Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58631

⸱

17 januari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van gekooide moleculaire lijm tags. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug delivery.

Samenvatting

De celkern is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten. Hier tonen we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten met behulp van moleculaire lijm (GlueCaged-R) tags, waarvan meerdere guanidinium ion (Gu+) Hangers worden beschermd door een groep van de anionactieve photocleavable (butyraat-gesubstitueerde gekooide nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en blijven Endosomen. Echter, op photoirradiation, Cagedlijm-R wordt omgezet in uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, dat de endosomal vlucht en de daaropvolgende nucleaire translocatie van de gasten vergemakkelijkt. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug levering, aangezien de tagged gasten naar het cytoplasma gevolgd door de celkern migreren kunnen alleen als photoirradiated. Caged Lijm-R tags kunnen leveren macromoleculaire gasten zoals quantumdots (QDs) evenals kleine-molecuul gasten. Caged Lijm-R tags kunnen uncaged met niet alleen UV-licht, maar ook twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht, dat diep in weefsel kan binnendringen.

Inleiding

De celkern, die genetische informatie draagt, is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten waaronder kanker en genetische stoornissen van1,2,3. Voor nucleaire levering van drugs, vervoeging van peptide tags zoals nucleaire localisatie signalen (NLS)4,5,6 grote schaal is onderzocht. Ter beperking van ongewenste bijwerkingen hebben, is echter de spatio controle van de nucleaire translocatie nodig.

Eerder, licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern heeft bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. NLS worden naar de celkern door binding aan cytoplasmatische vervoer eiwitten6gemigreerd. In de gerapporteerde methoden, zijn gast eiwitten dragen gekooide NLS direct ingelijfd bij het cytoplasma van microinjection8 of uitgedrukt in de doelcellen met behulp van een genetische code uitbreiding techniek9. Een methode die zowel cellulaire opname- en foto-geïnduceerde nucleaire translocatie kan bereiken is dus voordelig voor praktische toepassingen.

Hierin beschrijven we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van dendritische gekooide moleculaire lijm (Cagedlijm-R, Figuur 1) tags. In water oplosbare moleculaire lijm10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , rekening houdend met meerdere Gu+ Hangers zijn eerder ontwikkeld, die strak houden aan eiwitten11,12,13,14,15, 16,17, nucleïnezuren18,19,20, fosfolipide membranen21en klei nanosheets22,23 via de vorming van meerdere zout bruggen tussen hun Gu+ hangers en oxyanionic groepen op de doelen. De hangers Gu+ van Cagedlijm-R worden beschermd door een anionogene photocleavable groep, butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en verblijf in Endosomen (Figuur 2). Op photoirradiation, zijn de BANVOC groepen Cagedlijm-R zodanig dat deze een uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, die vervolgens de migratie van de tagged gast vergemakkelijkt vrijstaand in het cytoplasma gevolgd door de celkern (Figuur 2). De Cagedlijm-R tag kan worden uncaged door blootstelling aan UV- of twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht zonder ernstige fototoxiciteit. We tonen de spatiotemporally gecontroleerde nucleaire levering van macromoleculaire gasten evenals gasten van de kleine-molecuul met Cagedlijm-R tags, met behulp van quantumdots (QDs) en een fluorescente kleurstof (nitrobenzoxadiazole; NBD), respectievelijk, als voorbeelden.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische structuren van Cagedlijm-R. De 9 guanidinium ion (Gu+) Hangers van Cagedlijm-R worden beschermd door een groep butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). De BANVOC groepen zijn gekloofd door bestraling met UV- of twee-foton NIR licht. De focal kern van Cagedlijm-R is matiemaatschappij met nitrobenzoxadiazole (NBD) of dibenzocylooctyne (DBCO). Overgenomen met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-introduction-2
Figuur 2: Schematische afbeelding van licht-geactiveerd nucleaire translocatie van gasten geconjugeerd met een Cagedlijm-R tag. De gast /Cagedlijm-R conjugaat wordt in beslag genomen in levende cellen via endocytosis. Op photoirradiation is de Cagedlijm-R tag uncaged een Uncagedlijm-R tag, die endosomal ontsnappen van de tagged gast vergemakkelijken kan opleveren. Vervolgens worden de tagged gast naar de celkern gemigreerd. Overgenomen met toestemming van referentie20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van gasten met gekooidelijm-R Tags

  1. Bereid Cagedlijm-NBD-oplossing.
    1. Synthetiseren Cagedlijm-NBD (Figuur 1) na de procedures eerder beschreven20.
    2. Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-NBD (10 mM) in droge dimethylsulfoxide (DMSO).
      Opmerking: Bewaar de stockoplossing in donker. De oplossing kan worden verdund met waterige buffers of cel-cultuur-media bij gebruik.
  2. Bereid Cagedlijm-QD-oplossing.
    1. Synthetiseren Cagedlijm-dibenzocylooctyne (Cagedlijm-DBCO) (Figuur 1) volgens de procedures eerder beschreven20.
    2. Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-DBCO (10 mM) in droge DMSO.
    3. Voor de bereiding van Cagedlijm-QD, eerst voorbereiden azide-matiemaatschappij QDs (Azide-QD; Figuur 3). Voeg 100 µL van een dimethyl formamide (DMF, 125 µM) oplossing van azide-PEG4-NHS ester (Figuur 3) aan 400 µL van een DMF (500 nM) oplossing van quantumdots (QDs) bekleed met amine-matiemaatschappij PEG (Amine-QD; Figuur 3). Roer het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. Dialyze van de resulterende oplossing gedurende 24 uur tegen 800 mL DMF gebruik van een folie van geregenereerde cellulose membraan met 3.500 molecuulgewicht cut-off (MWCO).
    5. Verdun de stockoplossing van Cagedlijm-DBCO tot 50 µM met DMF. Voeg 200 µL van de oplossing aan de oplossing na dialyse (Figuur 3) en roer het mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
    6. Dialyze van de resulterende oplossing gedurende 24 uur tegen 800 mL DMF gebruik van een folie van geregenereerde cellulose membraan (25.000 MWCO).
    7. Verdun de resulterende oplossing tot 200 nM met DMF.

figure-protocol-1
Figuur 3: Schematische afbeelding van de voorbereiding van Cagedlijm-QD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. bereiding van Hep3B cel monster voor microscopische waarnemingen

  1. Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom Hep3B cellen in Eagle's minimale essentiële medium (EMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
  2. Beënt de cellen, de dag voor het experiment. Zaad 5.0 × 103 Hep3B cellen per putje van een 8-chambered glas-substraat in EMEM (10% FBS, 200 µL), en Incubeer het monster van de cel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 24 uur.
  3. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL Dulbecco van fosfaat buffer zoutoplossing (D-PBS).

3. waarneming van nucleaire translocatie van gasten van de kleine-molecuul veroorzaakt door UV-licht

  1. Leveren van het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
    Opmerking: Incubatie van het monster van de cel in FBS-vrije EMEM langer dan 4U veroorzaakt ernstige celbeschadiging.
  2. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS.
  3. Voor de visualisatie van de Endosomen, leveren de cel monster met 200 µL van EMEM (10% FBS) met een rood-fluorescerende kleurstof (bvLysoTracker rood, 100 nM), en het resulterende cel monster bij 37 ° C te incuberen minder dan 5% CO,2 voor 20 min. Verwijder de cultuur medium, en spoel het monster van de cel met 100 µL van D-PBS tweemaal. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).
  4. Voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD, blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter monster cel. Voor de cel van een referentiemonster is zonder UV-blootstelling, het monster van de cel in donker te houden.
    Opmerking: Het deksel van de glazen substraten kan afgenomen worden voor efficiënte UV-blootstelling. Lange-termijn blootstelling aan UV-licht kan het veroorzaken van cytotoxiciteit op de cellen.
  5. Voor de visualisatie van de kernen, voeg 1 µL van Hoechst 33342 (1 mg/mL) toe aan het kweekmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 10 min.
  6. Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm), en 710 nm (twee-foton; Λ Obs = 390-465 nm) voor NBD, rood-fluorescerende kleurstof en Hoechst 33342, respectievelijk.

4. waarneming van nucleaire translocatie van gasten van de kleine-molecuul veroorzaakt door twee-foton NIR licht

  1. Leveren van het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (10 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
  2. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).
  3. Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. Bestralen voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-NBD, de regio, met inbegrip van de cel van belang met een twee-foton excitatie-laser (710 nm), geïnstalleerd als een lichtbron in de Microscoop, gedurende 2 minuten (30 s × 4). Observeer de translocatie zoals beschreven in stap 4.3.

5. waarneming van nucleaire translocatie van macromoleculaire gasten veroorzaakt door UV-licht

  1. Het monster van de cel (bereid in stap 2.3) met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-QD leveren (10 nM), en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
  2. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van EMEM (10% FBS).
  3. Voor nucleaire translocatie van Cagedlijm-QD, blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter monster cel. Voor de cel van een referentiemonster is zonder UV-blootstelling, het monster van de cel in donker te houden.
  4. Voor de visualisatie van de kernen, voeg 1 µL van Hoechst 33342 (1 mg/mL) toe aan het kweekmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 10 min.
  5. Het monster van de cel onverminderd confocale laser scanning microscopie en opnemen van de microfoto na excitatie op 405 nm (λobs = 430-520 nm) en 488 nm (λobs = 625-680 nm) voor Hoechst 33342 en QDs, respectievelijk.

6. cel levensvatbaarheid Assay

  1. Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom Hep3B cellen in EMEM (10% FBS) bij 37 ° C minder dan 5% CO2.
  2. Beënt de cellen, de dag voor het experiment. Zaad 5.0 × 103 Hep3B cellen per putje van een cultuur van de 96-wells-plaat in EMEM (10% FBS, 200 µL), en Incubeer het monster van de cel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 24 uur.
  3. Verwijder het kweekmedium en tweemaal spoelen van het monster van de cel met 100 µL van D-PBS.
  4. Leveren van het monster van de cel met 200 µL van FBS-vrije EMEM met Cagedlijm-NBD (0.1-100 µM) en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 voor 3 h.
  5. Blootstellen aan het UV-licht voor 2 min via monster cel een optische vezel met behulp van een lichtbron van 100-W xenon, voorzien van een 365 nm bandfilter filter. Houd de cel monster in donker voor een monster analoog cel zonder UV-blootstelling.
  6. 10 µL van cel tellen Kit-8 reagens (10 µL) toevoegen aan het cultuurmedium en Incubeer het resulterende cel monster bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 gedurende 2 uur.
  7. Het monster van de cel onverminderd Absorptie spectroscopie (λ = 450 nm) met behulp van een microplate-lezer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor photoirradiation, Hep3B cellen geïncubeerd met Cagedlijm-NBD tentoongesteld punctate fluorescentie emissie van hun interieur (λext = 488 nm; Cijfers 4A en 4 C, groen). Een analoge opname werd verkregen na excitatie bij 543 nm voor rood-fluorescerende kleurstof (cijfers 4B en 4 C, rode), die aangeeft dat Cagedlijm-NBD gelokaliseerd in de Endosomen. Dienoveree...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vorige onderzoeken van licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern hebben bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. Zoals eerder vermeld, vereisen deze methoden additionele technieken te nemen de NLS-gelabelde proteïnen in het cytoplasma. Onze Cagedlijm-R tag kan daarentegen niet alleen foto-geïnduceerde nucleaire translocatie, maar ook cellulaire opname van de gasten. Deze functie van de Caged

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen het centrum voor NanoBio integratie, de Universiteit van Tokio. Dit werk was ondersteund door de Grant-in-Aid voor de wetenschappers (B) (26810046) van de jonge aan K.O. en slechts gedeeltelijk ondersteund door Grant-in-Aid speciaal bevorderd onderzoek (25000005) naar T.A. R.M. bedankt de Research Fellowships van Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS ) voor jonge wetenschappers en het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (GPLLI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azide-PEG4-NHS esterClick Chemistry ToolsAZ103
Q-dot 655 ITKInvitrogenQ21521MP
Geregenereerde cellulose membraan (MWCO 3.500)NIPPON GeneticsTOR-3K
Geregenereerde cellulose membraan (MWCO 25.000)Harvard Apparatus7425-RC25K
Hep3B-cellenATCCHB-8064
8-kamerige glazen substraatNunc155411JP
96-wells kweekplaatNunc167008
Eagle's minimaal essentieel medium (EMEM)Thermo Fisher Scientific10370-021
Foetaal bovien serum (FBS)GE HealthcareSH30406.02
Dulbecco's fosfaat buffer saline (D-PBS)Wako Pure Chemical Industries045-29795
LysoTracker RedLonza WalkersvillePA-3015
Hoechst 33342DojindoH342
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Confocal laser scanning microscoopCarl-ZeissLSM 510Uitgerust met twee-foton excitatielaser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscoopLeicaTCS SP8
Xenon lichtbronAsahi SpectraLAX-102
Microplaat readerMolecular DevicesSpectraMax Paradigm

Referenties

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Gekooide moleculaire lijmquantumdotsconfocale microscopieUV-lichtbestralingendosomale ontsnappingHEP3 B-cellentweefoton NIR-lichttracking van fluorescente kleurstoffen
Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.