Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Extracellulaire en circulerende RNAs (exRNA) worden geproduceerd door vele celtypes van het lichaam en in talrijke lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, plasma, serum, melk en urine bestaan. Een subset van deze RNAs zijn de posttranscriptional regelgevende instanties – microRNAs (miRNAs). Om de miRNAs geproduceerd door specifieke celtypes af te bakenen, in vitro cultuur systemen kunnen worden gebruikt om te oogsten en profiel exRNAs afgeleid van een subset van de cellen. De secreted factoren van mesenchymale stamcellen zijn betrokken bij het verlichten van talrijke ziekten en wordt gebruikt als het modelsysteem van in-vitro hier. Deze paper beschrijft het proces van collectie, zuivering van kleine RNA en bibliotheek generatie reeks extracellulaire miRNAs. ExRNAs van voedingsbodems verschillen van cellulaire RNA door lage input monsters van RNA, waarin wordt gepleit voor geoptimaliseerde procedures. Dit protocol biedt een uitvoerige gids voor kleine exRNA sequencing van voedingsbodems, met kwaliteitscontrole controlepunten bij elke stap tijdens de zuivering van de exRNA en de sequencing.
Inleiding
Extracellulaire en circuleren RNAs (exRNAs) zijn aanwezig in de verschillende lichaamsvloeistoffen en resistent zijn naar RNases1,2. Hun hoge overvloed, de stabiliteit en het gemak van toegankelijkheid zijn aantrekkelijk voor klinische beoordeling als diagnostische en prognostische markeringen3. De wijze van vervoer voor exRNAs omvatten extracellulaire blaasjes (EVs), vereniging met lipoproteïnen (zoals high-density lipoprotein; HDL) en ribonucleoprotein complexen (zoals met Argonaute2 complexen)4.
Een subset van exRNAs zijn microRNAs ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Mesenchymale stamcellen groeimedium (MSC media) bereid is vooraf zoals aangegeven in de Tabel van materialen.
1. de celkweek
Opmerking: Menselijke mesenchymale stamcellen kan worden verkregen uit het beenmerg, adipeus weefsel of andere bronnen11. U kunt ook kunnen hMSCs gekocht worden via een leverancier. De BMSCs gebruikt in dit protocol werden afgeleid van het beenmerg van de patiënt en gekocht van een bedrijf.
- 1 x 106 BMSCs in een maatkolf van de T175 met 20 mL MSC media ontdooien. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De in dit protocol beschreven methode is geoptimaliseerd voor het verzamelen van exRNA van MSC cultuur voor de volgende generatie sequencing. De algemene regeling van de workflow is in Figuur 1 aan de linkerkant en de respectieve kwaliteitscontrole controlepunten zijn aan de rechterkant.
De morfologie van de cellen op de dag van inzameling voor gedifferentieerdeproductie (Figuur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een protocol voor de volgende generatie sequentiebepaling van exRNAs waarmee differentiële expressie analyses van lage input monsters. Vasthouden aan een specifiek protocol voor EV en exRNA isolatie is belangrijk omdat zelfs kleine veranderingen (dat wil zeggen, de ultracentrifugatie stap of een verandering in de rotor type) invloed op transcriptome uitoefenen kunnen en miRNA niveaus13,14. Dus, ongeacht hoe de exRNA geïsoleerd is, is het belan.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij zijn dankbaar aan Mr. Claus Bus en mevrouw Rita Rosendahl op iNANO voor hun technische bijstand. Speciale dank aan Dr. Daniel Otzen voor het toestaan van het frequente gebruik van zijn ultracentrifuge. Deze studie werd gesteund door het innovatiefonds Denemarken (MUSTER-project).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Knoglemerg-afgeleide mesenchymale stamcellen | ATCC | PCS-500-012 | Cellen gebruikt in dit protocol zijn gekocht van ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Aangeduid als mesenchymale stamcelgroeimedium (MSC-media) |
| Exosomen-gedepleteerde FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA verzamelmengsel: MSCGM maar met de FBS vervangen door exosomen-gedepleteerde FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833.912 | |
| Penicilline-Streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| Fosfaatbufferoplossing | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonaatfles met dopsamenstelling | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor gebruikt hier | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Celteller |
| β-glycerofosfaat | Calbiochem | 35675 | Componenten van het osteogene differentiatiemedia |
| Dexamethason | Sigma | D4902-25MG | Componenten van het osteogene differentiatiemedia |
| 2-Fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout | Sigma | 49752-10G | Componenten van het osteogene differentiatiemedia |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Componenten van het osteogene differentiatiemedia |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA en totale RNA-zuiveringset voor stap 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-gebaseerde capillaire elektroforesemachine en chips voor RNA- en DNA-analyse |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-gebaseerde capillaire elektroforesemachine en chips voor RNA- en DNA-analyse |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-gebaseerde capillaire elektroforesemachine en chips voor RNA- en DNA-analyse |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Bibliotheekkwantificeringskit gebruikt hier |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Kleine RNA-bibliotheekvoorbereidingskit gebruikt in dit protocol - gebruikt in stap 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Geautomatiseerde DNA-gelextractor gebruikt in dit protocol; handmatige extractie kan ook worden uitgevoerd | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR-zuivering in stap 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimmen van low-quality reads in stap 6 | |
| cutadapt | Adapterverwijdering in stap 6 | ||
| Bowtie | Mapping van schone reads in stap 6 | ||
| Samtools | Om het expressieprofiel te maken in stap 6 | ||
| Bedtools | Om het expressieprofiel te maken in stap 6 |
Referenties
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circul....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
