Dit protocol beschrijft licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van gekooide moleculaire lijm tags. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug delivery.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De celkern is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten. Hier tonen we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten met behulp van moleculaire lijm (GlueCaged-R) tags, waarvan meerdere guanidinium ion (Gu+) Hangers worden beschermd door een groep van de anionactieve photocleavable (butyraat-gesubstitueerde gekooide nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en blijven Endosomen. Echter, op photoirradiation, Cagedlijm-R wordt omgezet in uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, dat de endosomal vlucht en de daaropvolgende nucleaire translocatie van de gasten vergemakkelijkt. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug levering, aangezien de tagged gasten naar het cytoplasma gevolgd door de celkern migreren kunnen alleen als photoirradiated. Caged Lijm-R tags kunnen leveren macromoleculaire gasten zoals quantumdots (QDs) evenals kleine-molecuul gasten. Caged Lijm-R tags kunnen uncaged met niet alleen UV-licht, maar ook twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht, dat diep in weefsel kan binnendringen.
Inleiding
De celkern, die genetische informatie draagt, is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten waaronder kanker en genetische stoornissen van1,2,3. Voor nucleaire levering van drugs, vervoeging van peptide tags zoals nucleaire localisatie signalen (NLS)4,5,6 grote schaal is onderzocht. Ter beperking van ongewenste bijwerkingen hebben, is echter de spat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van gasten met gekooidelijm-R Tags
- Bereid Cagedlijm-NBD-oplossing.
- Synthetiseren Cagedlijm-NBD (Figuur 1) na de procedures eerder beschreven20.
- Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-NBD (10 mM) in droge dimethylsulfoxide (DMSO).
Opmerking: Bewaar de stockoplossing in donker. De oplossing kan worden verdund met waterige buffers of cel-cultuur-media bij gebruik.
- Bereid Cagedlijm-QD-oplossing.
- Synthetiseren Cagedlijm-dibenzocylooctyne (Cagedlijm-DBCO) (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor photoirradiation, Hep3B cellen geïncubeerd met Cagedlijm-NBD tentoongesteld punctate fluorescentie emissie van hun interieur (λext = 488 nm; Cijfers 4A en 4 C, groen). Een analoge opname werd verkregen na excitatie bij 543 nm voor rood-fluorescerende kleurstof (cijfers 4B en 4 C, rode), die aangeeft dat Cagedlijm-NBD gelokaliseerd in de Endosomen. Dienoveree.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vorige onderzoeken van licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern hebben bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. Zoals eerder vermeld, vereisen deze methoden additionele technieken te nemen de NLS-gelabelde proteïnen in het cytoplasma. Onze Cagedlijm-R tag kan daarentegen niet alleen foto-geïnduceerde nucleaire translocatie, maar ook cellulaire opname van de gasten. Deze functie van de Caged
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen het centrum voor NanoBio integratie, de Universiteit van Tokio. Dit werk was ondersteund door de Grant-in-Aid voor de wetenschappers (B) (26810046) van de jonge aan K.O. en slechts gedeeltelijk ondersteund door Grant-in-Aid speciaal bevorderd onderzoek (25000005) naar T.A. R.M. bedankt de Research Fellowships van Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS ) voor jonge wetenschappers en het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (GPLLI).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| Geregenereerde cellulose membraan (MWCO 3.500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Geregenereerde cellulose membraan (MWCO 25.000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B-cellen | ATCC | HB-8064 | |
| 8-kamerige glazen substraat | Nunc | 155411JP | |
| 96-wells kweekplaat | Nunc | 167008 | |
| Eagle's minimaal essentieel medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Dulbecco's fosfaat buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Confocal laser scanning microscoop | Carl-Zeiss | LSM 510 | Uitgerust met twee-foton excitatielaser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
| Confocal laser scanning microscoop | Leica | TCS SP8 | |
| Xenon lichtbron | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Microplaat reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
Referenties
- Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
- Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
- Verma, I. M., Weitzman, M....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
