Procedure

  1. Mate van 6 tot 8 weken oude vrouwelijke MC-deficiënte C57BL/6J-Cpa3Cre /+ (Cpa3Cre /+) muizen en MC-voldoende C57BL/6J-Cpa3+/+ (kolonie controles; Cpa3+/+) met BALB/c mannetjes.
  2. De dag van de dracht (gd) 0 na bevestiging van de vaginale stekker definiëren en behandelen van de vrouwtjes direct na bevestiging van de plug.
    Opmerking: Een stekker is het sperma van de man in de vaginale opening van het vrouwtje.
    1. Injecteren van 250 µL van PBS intraperitoneally in controle Cpa3+/+ vrouwtjes.
    2. Injecteren van 250 µL van anti-CD122 (0,25 mg) intraperitoneally in MC-deficiënte Cpa3Cre /+ vrouwtjes.
      Opmerking: Een injectie van 0,25 mg van anti-CD122 put perifere NKs en uNKs in MC-deficiënte Cpa3Cre /+ vrouwtjes zoals eerder beschreven22.
  3. Wachten tot gd5.
    Opmerking: Op gd5 is er de vroegste mogelijkheid voor implantatie analyse.
    1. Ga verder met stap 2-5 voor de analyse van de echografie.
  4. Uitvoeren van de echografie beeldvorming op gd5, 8, 10, 12 en 14.

2. voorbereiding van de Ultrasound System

  1. Inschakelen van het systeem (figuur 1A; hoofdkrachtbron op de rug en de computer stand-by op de linker site), het verwarmde platform (figuur 1B; aan de control pad), en de gel warmer (Figuur 1 c).
    Opmerking: Echografie gel moet warm gedurende ongeveer 0.5 h.
  2. Zorgen dat de eenheid van Isofluraan is voldoende het invullen (Figuur 1 d).
  3. Open een Nieuwe studie of een Nieuwe reeks in een bestaande studie in de browser. Vul alle vereiste informatie (eigenaar, de naam van de studie, reeksnaam, dierlijke gegevens) in het Studie Info -venster. Klik op Ok.
  4. Na het klikken op Ok, zorgen dat het B-modus imaging venster verschijnt en de beeldvorming in B-modus automatisch begint.

3. muis hanteren

  1. Afstomping van de muis
    1. Plaatst u de muisaanwijzer in het knockdown vak (figuur 1E), sluit het openen van de Isofluraan buis naar het knockdown vak en inschakelen van de Isofluraan (concentratie 3,5%).
    2. Wanneer de muis is narcose, lagere (tot concentratie 1,5%) en de stroom van Isofluraan omleiden door het openen van de buis in de richting van het platform van de verwarming en sluit de stroom naar het knockdown vak.
      Opmerking: Om te bereiken voldoende verdoving, wacht een extra 10 s nadat de muis niet meer bewegen is.
    3. De muis van het knock-out vak snel overbrengen naar de verwarming platform (figuur 1F) in een dorsale positie en zachtjes haar neus in de anesthesie neus buis gelegen op de top van het platform plaats.
  2. Fixatie, ontharing en voorbereiding van de muis voor het meten van
    1. Plaats oogbescherming crème in elk van beide ogen van de muis om te voorkomen dat droge ogen.
    2. Breng een druppel van elektrode gel op elk van de vier koperen gebieden op het verwarmde platform (figuur 1F).
    3. Tik op de poten met chirurgische tape op de elektrode gel beklede gebieden van het platform van de verwarming.
    4. ECG controleren [optimale waarde = 450-550 slagen/min (BPM)] en respiratoire fysiologie te allen tijde.
      Opmerking: Met behulp van een rectale sonde, lichaamstemperatuurmeting is mogelijk, maar niet noodzakelijk.
    5. Plaats ontharende room op de buik van de muis, wrijven de crème met een wattenstaafje en wacht ongeveer 1 min. verwijderen de crème met een water gedrenkte kompres. Herhaal deze stap als niet alle haren verdwenen zijn.
    6. Breng de voorverwarmde ultrageluid-gel op de depilated huid.

4. metingen en verwerving van afbeeldingen en video 's

  1. Houd de transducer (figuur 1G) in de hand of klem in het bedrijf-apparaat (Figuur 1 H; bedrijf apparaat wordt aanbevolen).
  2. Identificeren van de blaas met de transducer en gebruik het als referentiepunt. De transducer verplaatsen naar de sites van de links en rechts van de buik te traceren implantaties.
  3. B-modus voor visualisatie van anatomische structuren in 2D grijswaardenafbeelding
    1. Verplaats de transducer of verwarming platform tabel waar de muis totdat de eerste implantatie zichtbaar op het scherm op zijn grootste omvang is gefixeerd is.
      1. Selecteer Afbeelding Label en geef een naam, of Frame Store (opslag zonder naam) voor het opslaan van enkele frames of Cine winkel voor het opslaan van een cineloop voor hele implantatie metingen.
    2. Beweeg de transducer of de tabel om de placenta naar een positie waar de bloedstroom in het UmA zichtbaar is. Opslaan van een enkel frame of cineloop (zie stap 4.3.1.1) voor placenta metingen.
      Opmerking: De placenta metingen zijn mogelijk vanaf gd10 vanaf.
    3. Ga verder met alle implantaties gebruikend de zelfde methode.
  4. Doppler kleurenmodus te visualiseren en te bepalen van de richting van de bloedstroom
    1. Druk op de knop van de kleur .
    2. Verplaatsen van het vak Kleur (in dit gebied, het signaal is zichtbaar) naar de gewenste positie met behulp van de trackball. Indien nodig, wijzigen van de grootte van het vak door op Update te drukken en bewegen van de trackball (aan de rechterkant/opwaartse = groter; aan de linker kant/neerwaartse = kleiner). Wanneer de doos de juiste grootte heeft, drukt u op selecteren.
    3. Bewaar één frames of cineloops zoals beschreven in stap 4.3.1.1.
  5. Puls-Golf (PW) doppler modus te kwantificeren van de bloedstroom door de schepen in de Arteria uterina (baarmoeder slagader, UA) en UmA
    1. Ga naar de regio van belang in de doppler verwerving van kleur.
      Opmerking: De UA ligt caudal naar de blaas en de UmA is gelegen tussen de foetus en de placenta.
    2. Druk op PWen een stippellijn wordt weergegeven. Deze regel naar het bloedvat van belang en aanpassen van de hoek van de lijn met behulp van de knop "Doppler hoek" in overeenstemming met de bloedstroom. Druk Updateop.
      Opmerking: De hoek tussen de richting van de bloedstroom en de transducer moet consequent alle dieren, met name bij het gebruik van de hoeken van meer dan 60° (hier, 70° voor UAs en 45° voor UmAs werden gebruikt).
    3. Een cineloop van de opkomende doppler lijnen in de PW doppler overname venster opslaan.

5. herziening en afwerking van de Data-acquisitie en opslaan van een reeks

  1. Om de gegevens te bekijken, drukt u op studie Management. Ga naar de miniatuur van belang en dubbelklik op Update.
  2. Druk op eerste Studie Management vervolgens dicht in het browservenster te voltooien van data-acquisitie en een opgenomen serie opslaan.
    Opmerking: Na het sluiten van een reeks, het is niet mogelijk om op te slaan meer frames of cineloops in deze serie.

6. muis hanteren na overname van Data

  1. Verwijder de gel uit het verdoofde dier met behulp van droge kompressen.
  2. Verwijder de chirurgische tape zorgvuldig van de poten.
  3. Sluit de Isofluraan buis (concentratie 0%).
  4. Ga verder met de volgende echografie analyse op gd5, 8, 10 en 12.
    1. Plaats het dier alleen in een kooi voor een minimum van 5 min, dus het is tijd om wakker en oriënteren.
    2. Plaats de muis terug in de oorspronkelijke kooi.
      Opmerking: Zet niet uit de Isofluraan voordat het verwijderen van de gel en chirurgische tape, zoals muizen wakker zeer snel (ongeveer 20 s) na het uitzetten van de Isofluraan.
  5. Ga verder met de volgende analyse van echografie bij gd14.
    1. Offeren het vrouwtje voordat het wakker door cervicale dislocatie. Openen van het dier, verwijderen van de baarmoeder, de foetussen en placentas scheiden en foetale en placenta gewichten meten.

7. kopiëren en importeren van de gegevens

  1. Een of meer reeksen markeren door te klikken op Exporteren naar en kies de opslagruimte om gegevens op een harde schijf te kopiëren.
  2. Open de software op een computer, klik op Kopiëren van en selecteert u de studie/series van de vaste schijf naar een studie/serie in de software importeren.
  3. Het analyseren van de gegevens met de software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Afzonderlijke onderdelen van het systeem van de echografie gebruikt in dit manuscript worden weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 toont vertegenwoordiger echografie beelden verworven in de B-modus op gd5, 8, 10 en 12 (B) en bijbehorende implantatie gebied meting resultaten (A), aan te tonen een significant verlaagde implantatie gebied van anti-CD122-behandeld Cpa3Cre / + muizen van gd10 v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Via ons systeem van echografie, we aangetoond foetale groei beperking in MC/NK-deficiënte moeders van gd10. Bovendien, gd10 en 12, we waargenomen verminderde placenta dimensies, en op gd14 de afwezigheid of de terugkeer van de diastolische flow einde in de UmAs van sommige foetussen van uMC/uNK-deficiënte muizen. Dit teken van arme vascularisatie werd geassocieerd met een index van de grote weerstand van de slagaders die aangeeft van IUGR. Resultaten bevestigen de belangrijke rol van uMCs en uNKs in de zwangerschap en fo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Veel dank aan het bedrijf van de Imaging Instrument (vooral voor Magdalena Steiner, Katrin Suppelt en Sandra Meyer) voor hun aangename en snelle ondersteuning en voor het beantwoorden van al onze vragen betreffende de Imaging System en het gebruik ervan onmiddellijk en volledig. Wij zijn dankbaar aan Prof. Hans-Reimer Rodewald en Dr. Thorsten Feyerabend (DKFZ Heidelberg, Duitsland) voor het verstrekken van de Cpa3 kolonie. Bovendien, danken wij Stefanie Langwisch, die was belast met de muis kolonies en die gegenereerd van de afbeeldingen in figuur 1.

Het werk en het Imaging systeem werden gefinancierd door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) aan A.C.Z. (ZE526/6-1 en AZ526/6-2) die werden projecten die zijn ingebed in de DFG prioriteit programma 1394 "mestcellen in health and disease."

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb)BioLegend123204Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System FujiFilm VisualSonics Inc.Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software FujiFilm VisualSonics Inc.
IsofluraneBaxterPZN: 6497131
Elektrode gelParker12_8
Chirurgisch tape3M Transpore1527-1
OogcrèmeBayerPZN: 1578675
Wattenstaafjes met oordopRaucotupf11969100 stuks
OntharingscremeReckitt Benckiser2077626
KompressenNobamed Paul Danz AG85611010 x 10 cm
Ultrasone gelGello GmbH246000

Referenties

  1. Abramowicz, J. S., Kremkau, F. W., Merz, E. Ultraschall in der Geburtshilfe: Kann der Fötus die Ultraschallwelle hören und die Hitze spüren? Ultraschall in der Medizin. 33 (3), Stuttgart, Germany. 215-217 (1980).
  2. Jones, G. Echolocation. Current Biology. 15 (13), R484-R488 (2005).
  3. Simmons, J. A. The sonar receiver of the bat. Annals of the New York Academy of Sciences. 188, 161-174 (1971).
  4. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). Public Library of Science ONE. 12 (12), e0188647(2017).
  5. Wöhr, M., Seffer, D., Schwarting, R. K. W. Studying Socio-Affective Communication in Rats through Playback of Ultrasonic Vocalizations. Current Protocols in Neuroscience. 75, 1-8 (2016).
  6. Hasiniaina, A. F., et al. High frequency/ultrasonic communication in a critically endangered nocturnal primate, Claire's mouse lemur (Microcebus mamiratra). American Journal of Primatology. , e22866(2018).
  7. Yeo, L., Romero, R. Color and power Doppler combined with Fetal Intelligent Navigation Echocardiography (FINE) to evaluate the fetal heart. Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. 50 (4), 476-491 (2017).
  8. Teichholz, L. E. Echocardiography in valvular heart disease. Progress in Cardiovascular Diseases. 17 (4), 283-302 (1975).
  9. Zechner, P. M., et al. Lungensonographie in der Akut- und Intensivmedizin. Der Anaesthesist. 61 (7), 608-617 (2012).
  10. Blank, W., Schuler, A. Sonografie der Schilddrüse - Update 2017. Praxis. 106 (12), 631-640 (2017).
  11. Hansen, K. L., Nielsen, M. B., Ewertsen, C. Ultrasonography of the Kidney: A Pictorial Review. Diagnostics. 6 (1), Basel, Switzerland. (2015).
  12. Older, R. A., Watson, L. R. Ultrasound anatomy of the normal male reproductive tract. Journal of Clinical Ultrasound. 24 (8), 389-404 (1996).
  13. Reeves, J. J., Rantanen, N. W., Hauser, M. Transrectal real-time ultrasound scanning of the cow reproductive tract. Theriogenology. 21 (3), 485-494 (1984).
  14. Sharma, M., Somani, P., Sunkara, T. Imaging of gall bladder by endoscopic ultrasound. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 10 (1), 10-15 (2018).
  15. Weskott, H. -P. Ultraschall in der Diagnostik maligner Lymphome. Der Radiologe. 52 (4), 347-359 (2012).
  16. Shirinifard, A., Thiagarajan, S., Johnson, M. D., Calabrese, C., Sablauer, A. Measuring Absolute Blood Perfusion in Mice Using Dynamic Contrast-Enhanced Ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (8), 1628-1638 (2017).
  17. Quaia, E. Assessment of tissue perfusion by contrast-enhanced ultrasound. European Radiology. 21 (3), 604-615 (2011).
  18. Saw, S. N., Poh, Y. W., Chia, D., Biswas, A., Zaini Mattar, C. N., Yap, C. H. Characterization of the hemodynamic wall shear stresses in human umbilical vessels from normal and intrauterine growth restricted pregnancies. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2018).
  19. Kessler, J., Rasmussen, S., Godfrey, K., Hanson, M., Kiserud, T. Fetal growth restriction is associated with prioritization of umbilical blood flow to the left hepatic lobe at the expense of the right lobe. Pediatric Research. 66 (1), 113-117 (2009).
  20. Laurin, J., Lingman, G., Marsál, K., Persson, P. H. Fetal blood flow in pregnancies complicated by intrauterine growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 69 (6), 895-902 (1987).
  21. Arduini, D., Rizzo, G., Romanini, C., Mancuso, S. Fetal blood flow velocity waveforms as predictors of growth retardation. Obstetrics and Gynecology. 70 (1), 7-10 (1987).
  22. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106(2017).
  23. Meyer, N., Schüler, T., Zenclussen, A. C. Simultaneous Ablation of Uterine Natural Killer Cells and Uterine Mast Cells in Mice Leads to Poor Vascularization and Abnormal Doppler Measurements That Compromise Fetal Well-being. Frontiers in Immunology. 8, 1913(2017).
  24. Evans, D. H., Jensen, J. A., Nielsen, M. B. Ultrasonic color Doppler imaging. Interface Focus. 1 (4), 490-502 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Foetale ontwikkelingplacentaanalysein vivo beeldvormingB-mode beeldvormingColor DopplerPulse Wave Dopplerresistentie-indexnavelstrengslagadergestationele meting
Hoge frequentie echografie voor de analyse van de ontwikkeling van de foetus en placenta In Vivo
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.