Met behulp van Robotic systemen te verwerken en Embed Colon lymfkliertest monsters voor histologisch Analyses

Summary

Gebrek aan standaardisatie voor lymfkliertest bewerking vermindert de kwaliteit van lymfkliertest histopathologisch analyse ten opzichte van menselijke specimens. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van histopathologisch onderzoek van lymfkliertest ontstoken en uninflamed Colon weefsels te tonen van de haalbaarheid van robotic systemen routinematig gebruikt voor het verwerken en menselijke specimens te embedding.

Abstract

Het begrip van ziekten bij de mens is zeer uitgebreid dankzij de studie van diermodellen. Histopathologisch evaluatie van experimentele modellen moet echter zo streng zijn als die toegepast voor menselijke specimens. Inderdaad, betrouwbare en nauwkeurige conclusies te trekken is kritisch beïnvloed door de kwaliteit van het weefsel sectie voorbereiding. Hier beschrijven we een protocol voor histopathologisch analyse van lymfkliertest weefsels die verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de procedure, vanaf de eerste voorbereiding implementeert tot de paraffine inbedding van de lymfkliertest monsters. De vermindering van de methodologische variabelen door middel van strenge protocol standaardisatie van geautomatiseerde procedures draagt bij tot meer algemene betrouwbaarheid van lymfkliertest pathologische analyse. In het bijzonder dit protocol beschrijft het gebruik van geautomatiseerde verwerking en insluiten Robotsystemen, routinematig gebruikt voor de verwerking van het weefsel en paraffine inbedding van menselijke specimens, voor het verwerken van lymfkliertest specimens van darmontstekingen. We concluderen dat de betrouwbaarheid van het histopathologisch onderzoek van lymfkliertest weefsels aanzienlijk is verhoogd bij invoering van gestandaardiseerde en geautomatiseerde technieken.

Introduction

In de afgelopen decennia zijn verschillende experimentele modellen ontwikkeld om te ontleden de pathogene mechanismen die leiden tot ziekten bij de mens^1,2. Om te beoordelen van de ernst van een ziekte, moeten onderzoekers evalueren het effect van een behandeling en bestuderen de cytologische en histologische architecturale variaties of het bedrag van ontsteking³. Wilt uitvoeren op deze experimentele modellen, zijn gedetailleerde histopathologische analyses nodig, vaak vergelijken lymfkliertest en menselijke monsters^4,5.

Bovendien, menselijke specimens worden meestal verwerkt en scoorde door histopathologie kern faciliteiten en ervaren menselijke pathologen via gestandaardiseerd histopathologisch criteria en methoden. Omgekeerd, lymfkliertest weefsels zijn meestal vaste, ingesloten en geanalyseerd door onderzoekers met weinig ervaring van histopathologische protocollen. De kwaliteit en betrouwbaarheid van histopathologisch onderzoek begint met de voorbereiding van hoogwaardige weefselsecties. Verschillende factoren bijdragen kritisch tot de verhoging of verlaging van de kwaliteit van de uiteindelijke analyse, met inbegrip van fixatie, macroscopische afdelen, verwerking, paraffine insluiten, en inbedding van de monsters^6,7.

Alle deze passages met betrekking tot manipulatie van het monster zijn onderworpen aan handmatige fouten, met inbegrip van handmatige inbedding van de monsters en, in mindere mate, handmatige microtoom segmenteren en kleuring. Op dit moment berust het hele proces van lymfkliertest weefsel voorbereiding voor histologisch evaluatie op protocollen die van laboratorium tot laboratorium variëren en handmatige protocollen. Het doel van deze studie is om gestandaardiseerde geautomatiseerde protocollen om fouten en variabiliteit in lymfkliertest histopathologisch onderzoek te verminderen.

Om onze kennis beschrijven we hier de eerste protocollen voor volledig geautomatiseerde weefsel verwerking en insluiten voor de histologische evaluatie van lymfkliertest weefsels; deze worden routinematig gebruikt in pathologie eenheden voor de analyses van menselijke specimens. Een praktisch voorbeeld van de haalbaarheid van de methode, een lymfkliertest model van darmontstekingen heeft zijn geanalyseerd, dat wil zeggen, de chronische colitis model veroorzaakt door herhaalde toediening van dextran natriumsulfaat (DSS) in het drinkwater^{8 ,9}. Deze experimentele instelling nauw lijkt op menselijke ontstoken darm ziekten (IBD)¹⁰ aangezien DSS-behandelde dieren tekenen van darmontstekingen, bijvoorbeeld gewichtsverlies, losse ontlasting of diarree en verkorting van de dikke darm, alsmede fibrose ^{vertonen 8,9,11}. Zoals opgemerkt voor menselijke IBD patiënten, DSS behandeling genereert een complexe ziekte-cursus. In dit verband, uitgebreide histologische evaluaties dienen te begrijpen van de ingrijpende wijziging van de architectuur van het weefsel. Dus, de uitvoering van de beschreven protocollen voor het verhogen van de sample voorbereiding kwaliteit zouden kunnen profiteren van onderzoekers afhankelijk van de interpretatie van histologische en immunohistochemische analyseert voor lymfkliertest experimentele instellingen. Lymfkliertest experimentele modellen van ziekten bij de mens met betrekking tot wijzigingen van de architectuur van weefsel, de aanwezigheid van cellulaire weefsel infiltreren of ontsteking in verschillende weefsels en organen (darm, lever, hersenen, huid) kon gebruiken de betere kwaliteit van de bereiding van de monsters voor histopathologisch onderzoek.

Protocol

Dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van gezondheid (Auth. 127/15, 27/13) en volgde de dierenverzorgers richtsnoeren van het Europees Instituut voor oncologie IACUC (gebruik Comité en institutionele dier zorg)

1. chronische Colitis inductie door repetitieve DSS administratie

1. Aparte leeftijd en geslacht gematched muizen in 2 groepen (behandeling DSS vs. controle H₂O, ten minste 5 muizen nestgenoten per experimentele groep).
2. Beheren van 2,5% DSS (40 kDa) in het drinkwater voor 7 dagen voor de behandelde groep en de controlegroep water.
   Opmerking: Dit model induceert een chronische Transmurale darmontstekingen⁹.
3. Na 7 dagen, stop DSS behandeling en water geven in beide groepen voor 14 dagen. Herhaal dit proces 3 keer.
   Opmerking: Herhaalde toediening van DSS induceert wijzigingen van het Colon mucosa vertonen met menselijke IBD, dat wil zeggen, fibrose⁹.
4. Offeren muizen volgens de procedures die zijn geautoriseerd door de institutionele IACUC, d.w.z., bij CO₂ inademing.
5. Open de muis buik en buikvlies met een scalpel.
   Opmerking: Steriliteit is aanbevolen maar niet strikt noodzakelijk.
6. De dikke darm van de dunne darm scheiden met pincet en pincet. Accijnzen van de dikke darm met pincet en pincet.
   Opmerking: Colon lengte meting (figuur 1A) is een methode om te bepalen als colitis voorkwam in muizen DSS-behandeld.
7. Spoelen van de dikke darm in een petrischaal met 10 mL koude 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) en zachtjes druk op verwijderen fecaal materiaal.

2. lymfkliertest weefsels fixatie

1. Onderdompelen van elk lymfkliertest specimen van de dikke darm in 10 mL 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) op RT (kamertemperatuur).
   Opmerking: Steriliteit is aanbevolen maar niet strikt noodzakelijk.
2. Vaststellen van het weefsel voor 18 – 24 h op RT.

3. Colon segmenteren en weefsel voorbereiding

1. Verwijderen van vaste weefsels van de NBF container met een kleine pincet en leg ze in een petrischaal. De dikke darm zetten met een vectorafbeeldingsbestanden werk-plaat met een kleine pincet.
2. Dubbele punten in fragmenten (0,2 cm tot 0,3 cm lengtes) met een steriel scalpel gesneden. De lengte van dit fragment is optimaal om niet hoger zijn dan de dikte van de cassette.
3. Een dikke darm segment halen met een kleine pincet (figuur 2A). Invoegen een dubbelpunt segment tot de plastic uitstekende tips van de georiënteerde paraffine insluiten cassette met kleine pincet (figuur 2B).
4. Herhaal de handeling (3.2 – 3.3) met een extra 3 dikke darm segmenten per cassette. Vermijd de segmenten invoegen in aangrenzende uitstekende tips, om het minimaliseren van de samenloop van de weefsels
5. Strak vlakbij de cassette zorgvuldig duwen de vier randen (figuur 2C). Vermijd knijpen het weefsel om weefselschade te voorkomen.
6. Het raster in een kunststof ondersteunend frame invoegen. Label de ondersteunend frame ter identificatie van het monster. Herhaal voor elke biologische steekproef.

4. de weefsels Processing

1. De geautomatiseerde processor inschakelen door te drukken van de knoop van de macht (figuur 3A, 3B).
2. Warm up for 1 h om paraffine smelten. Wacht totdat het instrument dat de paraffine is volledig gesmolten bevestigt, door het observeren van de aanwezigheid van het specifieke pictogram (Figuur 3 c).
3. Elke georiënteerde cassette (met de specimens weefsel) handmatig invoegen op de metalen mand geboden door de geautomatiseerde processor (figuur 3D). Plaats de cassettes verticaal door de voering ze dicht bij de ene naar de andere voor het optimaliseren van de bezetting van de mand.
4. Sluit de metalen mand (figuur 3E).
5. Open het deksel van de retort (figuur 3F). De retort is de plek waar de mand wordt ingevoegd in de machine. Plaats de mand in de speciale behuizing van de processor (Figuur 3 g). Sluit het deksel van de retort (Figuur 3 H).
6. Gebruik het scherm van de aanraking op de computer van het instrument om te definiëren het protocol werken (figuur 3I). Kies de volgorde van de oplossingen, timing en temperatuur moeten worden uitgevoerd volgens de regeling in tabel 1.
7. Het protocol moet worden uitgevoerd op de retort met de mand door te klikken op het pictogram (figuur 3J) van specifieke computer toewijzen. Het protocol start door te klikken op de Knop Start (Figuur 3 L).
8. Wacht totdat het instrument het einde van het protocol, bevestigt door het observeren van de aanwezigheid van het specifieke pictogram en door te luisteren naar de alarmtoon uit de machine.
9. Open het deksel retort. Verwijder de mand van de processor (Figuur 3 M).

5. de weefsels insluiten

1. De geautomatiseerde embedder inschakelen door te drukken van de knoop van de macht (figuur 4A).
2. Warm up for 1 h om paraffine smelten. Wacht totdat het instrument dat de paraffine is volledig gesmolten bevestigt door het observeren van de temperatuur van de Paraffinebad aangegeven door de interne thermometer van het instrument.
3. Handmatig overbrengen alle de verwerkte cassettes uit de korf processor het embedder-rack. Elk rack kan maximaal 32 cassettes bevatten. (Figuur 4B, 4 C).
4. Open het deksel van de belangrijkste embedder (figuur 4C, 4 D, 4E).
5. Het touchscreen op de instrument-computer gebruiken om het signaal naar de robotic systeem dat een rek wordt ingevoegd (figuur 4F).
6. Open het deksel behuizing inlaat (Figuur 4 g). Plaats het rek in de inlaat behuizing. Elke embedder kan gelijktijdig maximaal 4 rekken bevatten (Figuur 4 H, 4I). Het deksel dicht doet inlaat huisvesting (figuur 4J).
7. Het scherm van de aanraking op de instrument-computer gebruiken om te beginnen de insluiten procedure, volgens tabel 2 (Figuur 4 K).
   Opmerking: Elk rack van 32 cassettes duurt 45 min moet worden ingesloten.
8. Wacht totdat het instrument het einde van het protocol, bevestigt door het observeren van de aanwezigheid van het specifieke pictogram (Figuur 4 L).
9. Verwijder het stopcontact rek (Figuur 4 M). Sluit het deksel van de belangrijkste embedder.
10. Verwijder de ingesloten blokken (met de afdrukstand rasters) uit het rek. Overdracht van de ingesloten blokken in een kartonnen opbergdoos.

6. micrometer segmenteren

1. De koeling plaat van de microtoom inschakelen. De temperatuur tussen -8 en -10 ° C.
2. Zet de thermostaat waterbad van de microtoom, met 2 L gedestilleerd water. Stel de temperatuur van het waterbad tussen 42-45 ° C.
3. Plaats de paraffine ingesloten blokken op de koeling plaat. Wacht ten minste 5 min zodat de blokken om te koelen.
4. Neem een huizenblok van de koeling plaat en plaats het in de microtoom blok houder.
5. Stel de microtoom dikte 10 µm. Trim het blok door het snijden van het 6 keer bij 10 µm dikte snijden.
6. Wijzig de instelling van de dikte van de microtoom van 10 µm 3 µm. Cut één 3 µm sectie voor haematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
7. Het verzamelen van de sectie 3 µm met een kleine borstel. Zet de 3 µm-sectie in het waterbad, het zorgvuldig leggen op het wateroppervlak te weefsel rimpels verminderen. De weefselsectie van het thermostatisch gecontroleerde waterbad verzamelen op een enkele glasplaatje.
   1. Indien nodig, snijden extra secties.
8. Label het glasplaatje door het schrijven van de identificatie van het monster.
9. Zet de dia's in een oven van 37 ° C gedurende ten minste 10 minuten.
10. Glas dia's gestoken door rekken voor onmiddellijke analyses of in opslag vakken.

7. de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring

1. Schakel in de geautomatiseerde stainer door de power-knop te drukken. Laat de initialisatie van de robotarm, door het observeren van de verandering van de laden bar op de monitor van het instrument.
2. De glas-dia's in de stainer rack, verticaal maximaal 30 dia invoegen.
3. Label het rek met de juiste radiofrequentie-identificatie (RFID) kunststof tag. RFID-tagging is een systeem voor het identificeren van de juiste kleuring protocol in de stainer computer geladen.
4. Plaats het rek in het brandschilderen. Toestaan dat de computer automatisch laden en start het kleuring protocol volgens de erkenning van de RFID-tag.
   Opmerking: Het protocol voor H & E kleuring wordt beschreven in tabel 3.

8. immunohistochemische kleuring

1. Immunohistochemische en Mallory trichrome kleuring zoals eerder beschreven⁷uitvoeren.

Results

Experimentele chronische colitis geïnduceerd door herhaalde toediening van DSS in het drinkwater is een lymfkliertest model van darmontstekingen vertonen met menselijke IBD^8,9. Figuur 1 beschrijft de effecten van DSS behandeling, met inbegrip van de dikke darm verkorten (figuur 1A), een veel gebruikte parameter te scoren de aanwezigheid van DSS-geïnduceerde ontsteking en ...

Discussion

Wij gebruiken verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de bereiding van lymfkliertest weefsels histopathologische analyseren. Dit protocol heeft tot doel technische tips om de reproduceerbaarheid en de standaardisatie van het hele proces, dus de verbetering van de algehele kwaliteit van de eindevaluatie histopathologisch te verhogen. Wij geautomatiseerde instrumenten en methoden voor de voorbereiding en de inbedding van weefsels, routinematig gebruikt in pathologie kern voorzieningen voor de studie van menselijke s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol anhydrous	Carlo Erba	414605	reagens
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L	reagens
Aluminium Potassium Sulfate	SIGMA	A6435	reagens
Aniline Blue	SIGMA	415049	reagens
carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	reagens
CD11b (clone M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	antilichaam
CD20 IHC (clone SA275A11)	Biolegend	150403	antilichaam
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	antilichaam
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	antilichaam
CD45.2 (clone 104)	BioLegend	109837	antilichaam
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	antilichaam
Citrate Buffer pH 6 10x	SIGMA	C9999	reagens
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	reagens
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	reagens
DSS	TdB Consultancy	DB001	reagens
EDTA	SIGMA	E9884	reagens
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent	DAKO		inbegrepen in GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		inbegrepen in GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		inbegrepen in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		inbegrepen in GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	reagens
F4/80 (clone BM8)	BioLegend	123108	antilichaam
Formalin	PanReac	2,529,311,215	reagens
glacial acetic acid	SIGMA	71251	reagens
Goat-anti-Rat-HRP	Agilent DAKO	P0448	antilichaam
Haematoxylin	DIAPATH	C0303	reagens
LEICA Rotary microtome (RM2255)	Leica	RM2255	apparatuur
Ly6g (clone 1A8)	BD Biosciences	551459	antilichaam
Mercury II Oxide	SIGMA	203793	reagens
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	reagens
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	reagens
Orange G	SIGMA	O3756	reagens
Paraffin	Sakura	7052	reagens
Peloris	LEICA		apparatuur
Percoll	SIGMA	P4937	reagens
RPMI 1640 without L-Glutamine	Microgem	L0501-500	reagens
STS020	Leica		apparatuur
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette	SAKURA	7022	apparatuur
Tissue-Tek Automated paraffin embedder	Sakura		apparatuur
Xylene	J.T.Baker	8080.1000	reagens