Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

Samenvatting

We beschrijven hier, het protocol en de uitvoering van Methyl-Seq, een epigenomic-platform, met behulp van een rat-model om epigenetische veranderingen die zijn gekoppeld aan chronische stress blootstelling te identificeren. Resultaten tonen aan dat de rat Methyl-Seq platform is voor het opsporen van methylation van verschillen die uit stress blootstelling bij ratten voortvloeien van.

Samenvatting

Zoals genoom van een breder scala dieren beschikbaar komen, is er een toenemende behoefte aan tools die dynamische Epigenetische veranderingen in deze dierlijke modellen kunt vastleggen. De rat is een bepaald model dier waar een epigenetische instrument veel farmacologische en behavioral studies inzichtelijke mechanistische informatie te verschaffen kan aanvullen. Te dien einde aangepast we de SureSelect Target Capture System (hierna: Methyl-Seq) voor de rat, die DNA methylering niveaus over het genoom van de rat beoordelen kan. Het ontwerp van de rat gericht initiatiefnemers, CpG eilanden eiland oevers en GC-rijke regio's uit alle RefSeq genen.

Ter uitvoering van het platform op een rat-experiment, werden mannelijke Sprague-Dawley ratten blootgesteld aan chronische variabele spanning voor 3 weken, waarna de bloedmonsters werden verzameld voor genomic DNA-extractie. Methyl-Seq bibliotheken werden opgebouwd uit de rat DNA-monsters door scheren, adapter afbinding doel verrijking, Bisulfiet Omzetting en multiplex. Bibliotheken werden sequenced op een volgende-generatie sequencing-platform en de gesequenceerd leest werden geanalyseerd om te achterhalen van DMRs tussen DNA van beklemtoonde en onbeklemtoonde ratten. Top kandidaat DMRs werden onafhankelijk gevalideerd door bisulfiet pyrosequencing te bevestigen de robuustheid van het platform.

Resultaten tonen aan dat de rat Methyl-Seq-platform een nuttig epigenetische hulpmiddel dat vangen methylering veranderingen bij blootstelling is kan te benadrukken.

Inleiding

Voorschotten in high-throughput sequencing hebben geleid tot een schat aan de genomic opeenvolgingen voor zowel model als niet-modelorganismen. De beschikbaarheid van dergelijke sequenties heeft onderzoek in genetica, vergelijkende genomica en transcriptomics vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, beschikbaar genomic opeenvolgingen zijn zeer nuttig voor het uitlijnen van sequencing gegevens van ChIP-Seq experimenten die DNA op basis van zijn associatie met histone modificaties¹of bisulfiet sequencing verrijken, welke maatregelen methylation van DNA door opsporen van uracil gevormd uit Bisulfiet Omzetting van unmethylated cytosines². Echter zijn er vertragingen bij de tenuitvoerlegging van epigenomic-platforms die beschikbaar genomic sequencing gegevens in hun ontwerp als gevolg van een gebrek aan geannoteerde gegevens van soortspecifieke regulerende sequenties die invloed op de genfunctie uitoefenen kunnen opnemen.

In het bijzonder is methylation van DNA een van de meest bestudeerde epigenetische aanpassingen op DNA dat kan hefboomwerking beschikbare genomic gegevens voor het bouwen van een methylomic platform. Een voorbeeld hiervan is een array gebaseerde platform voor de menselijke methylome³, die wijd verbeid in verschillende disciplines van oncologie psychiatrie^{4,5 gebruikt is}. Soortgelijke platforms voor niet-menselijke dierlijke modellen zijn helaas schaars is, aangezien er vrijwel geen gebruikte platforms die hebben geprofiteerd van de genomic volgorde in hun oorspronkelijke ontwerp.

Een gemeenschappelijke methode voor de beoordeling van het methylomic landschap van niet-menselijke dierlijke modellen is verminderde vertegenwoordiging bisulfiet sequencing (RRBS)⁶. Deze aanpak overwint de kosten van de gehele-genoom bisulfiet sequencing waarmee, terwijl het verstrekken van een uitgebreide methylomic landschap, lagere Lees-diepte dekking als gevolg van de kosten en de beperkte functionele informatie in grote gebieden van de gen-armen van het genoom² . RRBS houdt de samenvatting van de beperking en grootte-selectie van genomic DNA te verrijken voor zeer GC-rijke reeksen zoals CpG eilanden die vaak worden gevonden in de buurt van gene initiatiefnemers en dacht dat een rol te spelen in gen verordening⁷. Terwijl de methode RRBS is gebruikt in een aantal belangrijke studies, is haar afhankelijkheid van de enzymen van de beperking niet zonder opvallende uitdagingen en beperkingen. Bijvoorbeeld, is verrijking van GC-rijke sequenties in RRBS volledig afhankelijk van de aanwezigheid van specifieke opeenvolgingen erkend door de restrictie-enzym en de daaropvolgende maat keuze door elektroforese. Dit betekent dat elke genomic gebieden die geen deze beperkingsplaatsen bevatten zijn uitgesloten tijdens de selectie van de grootte. Kruis-soorten vergelijkingen zijn ook uitdagend tenzij de dezelfde beperkingsplaatsen in de dezelfde loci onder de verschillende soorten aanwezig zijn.

Een benadering voor het overwinnen van de beperkingen van RRBS is het gebruik van een methode van de verrijking die van de gepubliceerde genomic sequentie in het ontwerp van het platform profiteert. Het arraygebaseerd menselijke platform gebruikt primer sondes ontworpen tegen specifieke CpGs voor allele-specifieke (CG vs. TG na bisulfiet omzetting) doel gloeien en primer extensie. Haar ontwerp weerspiegelt niet alleen de beschikbare menselijke genomic volgorde, maar experimenteel geverifieerd regelgevende regio's verworven van meerdere lijnen van onderzoek, zoals ENCODE en ENSEMBL⁸. Ondanks het ruime gebruik ervan in menselijke methylomic onderzoeken bestaat een soortgelijk platform niet voor model dieren. Daarnaast plaatst de indeling arraygebaseerd aanzienlijke beperking op de oppervlakte die beschikbaar is voor de plaatsing van de sonde. In de afgelopen jaren, hebben inspanningen geleverd om te combineren van de doel-specificiteit door vangen sonde ontwerp en de functie van de hoge-doorvoer van volgende-generatie sequencing geboden. Een dergelijke inspanning heeft geleid tot de sequentiebepaling gebaseerde target verrijking-systeem voor de muis-genoom (muis Methyl-Seq), die werd gebruikt als aanduiding van de hersenen-specifieke of glucocorticoide-geïnduceerde verschillen in methylering^9,10. Soortgelijke platforms voor andere model en niet-model dieren zijn nodig om epigenomic onderzoek in deze dieren.

Hier tonen we de uitvoering van dit nieuwe platform te analyseren van de methylomic op de rat. De rat heeft gediend als een belangrijke diermodel in farmacologie, metabolisme, neuroendocrinologie en gedrag. Bijvoorbeeld, is er een toenemende behoefte te begrijpen van de onderliggende mechanismen die aanleiding tot drug toxiciteit, overgewicht, stress-respons of drugsverslaving geven. Een high-throughput platform geschikt voor het vastleggen van de wijzigingen van de methylomic die zijn gekoppeld aan deze voorwaarden zou het vergroten van ons begrip van de mechanismen. Sinds het genoom van de rat ontbreekt nog steeds een aantekening voor regelgevende gebieden, we opgenomen niet-redundante initiatiefnemers, CpG eilanden, eiland oevers¹¹, en eerder aangeduid GC-rijke sequenties in de rat Methyl-Seq platform¹².

Om te beoordelen succesvol ontwerp en tenuitvoerlegging van het platform SureSelect Target verrijking (generiek Methyl-Seq genoemd) voor de rat genoom, we een rat model van chronische variabele spanning (CVS)¹³ te identificeren differentieel methylated gebruikt regio's tussen onbeklemtoonde en gestresste dieren. Onze platformontwerp, protocol en uitvoering kunnen nuttig zijn voor onderzoekers die willen een uitgebreide en onbevooroordeelde epigenetische onderzoek in te stellen op een organisme waarvan genomic volgorde is al beschikbaar, maar blijft slecht geannoteerde.

Protocol

Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren, met inbegrip van het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Johns Hopkins School of Medicine.

1. dieren

1. Verkrijgen mannelijke adolescent Sprague-Dawley ratten op 4 weken leeftijd. Huis van de dieren in polycarbonaat rat kooien in een temperatuur- en vochtigheid-gecontroleerde kamer op een 12 h licht, 12 h donker cyclus met lichte begin 0600 h. bieden de dieren met ad libitum toegang tot water.
2. Toestaan dat ratten te acclimatiseren voor 1 week ter vermindering van stress geassocieerd met vervoer. Paar-huis van de dieren (N = 16) beletsel voor isolatie stress, en beginnen bij 5 weken oud, de chronische variabele benadrukken (CVS) regime voor 3 weken.

2. chronische variabele spanning

1. De CVS-regime eenmaal in de ochtend (9 - 11u) en één keer in de namiddag (1-3 PM) beheren op onregelmatige tijden om te houden van de routine onvoorspelbaar. Overnachting milde stressoren opnemen. De CVS regime omvat: 1) 3 h in een terughoudendheid cilinder; 2) 10 min zwemmen; 3) 3 h kooi kantelen 4) 1 h traag schudden platform; en 5) 1U in de koelruimte van 4 ° C.
   Opmerking: Overnight stressoren omvatten sociale verdringing (5 per korf), sociaal isolement, vochtige bodembedekking, beperking van het voedsel, en licht aan. Een typische weekplanning van de stress-regime wordt gegeven in tabel 1.

3. endocriene Assays

1. Bepalen niveaus van corticosterone (CORT) met behulp van staart bloed (~ 50 mL) bemonsteringen verzameld op hetzelfde moment (9u) tweemaal per week gedurende het gehele experiment, voorafgaand aan CVS regime om basislijn hormoonspiegels (dag 0), eenmaal tijdens het midden van de wekelijkse CVS (dagen 4,11 en 18), na elke 7 dagen voor CVS (dagen 7 en 14), en bij de sluiting van CVS (dag 21). Het verzamelen van bloedmonsters voorafgaande aan de dagelijkse stress-regime.
   1. Één laatste stam bloedmonster gedurende euthanasie (dag 25) halen voor RIA en genomic DNA-extractie.
2. Centrifugeer alle bloedmonsters (600 x g, 4 ° C, 10 min) te scheiden van het plasma van de bloedcellen. Pipetteer uit het plasma (supernatant) en opslaan van de monsters bij-80 ° C.
3. Ontdooien en het plasma om te bepalen van CORT niveau door radioimmuunbepaling (RIA). Zorg ervoor dat de 3 week plasma CORT niveaus zijn verheven in de gestresste dieren om te controleren of de robuustheid van de stress-regime.

4. gedrag

1. Na de CVS-regime (dagen 23 – 24), beoordelen van elk dier voor angst-achtig gedrag op de verhoogde plus (EPM)¹⁴doolhof.
2. Met behulp van een videocamera, record de dieren op het apparaat EPM voor 300 s en score de tijd in het centrum doorgebracht, armen gesloten en open armen.

5. ontwerp van de Rat Methyl-Seq

1. Niet-redundante genomic coördinaten (rat Nov 2004 rn4 vergadering) voor CpG eilanden en kusten van het eiland (± 1 kb flankerende CpG eilanden), initiatiefnemers (± 1 kb van elke TSS) van elk RefSeq-gen, en andere sequenties die verkrijgbaar zijn bij de UCSC Genome Browser gebruikt, verkrijgen relevante literatuur.
   Opmerking: Voor de rat Methyl-Seq, extra sequenties van GC-rijke uit een vorige arraygebaseerd methylering platform toegevoegd¹². Voor de regio's groter zijn dan 5 kbps, werden afwisselende regio's van 500 bps bemonsterd gevolgd door 1 kbps die werden overgeslagen. Het laatste rat Methyl-Seq ontwerp bestaat uit 111 Mbps, 2,3 miljoen CpGs; en de grootte van een gemiddelde regio van 594 bps. Het richt zich op 228,800 unieke loci.
2. Een gecompileerde lijst met genomic coördinaten aangaan door een verkrijgbare doel vastleggen-ontwerpsoftware voor passende sonde ontwerp.

6. bouw van de Rat Methyl-Seq bibliotheek van Genomic DNA

Opmerking: Om te elimineren batch effecten, meerdere monsters tegelijk verwerken, en dienovereenkomstig een schaal-up van de master mixen. Uittreksel DNA met een verkrijgbare kit voor de extractie van DNA. Kolom - of neerslag-gebaseerde methoden, beide levert kwalitatief hoogwaardige genomic DNA (260/280 verhouding ~ 1.8). Gebruik van fenol gebaseerde methoden worden niet aanbevolen. Elueer of resuspendeer DNA in lage TE buffer (10 mM TE, 0.1 mM EDTA, pH 8,0).

1. Bereiding van de monsters
   Opmerking: Voor elke stap met behulp van DNA-bindende magnetische kralen, zorg ervoor dat de kralen zijn acclimated aan kamertemperatuur voor minstens 30 min en goed gemengd vóór gebruik.
   1. Schuintrekken van DNA
      1. Gebruik een Fluorimeter om double-stranded DNA beginconcentratie van elk monster. Verdun > 1 µg voor gDNA tot 50 µL met lage TE buffer (10 mM TE, 0.1 mM EDTA, pH 8,0) in lage DNA-bindende microcentrifuge buizen.
      2. Schuintrekken monsters met behulp van een isothermische ultrasoonapparaat (10% 5 intensiteit, Duty Cycle, 200 cycli per Burst, 6 cycli van 60 s, frequentie vegen, 4 ° C).
      3. Beoordeling van kwaliteit van DNA met behulp van een elektroforese gebaseerde systeem dat maatregelen van DNA grootte en hoeveelheid.
         Nota: Het bedrag van de DNA aanbevolen is 1 µg of 3 µg. Als er beperkte grondstof, het laagste bedrag dat invoer dient > 500 ng, als lagere bedragen zal schaden de kwantiteit en kwaliteit van de bibliotheken gegenereerd.
   2. Reparatie DNA eindigt.
      1. Gebruik de rat Methyl-Seq kit om te bereiden de einde-reparatie Master-Mix op ijs. 52 µL van mix toevoegen aan elk monster en broeden in een thermische cycler zonder een verwarmde deksel (20 ° C gedurende 30 minuten, 4 ° C houden).
         Einde-reparatie Master Mix (per monster):
         35.2 µL van Water
         10 µL van einde reparatie Buffer (10 x)
         1.6 µL van dNTP Mix
         1 µL van de Polymerase van DNA van T4
         2 µL van de Polymerase van DNA van Klenow
         2.2 µL van T4 Polynucleotide Kinase
      2. Zuiveren van monsters met behulp van 180 µL van DNA-bindende magnetische kralen en 400 µL van vers bereide 70% ethanol per monster. 180 µL van kralen toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet kralen, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van 70% ethanol. Verwijderen van ethanol en wassen eenmaal herhaald.
      3. Een magnetische plaat pellet kralen en verwijderen van zoveel ethanol mogelijk gebruiken. Droog in een 37 ° C heatblock gedurende 3-5 minuten totdat de kraal pellet volledig is droog. Resuspendeer in 44 µL van nuclease-gratis water en ongeveer 42 µL van bovendrijvende substantie te verzamelen.
         Stopplaats: Na afloop van de reparatie DNA, monsters kunnen worden verzegeld en opgeslagen bij-20 ° C.
   3. Adenylaat de 3' eindigt.
      1. Adenylation meester Mix op ijs bereiden. 9 µL mix toevoegen aan elk monster en broeden in een thermische cycler zonder een verwarmde deksel (37 ° C gedurende 30 minuten, 4 ° C houden).
         Adenylation Master Mix (per monster):
         5 µL van Klenow buffer
         1 µL van dATP
         3 µL van de Polymerase van DNA van Klenow
      2. Zuiveren van monsters met behulp van 90 µL van DNA-bindende magnetische kralen en 400 µL van vers bereide 70% ethanol per monster. 90 µL van kralen toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet kralen, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van 70% ethanol. Verwijderen van ethanol en wassen eenmaal herhaald.
      3. Een magnetische plaat pellet kralen en verwijderen van zoveel ethanol mogelijk gebruiken. Droog in een 37 ° C heatblock gedurende 3-5 minuten totdat de kraal pellet volledig is droog. Resuspendeer in 35 µL van nuclease-gratis water en verzamelen van ongeveer 33,5 µL van bovendrijvende substantie.
   4. De methylated adapter afbinden.
      1. Bereiden van afbinding meester Mix op ijs en 16.5 µL van mix toevoegen aan elk monster. Incubeer in een thermische cycler zonder een verwarmde deksel (20 ° C gedurende 15 minuten, 4 ° C houden).
         Afbinding Master Mix (per monster):
         2.5 µL van Water
         2.5 µL van Methyl-Seq gemethyleerd Adapter
         10 µL van T4 DNA Ligase Buffer (5 x)
         1.5 µL van T4 DNA Ligase
      2. Zuiveren van monsters met behulp van 90 µL van DNA-bindende magnetische kralen en 400 µL van vers bereide 70% ethanol per monster. 90 µL van kralen toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet kralen, verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van 70% ethanol. Verwijderen van ethanol en wassen eenmaal herhaald.
      3. Een magnetische plaat pellet kralen en verwijderen van zoveel ethanol mogelijk gebruiken. Droog in een 37 ° C heatblock gedurende 3-5 minuten totdat de kraal pellet volledig is droog. Resuspendeer in 22 µL van nuclease-gratis water en ongeveer 22 µL van bovendrijvende substantie te verzamelen. Beoordeling van kwaliteit met behulp van een bioanalyzer.
         Opmerking: Als de totale hoeveelheid DNA minder dan 500 ng, schuintrekken en proces extra DNA voordat u verdergaat met de volgende stappen is. Als de gemiddelde grootte van de DNA niet door meer dan 30 bps toeneemt, controleren om ervoor te zorgen dat de reagentia zijn nieuwe, als de polymerase van DNA van de T4, Klenow, en/of T4 ligase oude.
         Stopplaats: Na ligating gemethyleerd adapter, monsters kunnen worden verzegeld en opgeslagen bij-20 ° C.
2. Hybridisatie
   1. Overdracht van monsters naar lage DNA-bindende microcentrifuge buizen en gebruik een verwarmde vacuüm concentrator monstervolume verkleinen tot minder dan 3.4 µL. reconstrueren monsters 3.4 µL.
      Opmerking: Concentraat de monsters naar ongeveer ~ 3 µL om monsters worden verwijderd uit vacuüm concentrator voordat alle vloeistof verdampt.
   2. Hybridisatie buffer bij kamertemperatuur en Methyl-Seq blok Mix op ijs bereiden. 5.6 µL van Methyl-Seq blok Mix toevoegen aan elk monster en incubeer in thermische cycler (95 ° C gedurende 5 min, 65 ° C gedurende 2 min, houd van 65 ° C).
      Hybridisatie Buffer (per monster):
      6.63 µL van Methyl-Seq Hyb 1
      0,27 µL van Methyl-Seq Hyb 2
      2,65 µL van Methyl-Seq Hyb 3
      3,45 µL van Methyl-Seq Hyb 4
      Methyl-Seq blok Mix (per monster):
      2.5 µL van Methyl-Seq indexeren blok 1
      2.5 µL van Methyl-Seq blok 2
      0.6 µL van Methyl-Seq blok 3
   3. RNase blok Mix en de bibliotheek vangen hybridisatie mix voorbereiden. 20 µL van Capture bibliotheek hybridisatie Mix toevoegen aan elk monster en Incubeer bij 65 ° C gedurende ten minste 16 uur.
      RNase blok Mix (per monster):
      0,5 µL van RNase blok
      1.5 µL van Water
      Vangen bibliotheek hybridisatie Mix (per monster):
      13 µL van hybridisatie Buffer
      2 µL van RNase blok Mix
      5 µL van Rat Methyl-Seq vangen bibliotheek
      Opmerking: reacties bij 65 ° C te houden bij het toevoegen van hybridisatie Mix om te voorkomen dat niet-specifieke binding.
   4. Aliquot 50 µL van de magnetische kralen daar per monster af in een nieuwe 8-well strip-buis. Wassen kralen met 200 µL van Methyl-Seq bindend Buffer. Magnetische plaat gebruiken pellet kralen en verwijder de bovendrijvende vloeistof tussen elke wassen voor een totaal van 3 wasbeurten. Na de definitieve wash, resuspendeer daar kralen in 200 µL van Methyl-Seq bindend Buffer.
   5. Toevoegen van monsters aan 200 µL van gewassen daar magnetische kralen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. met behulp van een roterende mixer. Tijdens het mixen, aliquoot 200 µL van Methyl-Seq Wash Buffer 2 in drievoudige wells van een 96-wells-plaat per monster en breng dit in een thermische cycler om vooraf warm tot 65 ° C.
   6. Na incubatie, pellet daar magnetische kralen met behulp van magnetische plaat en resuspendeer de kralen in 200 µL Methyl-Seq Wash Buffer 1. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Een magnetische plaat gebruiken pellet en weggeworpen.
   7. Wassen kralen 3 keer met Methyl-Seq wassen Buffer 2: resuspendeer de pellet kraal in 200 µL van wassen Buffer 2 (vooraf opgewarmd in stap 6.2.5.), incubeer kralen in thermische cycler (65 ° C, 10 min) en pellet kralen. Na elke wasbeurt met behulp van een magnetische plaat wordt weggeworpen.
      Opmerking: Handhaven hybridisatie reacties bij 65 ° C bij het toevoegen van Wash Buffer 2 om te voorkomen dat niet-specifieke binding.
   8. Voeg 20 µL van Methyl-Seq elutie Buffer om de gewassen kralen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten gebruik een magnetische plaat pellet kralen en overdracht supernatant aan een nieuwe strip-buis. Gooi de kralen.
      Opmerking: Tijdens het broeden, bereiden Bisulfiet Omzetting reagens.
3. Bisulfiet Omzetting
   Opmerking: Voeren Bisulfiet Omzetting van de eluted ssDNA met passende reagentia en de instructies van een ombouwkit verkrijgbare bisulfiet uit.
   1. 130 µL bereid Bisulfiet Omzetting reagens aan supernatant toevoegen uit de vorige stap. Verdeel elk van de 150 µL reacties even in twee putten. Incubeer in een thermische cycler (64 ° C gedurende 2,5 uur, houden van de 4 ° C).
      Opmerking: De reactie van 150 µL is verdeeld in twee aparte putten om homogene temperatuur. Na incubatie gedurende 2,5 uur, onmiddellijk overgaan tot de volgende stap.
   2. Binden monsters te draaien kolommen door het toevoegen van 600 µL van bindende Buffer en een keer wassen met 100 µL was Buffer. Centrifugeer kolommen (15.000 x g, 1 min) tussen alle Bisulfiet Omzetting stappen en stroom door negeren.
   3. Desulphonate monsters door 200 µL van Desulphonation Buffer toe te voegen aan kolommen. Incubeer bij kamertemperatuur voor 15-20 min. Repeat centrifugeren en stroom door negeren.
   4. Wassen kolommen tweemaal met 200 µL van wassen Buffer. Elueer elk monster door 10 µL van elutie Buffer toe te voegen aan de kolom, incubatie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, en centrifugeren (15.000 x g, 1 min). Herhaal elutie stap voor een totaal van 20 µL.
   5. PCR reactie Master Mix 1 op ijs bereiden. 82 µL van mix toevoegen aan elk monster. Incubeer in een thermische cycler met het volgende programma.
      PCR reactie Master Mix 1 (per monster):
      30 µL van Water
      50 µL van Methyl-Seq PCR Master Mix
      1 µL van Methyl-Seq PCR1 Primer F
      1 µL van Methyl-Seq PCR1 Primer R
      Thermische Cycler programma:
      Fase 1, 1 cyclus: 95 ° C 2 min
      2e etappe 8 cycli: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
      3e etappe 1 cyclus: 72 ° C 7 min
      4e etappe 1 cyclus: 4 ° C houden
   6. Zuiveren van monsters met behulp van 180 µL van DNA-bindende magnetische kralen en 400 µL van vers bereide 70% ethanol per monster. 180 µL van kralen toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet kralen, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van 70% ethanol. Verwijderen van ethanol en wassen eenmaal herhaald.
   7. Een magnetische plaat pellet kralen en verwijderen van zoveel ethanol mogelijk gebruiken. Droog in een 37 ° C heatblock gedurende 3-5 minuten totdat de kraal pellet volledig is droog. Resuspendeer in 21 µL van nuclease-gratis water en ongeveer 19,5 µL van bovendrijvende substantie te verzamelen.
4. Indexeren
   1. PCR reactie Master Mix 2 op ijs bereiden. Voeg 25,5 µL Master Mix 2 aan elk monster. Voeg 5 µL commerciële indexeren inleidingen aan afzonderlijke monsters en broeden in een thermische cycler.
      PCR reactie Master Mix 2 (per monster):
      25 µL methyl-Seq PCR Master Mix
      0,5 µL methyl-Seq gemeenschappelijk Indexing Primer
      Thermische Cycler programma:
      Fase 1, 1 cyclus: 95 ° C 2 min
      Fase 2, 6 cycli: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s
      3e etappe 1 cyclus: 72 ° C 7 min
      4e etappe 1 cyclus: 4 ° C houden
      Opmerking: Extra cycli (2-3) kunnen nodig zijn als de startende DNA-concentratie lager dan de aanbevolen waarden is zijn.
   2. Zuiveren van monsters met behulp van 90 µL van DNA-bindende magnetische kralen en 400 µL van vers bereide 70% ethanol per monster. 90 µL van kralen toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pellet kralen, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL van 70% ethanol. Verwijderen van ethanol en wassen eenmaal herhaald.
   3. Een magnetische plaat pellet kralen en verwijderen van zoveel ethanol mogelijk gebruiken. Droog in een 37 ° C heatblock gedurende 3-5 minuten totdat de kraal pellet volledig is droog. Resuspendeer in 24 µL van nuclease-gratis water en ongeveer 24 µL van bovendrijvende substantie te verzamelen.
   4. Beoordeling van de concentratie en bp grootte met behulp van de hoog-gevoeligheids DNA detectie reagentia op een bioanalyzer.
      Opmerking: Indien de bioanalyzer niet detecteren van de aanwezigheid van de bibliotheek DNA, herhaal de stappen van de voorbereiding met extra DNA.
      Stopplaats: na zuivering, geïndexeerde monsters kunnen worden verzegeld en opgeslagen bij-20 ° C.
   5. Bundeling van monsters voor de juiste volgorde van de volgende-generatie-platform gebruikt.
      1. Met behulp van de gegevens van de concentratie van de bioanalyzer, die bepalend is voor DNA-molarity op basis van de grootte van de bibliotheek en de hoeveelheid in een bepaald volume, Verdun met lage TE buffer (6.1.1.1) en combineren alle monsters een eindconcentratie van 15 pM.
         Opmerking: Een meer gevoelige methode voor de kwantificering van de bibliotheek is door kwantitatieve PCR in real time gebruikend inleidingen die gericht zijn op de ligaturen adapters.
      2. Samengevoegde monsters worden uitgevoerd op het aantal rijstroken die voldoende voor 4 monsters per rijstrook op een volgende-generatie-sequencer zijn.
         Opmerking: bijvoorbeeld als 16 bibliotheek monsters zijn uniek geïndexeerd en gecombineerd, voert u de bibliotheken meer dan 4 rijstroken, gelijk aan 4 monsters per rijstrook.

7. sequencing op een volgende-generatie-Sequencer

1. Stuur de monsters naar de kern van de institutionele sequencing voor clustering van de bibliotheek van Methyl-Seq, gevolgd door sequentiebepaling op een volgende-generatie sequencing machine.

8. analyse om te identificeren DMRs

1. Bismark (Altmark)¹⁵, die zich Bowtie 2.0 als een interne opeenvolging aligner^16,17, beroept als u wilt uitlijnen rauwe invoer leest aan bisulfiet-geconverteerd, plus-strand genoom te implementeren. Gebruik de Bismark_methylation_extractor uit te voeren van kwaliteitscontrole en een geschatte methylering waarde toewijzen aan elke CpG na uitlijning.
2. Genereer een lijst met DMRs met de BS-Seq pakket¹⁸ in Bioconductor. Filter de DMRs gebaseerd op het hebben van meer dan 3 opeenvolgende CpGs en P-waarde < 0.05.
   Opmerking: Het genereren van een DMR-lijst waarin genomic coördinaten, afstand tot de dichtstbijzijnde RefSeq gen, aantal CpGs binnen elke DMR, gemiddeld % apr methylation van waarde over de DMR voor de vergelijking van de twee groepen (bijvoorbeeld benadrukt vs. onbeklemtoonde), de P-waarde, en de FDR (valse ontdekking rate) waarde. Gebruik de lijst met DMR, dwz., genomic coördinaten, naar ontwerp van pyrosequencing inleidingen voor validatie.

9. bevestiging door bisulfiet Pyrosequencing

1. Primer Design
   1. Het ontwerpen van inleidingen voor PCR bisulfiet en pyrosequencing. Twee sets van PCR primers (buiten en geneste) zodanig ontwerpen dat de genestelde PCR 150 – 400 bps van een DMR zal versterken.
      Opmerking: In het algemeen, ontworpen inleidingen zijn ten minste 24 bases lang met ten minste 4 – 5 niet-opeenvolgende G's (C's voor de omgekeerde primer) account voor verminderd onthardende temperatuur van verlies van complexiteit van de sequentie. Eén van de genestelde inleidingen is Biotine-label en HPLC-gezuiverd. Standaard inleidingen moeten echter eerst het optimaliseren van de PCR-stap door het oplossen van de reacties op een agarose gel besteld worden.
      1. Ontwerp de pyrosequencing assay primer zodat het richt zich op de complementaire biotinyleerd strand slechts 1-2 honken stroomopwaarts van de CpGs te worden bepaald. Meerdere pyrosequencing inleidingen ontwerpen als dit nodig is, zoals elke pyrosequencing primer kan betrouwbaar assay 30 bps downstream.
   2. Voor de Rt1-m4, de onderstaande code gebruiken:
      rRT1M4 buiten-F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 buiten-R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 genest-F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
      rRT1M4 genest-R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
2. Gebruik een verkrijgbare kit voor Bisulfiet Omzetting van rat bloed gDNA.
   Opmerking: De stappen van het Bisulfiet omzetting zijn aangepast uit de verkrijgbare kit met de volgende wijzigingen: In stap 1, 50 – 100 ng van bloed gDNA toevoegen en Verdun met water tot 20 µL. Elueer 20 µL per monster in stap 9.
   1. Bereiden Bisulfiet Omzetting reagens volgens protocol van de fabrikant en combineren met verdunde gDNA. Incubeer in thermische cycler (64 ° C gedurende 2,5 uur, houden van de 4 ° C).
   2. Bindende Buffer aan geconverteerde gDNA in spin kolommen en centrifuge (15.000 x g, 1 min) toevoegen. Wash kolommen eens dan Voeg Desulphonation Buffer toe aan de kolommen en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifuge (15.000 x g, 1 min).
   3. Was de kolom met wassen Buffer en centrifuge (15.000 x g, 1 min). Herhaalstap wassen met centrifugeren (15.000 x g, 2 min). Voeg 20 µL elutie Buffer en centrifuge (15.000 x g, 1 min) te elueren.
3. PCR versterking
   1. Buiten PCR Master Mix voor te bereiden. 21.5 µL van Master Mix toevoegen aan 3.5 µL bisulfiet-geconverteerde gDNA en thermische cycler programma uitvoert.
      Buiten PCR Master Mix:
      16,25 µL van Water
      2.5 µL van Polymerase Buffer [10 x]
      0,5 µL van dNTP [10 mM]
      1 µL van voorwaartse Primer [0.1 µM]
      1 µL van omgekeerde Primer [0.1 µM]
      0,25 µL van de Polymerase van DNA van Taq [5000 U/mL].
      Thermische cycler programma:
      Fase 1, 1 cyclus: 94 ° C 4 min
      Fase 2, 47 cycli: 94 ° C 1 min, 53 ° C 30 s, 72 ° C 1 min
      3e etappe 1 cyclus: 72 ° C 8 min, 4 ° C houden
   2. Genestelde PCR Master Mix voor te bereiden. 23 µL van Master Mix aan 2 µL van het monster van buiten PCR toevoegen en herhaalt u de extern PCR thermische cycler programma. Beoordelen van PCR productkwaliteit door middel van de Elektroforese van het gel (1 x TAE buffer, 1% agarose gel).
      Genestelde PCR Master Mix:
      17.75 µL van Water
      2.5 µL van Polymerase Buffer [10 x]
      0,5 µL van dNTP [10 mM]
      1 µL van voorwaartse Primer [0.1 µM]
      1 µL van omgekeerde Primer [0.1 µM]
      0,25 µL van de Polymerase van DNA van Taq [5000 U/mL]
      Opmerking: Voor genestelde PCR, het doorsturen of de omgekeerde primer moet biotinyleerd.
4. Pyrosequencing
   1. Het maken van een master mix met 38 µL van bindende Buffer, 35 µL van water en 2 µL van daar beklede sepharose kralen per monster. Voeg in een 96-wells-plaat, 75 µL van master mix en 5 µL van geneste PCR product. Schudden in een roteerapparaat plaat voor 15-60 min.
   2. Terwijl het schudden, Voeg 12 µL primer (0,5 µM, verdunde in onthardende buffer) in de putjes van de plaat van een pyrosequencing bepaling.
   3. Na schudden, stappen wassen met behulp van bindende reactie wassen buffers. Vacuüm gereedschap plaats in trog gevuld met water en vervolgens het verzamelen van monsters uit plaat. Vacuüm gereedschap in half gevuld troggen met 70% ethanol, NaOH (0,2 M) en Tris-acetaat buffer (10 mM, pH 7.4) dompelen. Vacuüm en plaats vacuüm gereedschap in HS assay plaat overdracht van parels te verbreken.
   4. Plaats van plaat op warmte blok en Incubeer bij 80 ° C gedurende 2 min. toestaan plaat te cool voor 5 min dan pyro programma begint.

Resultaten

Een succesvolle implementatie van de rat-Methyl-Seq-platform, is afhankelijk van verschillende criteria. Figuur 1 toont de algemene workflow van de studie en hoogtepunten specifieke kwaliteitscontrole (QC) stappen die nodig zijn voor zich vooruit het bewegen. Een van de eerste factoren om te overwegen is de robuustheid van de diermodel en de stress regime, die bepalen van de omvang van de epigenetische veranderingen die zich in de methylome voordoen. Aangezien onze dierlijke werk is gebaseerd op onze vorige opmerking dat corticosterone (CORT) blootstelling tot veranderingen in DNA methylering^{19,20 leiden kan}, onze chronische variabele spanning (CVS) regime moest worden van voldoende strengheid te produceren beklemtoonde ratten met verhoogde plasma CORT niveaus. Een typische per CVS regime is weergegeven in tabel 1 en bestond uit dagelijkse stressoren in de ochtend, middag, en 's nachts die constant worden gewijzigd om te voorkomen dat gewenning en stressrespons verminderd. Gedurende de 3-weekse regime, de gestresste dieren tentoongesteld aanzienlijk verhoogde niveaus van gemiddelde plasma CORT [dagen 4 – 21: controle: 32.7 3.7 ng/mL, Stress: 103.0 11,9 ng/mL (gemiddelde SEM), P = 2.2 x 10^-4, figuur 2A] boven die van onbeklemtoonde, controledieren. Consequent, deze dieren bleek ook meer angst-achtig gedrag op de verhoogde plus doolhof (EPM), zoals aangegeven door de aanzienlijk meer tijd doorgebracht in de gesloten takken van de EPM en minder tijd in de open armen (figuur 2B). Deze resultaten tonen aan dat de blootstelling van de CVS geleid tot aanzienlijke verstoringen van de hormoonhuishouding en gedragsveranderingen, leidt ons om te onderzoeken of deze veranderingen geassocieerd met specifieke DNA methylering handtekeningen werden.

Wij benadrukken verschillende controlepunten die zijn van cruciaal belang voor de succesvolle bouw van de Methyl-Seq-bibliotheek. Beginnen met een voldoende hoeveelheid DNA is noodzakelijk, als ultrasoonapparaat meerdere doel verrijking, wassen/zuivering en Bisulfiet Omzetting stappen achtereenvolgens verminderen de hoeveelheid DNA in de voltooide bibliotheek. Hoewel verschillende PCR versterking stappen het verlies van DNA sjabloon verzachten, kan buitensporige PCR cyclus nummers leiden tot hogere dubbele leest. Voor de huidige rat Methyl-Seq-studie, werd 2 g bloed gDNA per rat gebruikt. Wij stellen vast dat Methyl-Seq bibliotheken kunnen worden gemaakt met het beginnen van DNA bedrag zo laag als 500 ng. Kleinere grondstof verstrekken verbruiker voor genereren van bibliotheken uit DNA geïsoleerd door FACS (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren) of naald stoten, hoewel er verhoogd risico voor het produceren van een onvoldoende hoeveelheid bibliotheken voor het latere rangschikken. QC wordt uitgevoerd door elektroforese van 1 L van het monster op een bioanalyzer, waarin DNA moleculair gewicht, aantal en molarity. Drie essentiële stappen die het gebruik van de bioanalyzer vereisen zijn: 1) volgende ultrasoonapparaat stap om ervoor te zorgen dat voldoende schuintrekken van DNA (~ 170 bp, red, Figuur 3); 2) volgende adapter afbinding stap aangegeven door een verschuiving in de gemiddelde grootte van de sheared DNA (~ 200 bp, blue, Figuur 3) om ervoor te zorgen hun latere versterking door PCR; en 3) na definitieve bibliotheek zuivering stap om ervoor te zorgen de hoeveelheid en de grootte van de bibliotheek voor het rangschikken.

De R-pakketten BSSeq en BSmooth in de Bioconductor werden gebruikt voor het analyseren van het Bisulfiet sequencing gegevens¹⁸. Bevatten ze instrumenten en methoden voor het uitlijnen van de volgorde leest, kwaliteitscontrole, uitvoert en identificatie van differentieel gemethyleerd regio's (DMRs). BSmooth software roept Bowtie 2.0^16,17 als een interne opeenvolging aligner CpG-niveau meting samenvattingen, verkrijgen door uitlijning van ruwe invoer leest aan de genomic opeenvolgingen bisulfiet-geconverteerd. De uitgelijnde leest zijn vervolgens gefilterd door middel van strenge kwaliteitscontrole-procedures die willen identificeren systematische sequencing en base-roept fouten downstream analyses kunnen vertekenen. Een aantal percelen worden gegenereerd als visueel hulpmiddel bij dit proces van filtering. Sequencing statistieken worden ook gegenereerd tot document relevante informatie zoals aantal uitgelijnde leest, procent, en per apr dekking, o.a. (tabel 2). Nadat de gegevens zijn gefilterd, een vloeiend maken/normaalgloeien algoritme wordt uitgevoerd, waar elke CpG is toegewezen een methylation van de geschatte waarde op basis van alle QC leest van elk monster en schat van naburige CpGs zodat nauwkeuriger roeping van methylering status zelfs in gevallen waar de reeks dekking laag is. Deze waarde geeft een afgevlakte schatting van de waarschijnlijkheid van Methyleren aan elke CpG-site. Door het vergelijken van het gemiddelde van de afgevlakte methylering ramingen van elke steekproef tussen de twee behandelgroepen en ranking genomic regio's van het meest significant verschillend van minst, een lijst van DMRs wordt gegenereerd (tabel 3).

De DMR tussen beklemtoonde en onbeklemtoonde groepen was gevestigd in de promotor van de rat grote comptabiliteit gen Rt1-m4, met top benadrukt dieren vertonen hogere methylering niveaus over alle CpGs dan onbeklemtoonde dieren (figuur 4A). Controleer de succesvolle implementatie van het Methyl-Seq-platform en de data-analyse, zijn primers ontworpen tegen de DMR, en DNA methylering bloedspiegels in de hele cohort van beklemtoonde en onbeklemtoonde dieren (8 sequenced door Methyl-Seq en 8 niet sequenced) door bisulfiet pyrosequencing werden beoordeeld. Resultaten tonen aanzienlijke toename van methylation van DNA in 10 van de 12 CpGs vehiculumcontrolegroep (5.1-10.4 verandering in % methylering, P < 0.037, figuur 4B). KEGGEN traject analyse werd uitgevoerd op alle van de nominaal significante DMRs te identificeren van de trajecten die zijn gekoppeld aan stress. Consequent, betrokken DMR-geassocieerde trajecten ziekten in verband met blootstelling aan chronische stress, zoals diabetes, hart-en vaatziekten en kanker (tabel 4). ^{21 , 22 , 23} om aan te tonen een associatie tussen de epigenetische gegevens en de mate van blootstelling om te benadrukken, methylering niveaus op apr-10 werden vergeleken met de gemiddelde 3-weekse CORT niveaus voor elk dier. Resultaten toonden een bescheiden correlatie tussen de verstoringen van de hormoonhuishouding en methylation van gegevens (R²= 0,54, P = 0,001, Figuur 5).

Figuur 1: totale schematische workflow voor de rat Methyl-Seq platform. Een g van de genomic DNA geëxtraheerd uit het bloed van benadrukt en controle ratten wordt eerst verwerkt voor de bouw van de Methyl-Seq bibliotheken voor target identificatie, sequencing en analyse. Nog eens 100 ng van DNA wordt gebruikt voor onafhankelijke validatie van de geïdentificeerde epigenetische doelstellingen door bisulfiet pyrosequencing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: blootstelling aan chronische variabele spanning (CVS) leidt tot endocriene en gedragsmatige veranderingen in ratten. (A) meerdere proeverijen van corticosterone (CORT) tonen de robuustheid van de 3 week CVS regime. Bloedmonsters werden verzameld in de ochtend voorafgaand aan de dagelijkse stress-regime. (B) gestresst dieren besteed meer tijd in de armen gesloten en minder tijd in de open armen van de verhoogde plus doolhof (EPM). Boxplots gegevenspunt voor elk dier worden weergegeven. Student T-test werd uitgevoerd voor statistische significantie. * P < 0,05, ** P < 0,01, en *** P < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: kwantificatie van sheared en adapter-afgebonden rat DNA op een bioanalyzer. De rode en blauwe krommen tonen de hoeveelheid en grootte van genomic DNA (rood) na scheren in een isothermische ultrasoonapparaat en adapter afbinding, respectievelijk. Elke regel staat voor één monster en de rode en blauwe curven weerspiegelen zowel verlies van DNA tijdens de verschillende stappen (einde-reparatie, 3'-adenylation en opruimen van de steekproef) en toename van bp grootte als gevolg van de afbinding van de adapters. Scherpe pieken bij 25 bp en bp 1500 zijn standaard markeringen die zijn toegevoegd aan de buffer geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: CVS-geïnduceerde epigenetische veranderingen worden gedetecteerd door rat Methyl-Seq. (A) analyse van de rat Methyl-Seq gegevens betrokken de promotor van het gen Rt1m4 als een differentieel methylated regio (DMR) tussen gespannen (rood) en control (blauw) ratten. De grafische uitvoer voor de Rt1m4 DMR (roze grijs regio) geeft elke CpG (verticale grijze lijn), de vier monsters in elke groep (rode of blauwe lijnen), en de niveaus van de methylering % voor elk dier (rode of blauwe stip). De twaalf CpGs (B) binnen de DMR werden gevalideerd door bisulfiet pyrosequencing. De bar grafieken zijn vertegenwoordigd zoals SEM te betekenen en een Student T-test werd uitgevoerd voor statistische significantie. * P < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: lineaire regressie-analyse toonde een bescheiden correlatie tussen % DNA Methyleren aan apr-10 van Rt1m4 en de 3 week bedoel plasma CORT niveaus van beide benadrukt en controledieren (N = 16). Gegevens van gestresste dieren worden vertegenwoordigd door rode cirkels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Week	Dag 1	Dag 2	Dag 3	Dag 4	Dag 5	Dag 6	Dag 7
AM	Terughoudendheid	Zwemmen	Koude kamer	Zwemmen	Terughoudendheid	Shaker	Zwemmen
PM	Shaker	Cage Tilt	Terughoudendheid	Shaker	Koude kamer	Terughoudendheid	Koude kamer
Overnachting	Voedsel beperken	Nat strooisel	Isolatie	Licht op	Verdringing	Licht op	Nat strooisel

Tabel 1: Een typische weekplanning van de chronische variabele spanning regime (CVS).

Sequencing Metrics	Stress1	Controle1
	(n = 4)	(n = 4)
Gepaarde einde leest (PER)	89,290,397	80,165,674
Uniek toegewezen gepaarde einde leest (UMPER)	39,200,255	35,013,406
Uitlijning tarief/kartografie efficiëntie (UMPER / PER)	44%	44%
Dubbele leest (% van UMPER)	73%	65%
Deduplicated UMPER	10,481,031	12,306,018
Gemiddelde lezen diepte dekking (x) (ARDC)	6 x	6 x
CpGs (N)	12,056,878	12,056,878
ARDC (x) van CpGs	2 x	2 x
CpGs met ten minste 10 leest (N)	481,383	595,850
ARDC (X) van CpGs met ten minste 10 leest	19	19
Op Target CpGs (volledige overlapping met sonde doelregio's)	1,923,872	2,007,638
Op doel ARDC (x) van CpGs	7 x	8 x
Op Target CpGs met ten minste 10 leest (N)	428,249	531,419
Op Target ARDC (x) van CpGs met minstens 10 leest	18 x	18 x
Op doel (PER met 1 of meer basenpaar overlapping met sonde doelregio's) (UMPER)	8,277,715	9,369,523
% Op doel (van Deduplicated UMPER)	78%	77%
Op doel (totale basissen toegewezen) Mb	125 mb	128 mb
Op Target gemiddelde lezen diepte dekking (x) (ARDC)	9 x	10 x
1 Rangschikking van de statistieken die zijn gebaseerd op gemiddelden over onderwerpen in elke groep

Tabel 2: Sequencing statistieken verkregen uit de rat Methyl-Seq-platform.

Chr	Start	einde	gen	afstand	areaStat	meanDiff	stress	controle	richting
chr20	1,644,246	1,644,390	RT1-M4	in_gene	93.03	0.22	0,33	0.11	winst
chr5	160,361,352	160,361,564	LOC690911	in_gene	-70.75	-0.19	0.72	0.91	verlies
chr3	61,138,281	61,138,330	RGD1564319	265569	61.79	0.21	0.94	0.72	winst
chr2	143,064,811	143,065,010	Ufm1	8569	-59.48	-0.11	0.13	0,24	verlies
chr7	30,764,111	30,764,284	Ntn4	in_gene	57.04	0.21	0.94	0,73	winst
chr17	12,469,112	12,469,218	Idnk	41996	-50.91	-0.13	0,74	0.88	verlies
chr7	47,101,725	47,101,930	Pawr	in_gene	-50.54	-0.12	0.64	0.76	verlies
chr5	76,111,248	76,111,822	Txndc8	151703	-50.38	-0.11	0,85	0.96	verlies
chr11	80,640,132	80,640,356	Dgkg	in_gene	-50.07	-0.16	0,73	0,89	verlies
chr8	71,759,248	71,759,411	Mir190	210226	-47.84	-0.17	0,58	0,75	verlies

Tabel 3: Top 10 differentieel regio's gemethyleerd. Voor elke DMR, toont de uitvoertabel van links naar de rechterkolom: chromosomale locatie (chr), coördineert (begin/einde), gene naam, afstand van de transcriptie site starten, differentiële statistieken tussen benadrukt en controlegroepen (areaStat), betekent differentiële methylering (meanDiff), gemiddelde methylering niveaus over elke DMR voor benadrukt en controlegroepen (stress/control), en de richting van methylering wijzigen van besturingselementen.

KEGGEN Pathway voorwaarden	Gene graaf	%	P-waarde	Benjamini
Diabetes
Diabetes mellitus type II	12	0.1	3.6 x 10-4	9,8 x 10-3
Hart-en vaatziekten
Vasculaire smooth spiercontractie	18	0.1	1.6 x 10-3	3.6 x 10-2
Arrhythmogenic rechts ventriculaire cardiomyopathie (ARVC)	13	0.1	4.0 x 10-3	7.1 x 10-2
Verwijde cardiomyopathie	14	0.1	7,6 x 10-3	1.2 x 10-1
Functie van het neuron
Op lange termijn potentiëring	11	0.1	1.5 x 10-2	1.4 x 10-1
Signalering
MAPK signalering traject	35	0.2	2.4 x 10-4	9,9 x 10-3
Calcium signalering traject	22	0.1	1.2 x 10-2	1.4 x 10-1
Chemokine signalering traject	21	0.1	1.2 x 10-2	1.3 x 10-1
Kanker
Trajecten in kanker	42	0.3	4.1 x 10-5	3.4 x 10-3
Glioma	15	0.1	4.4 x 10-5	2.4 x 10-3
Niet-kleincellige longkanker	10	0.1	7,9 x 10-3	1.1 x 10-1
Colorectale kanker	13	0.1	8.4 x 10-3	1.1 x 10-1
Chronische myeloïde leukemie	12	0.1	1.2 x 10-2	1.3 x 10-1

Tabel 4: KEGGEN Pathway analyse van DMRs van de rat Methyl-Seq. geïdentificeerd

Discussie

In deze studie, we ontworpen en geïmplementeerd de Methyl-Seq-platform voor het genoom van de rat. Door aan te tonen het nut ervan met een rat-model van stress, toonden we aan dat de pijpleiding van experimentele en analytische differentieel gemethyleerd regio's tussen twee groepen van de vergelijking kan bieden.

Om te garanderen een succesvolle implementatie van het platform, moeten verschillende kritische stappen in acht worden genomen. Eerste, initiële DNA kwaliteit en kwantiteit heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit en kwantiteit van de definitieve Methyl-Seq-bibliotheek. We gebruikten een Fluorimeter, in plaats van een spectrofotometer, om ervoor te zorgen dat onze DNA meting weerspiegeld de hoeveelheid double-stranded DNA aanwezig. De bioanalyzer werd gebruikt voor het meten van de moleculaire grootte en hoeveelheid van DNA na scheren en na adapter afbinding. Controleren of de moleculaire grootte "shift" tussen deze stappen is cruciaal voor het bevestigen van de aanwezigheid van adapters aan het einde van elk fragment van DNA die adapter-gemedieerde PCR in de opeenvolgende stappen zal ondergaan. De hoeveelheid DNA resterende aan het eind van de adapter afbinding stap is ook belangrijk, sinds ten minste 100 ng van het product van de bibliotheek is die bij deze stap nodig is om voldoende hoeveelheid is beschikbaar na de doelgroep verrijking en Bisulfiet Omzetting stappen. Een definitieve ultragevoelige meting werd uitgevoerd op de geconstrueerde Methyl-Seq-bibliotheek, zodat de bibliotheek correct kan worden verdund voor latere clustering op de volgende-generatie-sequencer. Ten slotte was bisulfiet pyrosequencing werkzaam als een hoogst-kwantitatieve, onafhankelijke methode te beoordelen van de juistheid van de analytische pijpleiding. De uiteindelijke validatie met behulp van de oorspronkelijke monsters en replicatie met behulp van extra dieren zijn cruciale stappen om ervoor te zorgen dat het experiment biologisch belangrijke veranderingen in DNA-methylering kan detecteren.

Wij omvatten ook verschillende richtsnoeren in geval van afwijking van het protocol of als problemen ondervindt. Eerst, is het mogelijk om te verliezen teveel DNA tijdens einde-reparatie, adapter afbinding of magnetische kraal zuivering stappen. Anderzijds beginnen bedragen van DNA zou kleine (< 200 ng) als gevolg van de beperkte weefsel/DNA beschikbaarheid of de implementatie van verschillende verrijking methoden zoals het sorteren van de cel van de fluorescentie geactiveerd. Verhoging van het aantal cyclus tijdens de twee bibliotheek amplificatie stappen mogelijk kunnen compenseren voor het overmatig verlies van DNA of lage DNA bedrag in het gehele protocol bibliotheek bouw beginnen. Echter worden niet meer dan een extra 2-3 cycli aanbevolen, zoals overmatige sjabloon versterking dreigt te leiden tot een toename van het aantal dubbele leest wordt sequenced. Deze dubbele vermeldingen zijn uitgesloten tijdens de uitlijning stap om te voorkomen dat vooringenomenheid in percentage methylering berekeningen. Ten tweede, als de gemiddelde grootte van de DNA niet door meer dan 30 bps toeneemt, controleren om ervoor te zorgen dat de reagentia zijn nieuwe, als de polymerase van DNA van de T4, Klenow, en/of T4 ligase oude. Verkrijgbare vervanging reagentia kunnen worden gebruikt.

Bovendien is het mogelijk dat de voorspelde DMRs pyrosequencing, waar DNA methylering verschillen bestaan niet of zijn aanzienlijk minder dan voorspeld door de analyse niet kunnen valideren. Slechte validatie van kandidaat-regio's is een probleem te vaak voor veel genoom-brede analyses, zoals wanneer pyrosequencing resultaten differentiële methylering niet bevestigen of de effect grootte is veel kleiner dan die voorspeld door de analyse. BSmooth is een analytische pakket dat "glad" de methylering niveaus in een venster van meerdere CpGs. Voor de huidige experiment betrokken BSmooth een DMR waarvan methylering niveaus zijn gevalideerd door bisulfiet pyrosequencing. Er zal waarschijnlijk wel verschillen vastgesteld tussen methylering niveaus voorspeld door BSmooth en geverifieerd door pyrosequencing. De verschillen voortkomen uit de smoothing functie die de gemiddelde methylering waarden in alle van de CpGs binnen een DMR schat, met inbegrip van opeenvolgende CpGs die door meer dan 50% in methylation van DNA afwijken of CpGs waarvan methylation van de waarden werden uitgesloten wegens sub drempel Lees diepte. R-pakketten zoals MethylKit²⁴ kunnen worden gebruikt voor identificatie van kleinere vensters of zelfs één CpGs waarvan methylering niveaus sterk met die gevalideerd door pyrosequencing correleren en CpGs. Uitvoering van de verschillende pakketten en testen hun voorspelde regio's of de CpGs van differentiële methylering door pyrosequencing zorgt robuustheid van gegevens. Als alternatief, originele Methyl-Seq bibliotheken kunnen worden resequenced en toegevoegd aan de gelezen bestanden toe Lees diepte. Aangezien de gehaltebepaling methylering semi-kwantitatieve en gedicteerde door het aantal leest [(# of CpGs) / (# van TpGs + CpGs)], verhoging van de Lees diepte voor een bepaalde CpG de nauwkeurigheid van de waarde van percentage methylering verhoogt. In deze studie vonden wij alleen CpGs waarvan methylation van de waarden werden bepaald door ten minste tien leest en een algehele Lees dekking van 19 x voor elke CpG bereikt.

De rat Methyl-Seq platform is niet zonder haar beperkingen. Hoewel het rendabeler dan bisulfiet geheel-genoom sequencing, is het aanzienlijk duurder dan andere methoden. Niettemin was de grootste deel van de kosten voor de aankoop van rijstroken op de sequencer en niet voor het systeem vastleggen. Afhankelijk van de diepte van Lees nodig met kruis-weefsel vergelijkingen vereisen minder als gevolg van grote (25-70%) verschillen¹² in methylation van DNA, kan de kosten worden verminderd door multiplexing meer monsters per rijstrook en met behulp van een hogere capaciteit platform. Ook kost de monsterverwerking meer tijd dan andere methoden. Terwijl gelijkaardig aan andere pulldown benaderingen die gebruikmaken van de volgende generatie sequencing, toevoegen de toegevoegde Bisulfiet Omzetting en zuivering stappen aan de werklast. Globaal, is het Methyl-Seq-platform is een kosteneffectief alternatief voor geheel-genoom sequentiebepaling en cijferreeks basenpaar op meer dan 2,3 miljoen CpGs, dat is aanzienlijk meer dan de vehiculumcontrolegroep door microarray gebaseerde platformen. Tot op heden, de verkrijgbare mens en muis zijn Methyl-Seq platformen gebruikt om het document alcohol-afhankelijke veranderingen in de makaak hersenen^25,26, neurologische genen in de muis hersenen⁹, en de blood-brain doelstellingen van glucocorticoïden¹⁰. Verder is maakt de mogelijkheid om zich te richten op specifieke regio's, ongeacht de volgorde erkenning door enzymen van de beperking het een ideaal platform voor cross-soorten vergelijkingen. Voor deze studie ontwierpen we de Methyl-Seq-platform voor de rat, waarvoor vele farmacologische, metabole en gedrags experimenten worden uitgevoerd zonder het voordeel van een genoom-brede methylomic tool. Onze gegevens tonen aan dat het kan worden gebruikt voor het detecteren van DMRs in een rat-model van stress en andere fysiologische parameters zoals algemene plasma CORT niveaus gecorreleerd.

De Methyl-Seq-platform is ideaal voor epigenetische experimenten in dieren met gesequenceerd genomen die wellicht niet genoeg experimenteel bewijsmateriaal documenteren van de regelgevende gebieden. Wanneer dergelijke regio's ter beschikking worden gesteld, kunnen extra gebieden worden speciaal ontworpen en gekoppeld aan de huidige versie. Verder, het platform is ideaal voor vergelijkende genomica, aangezien de verrijking van het doel niet wordt belemmerd door restrictie-enzym erkenning. Bijvoorbeeld, kan de regio van de promotor van een gen van belang worden vastgelegd ongeacht of het een specifieke beperkingsplaats havens. Ook kunnen eventuele regelgevende gebieden, zoals die welke in de muis of mens, die zijn bewaard in het genoom van belang worden vastgelegd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Radioimmuno assay (RIA)	MP Biomedicals	7120126	Corticosterone, 125I labeled
Master Pure DNA Purification Kit	Epicentre/Illumina	MC85200
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath	USA Scientific	2510-1102	Gebruikt met 1,5 mL buizen
Vortex Genie 2	Fisher	12-812	Vortex Mixer
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023	100% Ethanol, moleculaire graad
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	-	Moet in staat zijn om 20.000 x g te halen
Qubit 2.0	ThermoFisher Scientific	Q32866	Fluorometer
Qubit dsDNA BR Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32850
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32851	High sensitivity DNA detection reagents
Qubit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit	Agilent Technologies	G9651A	Reagents voor het voorbereiden van de Methyl-Seq bibliotheek
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library	Agilent Technologies	931143	RNA baits voor verrijking van rat targets
IDTE, pH 8.0	IDT DNA	11-05-01-09	10 mM TE, 0,1 mM EDTA
DNA LoBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	22431021
Covaris E-series of S-series	Covaris	-	Isothermische sonicator
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)	Covaris	520045
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)	Quality Biological	351-029-721
Veriti 96 Well-Thermal Cycler	Applied Biosystems	4375786
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA-Binding magnetische kralen
96S Super Magnet	ALPAQUA	A001322	Magneetplaat voor zuiveringsstappen
2200 TapeStation	Agilent Technologies	G2965AA	Elektroforese-gebaseerde bioanalyzer
D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5582
D1000 ScreenTape High Sensitivity	Agilent Technologies	5067-5584
D1000 Reagents	Agilent Technologies	5067-5583
D1000 Reagents High Sensitivity	Agilent Technologies	5067-5585
DNA110 SpeedVac	ThermoFisher Scientific	-	Vacuum Concentrator
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetische kralen	Invitrogen	65601	Streptavidine magnetische kralen
Labquake Tube Rotator	ThermoFisher Scientific	415110Q	Nutator Mixer is ook acceptabel
EZ DNA Methylation-Gold Kit	Zymo Research	D5006	Bisulfietconversie kit. Bevat Binding, Wash, Desulphonation en Elution buffers
Illumina Hi-Seq 2500	Illumina	-	Next-generation sequencing machine
PCR and Pyrosequencing Primers	IDT DNA	Variabel
Taq DNA Polymerase met ThermoPol Buffer - 2.000 eenheden	New England BioLabs	M0267L
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S
Pyromark MD96	QIAGEN	-	Pyrosequencing machine
Ethyl Alcohol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	70% Ethanol oplossing
Sodium Hydroxide Pellets	Sigma-Aldrich	221465	0,2 M NaOH denaturatie buffer oplossing
Tris (Base) van J.T. Baker	Fisher Scientific	02-004-508	10 mM Tris Acetaat Buffer was oplossing
PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)	QIAGEN	972807	Reagentia vereist voor pyrosequencing
PyroMark Annealing Buffer	QIAGEN	979009
PyroMark Binding Buffer (200 mL)	QIAGEN	979006
Streptavidin Sepharose High Performance Beads	GE Healthcare	17-5113-01	Streptavidine-gecoate sepharose kralen
PyroMark Q96 HS Plate	QIAGEN	979101	Pyrosequencing assay plate
Eppendorf Thermomixer R	Fisher Scientific	05-400-205	Plate mixer. 96-well block apart verkocht (cat. Nr. 05-400-207)
SureDesign Website	Agilent Technologies	-	Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)
UCSC Genome Browser	University of California Santa Cruz	-	rat Nov 2004 rn4 assemblage
Agilent Methyl-Seq Protocol	Agilent Technologies	-	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf