Methodenartikel

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

DOI:

10.3791/58655

⸱

8 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire en circulerende RNAs (exRNA) worden geproduceerd door vele celtypes van het lichaam en in talrijke lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, plasma, serum, melk en urine bestaan. Een subset van deze RNAs zijn de posttranscriptional regelgevende instanties – microRNAs (miRNAs). Om de miRNAs geproduceerd door specifieke celtypes af te bakenen, in vitro cultuur systemen kunnen worden gebruikt om te oogsten en profiel exRNAs afgeleid van een subset van de cellen. De secreted factoren van mesenchymale stamcellen zijn betrokken bij het verlichten van talrijke ziekten en wordt gebruikt als het modelsysteem van in-vitro hier. Deze paper beschrijft het proces van collectie, zuivering van kleine RNA en bibliotheek generatie reeks extracellulaire miRNAs. ExRNAs van voedingsbodems verschillen van cellulaire RNA door lage input monsters van RNA, waarin wordt gepleit voor geoptimaliseerde procedures. Dit protocol biedt een uitvoerige gids voor kleine exRNA sequencing van voedingsbodems, met kwaliteitscontrole controlepunten bij elke stap tijdens de zuivering van de exRNA en de sequencing.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire en circuleren RNAs (exRNAs) zijn aanwezig in de verschillende lichaamsvloeistoffen en resistent zijn naar RNases1,2. Hun hoge overvloed, de stabiliteit en het gemak van toegankelijkheid zijn aantrekkelijk voor klinische beoordeling als diagnostische en prognostische markeringen3. De wijze van vervoer voor exRNAs omvatten extracellulaire blaasjes (EVs), vereniging met lipoproteïnen (zoals high-density lipoprotein; HDL) en ribonucleoprotein complexen (zoals met Argonaute2 complexen)4.

Een subset van exRNAs zijn microRNAs (miRNAs), die kleine niet-coderende RNAs van ongeveer 22 nt die regelen posttranscriptional genexpressie. Ex-miRNAs zijn betrokken bij de cel-cel communicatie en regulering van de cel homeostase5. Bijvoorbeeld, HDL ex-miR-223 levert aan endotheliale cellen te onderdrukken intercellulaire adhesie molecuul 1 (ICAM-1) en ontsteking6. MiR-223 is interessant, ook tijdens het vervoer door extracellulaire blaasjes uit leukocyten aan Long kankercellen, programmering te nemen op een meer invasieve fenotype7gezien. Transcriptome van ex-miRNAs van de verschillende lichaamsvloeistoffen en cel kweekmedium zal dus aanzienlijk verbeteren ons begrip van ex-miRNA signalering.

Kleine RNA sequencing (kleine RNA seq) is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om te begrijpen de transcriptomics van kleine RNAs. Niet alleen kunnen verschillende steekproeven onder differentially uitgedrukte bekende RNAs worden vergeleken, maar nieuwe kleine RNAs kunnen ook worden gedetecteerd en gekenmerkt. Het is bijgevolg ook een robuuste methode te identificeren differentially uitgedrukte miRNAs onder verschillende omstandigheden. Echter, een van de horden voor kleine RNA seq is de moeilijkheid bij het genereren van kleine RNA seq bibliotheken van lage exRNA input vloeistoffen zoals cerebrospinaal vocht, speeksel, urine, melk, serum en kweekmedia. Het TruSeq kleine RNA bibliotheek Prep-protocol van Illumina vereist ongeveer 1 microgram van totaal RNA van hoge kwaliteit en het instellen van NEBNext kleine RNA bibliotheek Prep protocol van New England Biolabs vereist 100 ng-1 µg van RNA8,9. Vaak, totaal RNA van deze monsters zijn onder de detectiegrens voor conventionele UV-vis spectrofotometers.

Ex-miRNAs afgeleid van lichaamssappen zijn potentieel goede prognostische en diagnostische markers. Echter, om de functionele gevolgen te bestuderen of om te bepalen van de oorsprong van bepaalde ex-miRNAs, cel cultuur systemen worden vaak gebruikt in plaats daarvan. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn uitvoerig bestudeerd omdat hun EVs zijn betrokken bij het verlichten van vele ziekten met inbegrip van myocardinfarct, ziekte van Alzheimer en graft versus host ziekte10. Hier tonen we de zuivering van ex-miRNAs van beenmerg-afgeleide MSCs (BMSCs) en de specifieke stappen gebruikt om kleine RNA bibliotheek constructie, sequencing en data-analyse (Figuur 1) te optimaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Mesenchymale stamcellen groeimedium (MSC media) bereid is vooraf zoals aangegeven in de Tabel van materialen.

1. de celkweek

Opmerking: Menselijke mesenchymale stamcellen kan worden verkregen uit het beenmerg, adipeus weefsel of andere bronnen11. U kunt ook kunnen hMSCs gekocht worden via een leverancier. De BMSCs gebruikt in dit protocol werden afgeleid van het beenmerg van de patiënt en gekocht van een bedrijf.

  1. 1 x 106 BMSCs in een maatkolf van de T175 met 20 mL MSC media ontdooien. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en vervangen de media elke 2-3 dagen tot 80% confluentie.
  2. Spoel de cellen met 5 mL 1 x PBS en negeren de PBS.
  3. Loskoppelen van de cellen door toevoeging van 5 mL van 0,05% trypsine-EDTA en incuberen de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik op de zijkanten van de kolf te vergemakkelijken detachement.
  4. Voeg toe 15 mL MSC media inactivering van de trypsine, loskoppelen van de cellen van het oppervlak, en Pipetteer op en neer voor het verkrijgen van eencellige schorsingen.
  5. Het verzamelen van de cellen in een tube 50 mL en spin down voor 5 min op 300 x g tot pellet van de cellen.
  6. Resuspendeer de cellen in 1 mL MSC media en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
    Opmerking: Primaire menselijke beenmerg MSCs op 80% confluentie in de kolf van een T175 is ongeveer 2 x 106 cellen.
  7. Plaat hMSCs op 2.000 cellen/cm2 in verse MSC media in 5 T175 kolven. De cellen bij 37 ° C met 5% CO2 groeien en vervangen de media om 2-3 dagen tot 5 maatkolven van 90% confluente T175 kolven worden verkregen.

2. EVs en RNA-geassocieerde biomoleculen collectie

Opmerking: EV collectie media is vooraf bereid (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium [DMEM] met het foetale runderserum [FBS] 10% en 1% penicilline/streptomycine [P/S]). EV collectie media is normale MSC media, maar bereid met commerciële EV-verarmd FBS (Tabel van materialen). Dit is het voorkomen van boviene exRNA verontreiniging van FBS, waarin normaal exRNAs EVs, ribonucleoproteins en lipoproteïnen is gekoppeld. Voor kleine RNA bibliotheek voorbereiding, zijn exRNAs afgeleid van 5 confluente maatkolven van MSCs vereist om de bouw van de bibliotheek.

  1. Wassen van de cellen 3 x met 20 mL PBS per T175 kolf. Voeg 20 mL EV collectie media per confluente T175 kolf van MSCs en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
  2. Verzamelen van de media en centrifugeer de media voor 10 min bij 300 x g - en 4 ° C.
  3. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en centrifugeer de media voor 20 min op 2.000 x g - en 4 ° C.
  4. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en centrifugeer de media voor 30 min bij 15.500 x g - en 4 ° C. Vervolgens verzamelen de bovendrijvende substantie.
  5. De media overbrengen ultracentrifuge buizen- and -pellet van de exRNAs voor 90 min op 100.000 x g - en 4 ° C. Een vaste hoek rotor is hier gebruikt en de pellet wordt verankerd aan de kant van de buis. Mark van de kant van het deksel en teken een cirkel aan de kant van de buis waar de pellet wordt verwacht.
  6. Verwijder het supernatant, droog de binnenkant van de buis door het omkeren van de buis op absorberend papier en gebruik van kleine stukjes van absorberend papier te verwijderen van de vloeistof in de buis zonder het aanraken van de onderkant van de buis. Resuspendeer de pellet in 200 μL van PBS van vortexing voor 30 s en pipetteren op en neer 20 x.
  7. Beoordeling van de EVs en biomoleculen met nanoparticle voor het bijhouden van analyse (NTA) (Figuur 2).
    Opmerking: De EVs en biomoleculen kan worden beoordeeld met nanoparticle bijhouden analyse (NTA), Dynamische lichtverstrooiing (DLS) of Transmissie Electronenmicroscopie (TEM)12.
  8. Bewaren de EVs en biomoleculen bij-80 ° C tot verder stroomafwaarts experimenten.
    Opmerking: Als EVs worden gebruikt voor functionele studies gaat, 20% glycerol moet worden toegevoegd om hen te beschermen van bezwijken. De cellen kunnen worden verzameld met behulp van standaardprocedures indien nodig.

3. EVs en RNA-geassocieerde biomoleculen collectie van gedifferentieerde cellen

Opmerking: EVs en RNA verbonden biomoleculen kan ook worden verzameld uit de cel voedingsbodems terwijl de cellen ondergaan differentiatie. Het voorbeeld afgebeeld in het protocol wordt beschreven osteoblastic differentiatie en exRNA collectie op dag 0 en 7 van differentiatie. Als geen differentiatie vereist is, dan slaat u sectie 3 en gaat u naar sectie 4.

  1. Osteoblastic differentiatie media voorbereiden (DMEM met 10% FBS, 1% P/S 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM dexamethason, 50 μM ascorbaat-2-fosfaat en 10 mM 1,25-vitamine-D3) vers elke keer.
  2. Zodra MSCs 80% heuvels zijn, omzetten in de media MSC osteoblastic differentiatie media.
  3. Vullen de osteoblastic differentiatie media na 2-3 dagen.
  4. Op dag 5 van differentiatie, verwijder het medium en wassen van de cellen 3 x met 20 mL PBS per T175 kolf.
  5. Voeg 20 mL EV collectie media met 10 mM β-glycerophosphate, 10 nM dexamethason, 50 μM ascorbaat-2-fosfaat en 10 mM 1,25-vitamine-D3 per confluente T175 kolf van MSCs. de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 48 uur om ervoor te zorgen bleef Incubate differentiatie en verzamel de EVs en biomoleculen.
  6. Verzamelen van de media op dag 7 en overgaan tot het isoleren van de EVs en biomoleculen zoals beschreven in stappen 2.2-2.6.
  7. Voor kwaliteitscontrole, seed cellen in 96-wells- of 6-putten te beoordelen van de differentiatie met behulp van een alkalische fosfatase (ALP) activiteit bepaling of met kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), respectievelijk.
    Opmerking: Figuur 3 is een voorbeeld waaruit blijkt osteogenic differentiatie van de cellen.

4. RNA extractie en kwaliteitscontrole

  1. Ontdooi monsters uit stap 2.8 op ijs. Uittreksel RNA met behulp van een RNA isolatie kit (Tabel van materialen).
  2. Elueer RNA van de kolom waarin de RNA isolatie kit (Tabel van materialen) in 100 μl RNase-gratis water.
  3. Concentreren het RNA door ethanol neerslag door het toevoegen van 1 μL van glycogeen, 10 μL van 2 M pH 5.5 natriumacetaat en 250 μL van vooraf gekoeld 99% ethanol in 100 μl van gezuiverde RNA.
  4. Incubeer de monsters bij-20 ° C's nachts te precipiteren van RNA. Het RNA pellet door centrifugeren voor 20 min op 16.000 x g - en 4 ° C.
    Opmerking: De pellet is wit als gevolg van co precipitatie met glycogeen.
  5. Verwijder het supernatant en wassen van de RNA-pellet met 1 mL van 75% ethanol. Pellet RNA weer voor 5 min op 16.000 x g - en 4 ° C.
  6. Verwijder de ethanol en laat het deksel van de RNA-buis open gedurende 5-10 minuten in de lucht droog de RNA-pellet. Resuspendeer de pellet RNA in 7 μL van RNase-gratis water.
  7. Controleer de kwaliteit van RNA en de concentratie een capillaire elektroforese chip gebaseerde machine met behulp van het RNA volgens de fabrikant protocol vóór de bouw van de bibliotheek.
    Opmerking: Een representatieve grootteverdeling van het RNA wordt weergegeven in Figuur 4.
  8. Uittreksel cellulaire RNA met behulp van een commerciële zuivering kit (Tabel of Materials), indien nodig.

5. bibliotheek bouw en kwaliteitscontrole

Opmerking: Kleine RNA bibliotheken worden geconstrueerd met behulp van commerciële kits (Tabel of Materials) met aanpassingen als gevolg van de lage RNA input. Bouw van de bibliotheek wordt uitgevoerd op het gekoeld blok.

  1. Chill de verwarming blok voor 0,2 mL PCR buizen op ijs en Pipetteer 5 μL van RNA van stap 4.6 in 0,2 mL RNase-vrije PCR buizen op een koud blok.
  2. 3' adapters (1:10) verdund in RNase-gratis water in een buis van 0,2 mL RNase-gratis e-PCR. Voeg 0,5 μL van verdunde adapter en meng met 5 μL van RNA door pipetteren naar boven en beneden de 8 x en centrifuge kort voor het verzamelen van alle van de vloeistof bij de onderkant van de buis.
  3. Incubeer de RNA en 3' adapter mix bij 70 ° C gedurende 2 min. in een voorverwarmde thermische cycler en plaats vervolgens het monster terug op het gekoeld blok.
  4. 1 μL van afbinding buffer, 0,5 μL van RNase remmer en 0,5 μL van T4 RNA ligase (schrapping mutant) in het RNA en 3' adapter mengsel toevoegen. Meng door pipetteren op en neer 8 x, en kort centrifugeren.
  5. Incubeer de buis bij 28 ° C gedurende 1 uur in de voorverwarmde thermische cycler.
  6. Voeg 0,5 μL van eindeoplossing in het monsterbuisje met het verblijf in de thermische cycler buis, Meng door pipetteren op en neer 8 x en blijven broeden bij 28 ° C gedurende 15 minuten.
  7. 5' adapters (1:10) verdund in RNase-gratis water in een buis van 0,2 mL RNase-gratis e-PCR. 0,5 μL van 5' adapter toevoegen in een afzonderlijke RNase storingsvrije 0,2 mL PCR buis, warmte de adapter 5' bij 70 ° C gedurende 2 min. in de voorverwarmde thermische cycler, en plaats dan het monster op het gekoeld blok.
  8. Voeg 0,5 μL van 10 nM ATP, 0,5 μL van T4 RNA ligase aan de adapter buis 5', Meng door pipetteren op en neer 8 x en centrifugeer kort voor het verzamelen van alle vloeistoffen in de bodem.
    Opmerking: Houd de 5'-adapter op gekoeld blok zo veel mogelijk.
  9. Voeg 1,5 μl van het mengsel 5' adapter aan het monster uit stap 5.6, en meng heel zachtjes door pipetting 8 x langzaam. Incubeer het monster bij 28 ° C gedurende 1 uur in de voorverwarmde thermische cycler.
  10. RT primer 1:10 verdunnen in RNase-gratis water in een tube RNase storingsvrije 0,2 mL PCR. Voeg 0,5 μL van verdunde RT primer in het monster uit stap 5,9, meng heel zachtjes door het langzaam op en neer 8 x pipetteren en kort centrifugeren.
  11. Incubeer het monster bij 70 ° C gedurende 2 min. in de voorverwarmde thermische cycler en plaats vervolgens het monster op een koud blok.
  12. Voeg 1 μl van 5 x eerste onderdeel buffer, 0,5 μL van 12.5 mM dNTP mix, 0,5 μL van 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL van RNase remmer en 0,5 μL van reverse-transcriptase. Meng heel zachtjes door het langzaam op en neer 8 x pipetteren en kort centrifugeren.
  13. Incubeer het monster bij 50 ° C gedurende 1 uur in de voorverwarmde thermische cycler cDNA verkrijgen.
  14. 4,25 μL van ultrazuiver water, 12,5 μL van de PCR-mix, 1 μL van index primer en 1 μL van universele primer in cDNA toevoegen. Meng door pipetteren op en neer 8 x, en kort centrifugeren.
  15. Leg het monster in een thermische cycler en de cycler als volgt instellen: 98 ° C gedurende 30 s; 15 cycli van 98 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 15 s; en het einde van de cyclus met 72 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: De bereid bibliotheek kan worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende één week.
  16. Zuiveren van de RNA-bibliotheek door te scheiden van de bibliotheek op een DNA-gel en snijden van de gel (gel extractie) tussen 140 bp en 160 bp en de bibliotheek van de gel na het protocol gegeven door het bouwpakket bibliotheek eluerende.
    Opmerking: In deze studie, de bereid bibliotheek vanaf stap 5.15 is geladen op een commerciële gel (Tabel van materialen) en de bibliotheek tussen 140 bp en 160 bp is gezuiverd uit door een geautomatiseerde DNA grootte fractionator (Tabel of Materials) volgens de protocol van de fabrikant.
  17. Concentreren en wassen van de bibliotheek vanaf stap 5.16 met behulp van een kolom gebaseerde PCR zuivering kit (Tabel van materialen) en elueer de bibliotheek in 10 μL RNase-gratis water tot slot.
  18. Laden 1 μL van de gezuiverde bibliotheek naar een DNA-chip (Tabel van materialen) om te controleren van de grootte van de bibliotheek volgens protocol van de fabrikant.
  19. Verdunnen 1 μL van de gezuiverde bibliotheek (1:1000) in pH 8.0 van de 10 mM Tris-HCl met 0,05% Polysorbaat 20 en kwantificeren van de bibliotheek door qPCR met behulp van een commerciële bibliotheek kwantificering kit te kwantificeren van de concentratie van de bibliotheek met behulp van de DNA-normen in de kit.
  20. Gelijke hoeveelheden van het zwembad van de bibliotheken overeenkomstig de eisen van de machine rangschikken en de volgorde op een systeem met hoge gegevensdoorvoer sequencing.
    Opmerking: De bouw van de bibliotheek van cellulaire RNA kan worden gedaan met behulp van de dezelfde kits door volgens standaard protocol van de kits.

6. Bioinformatics pijpleiding

Nota: Dit is een in-house pijpleiding en de programma's die hier gebruikt zijn vermeld de tabel of Materials.

  1. Trim weg lage kwaliteit leest en verwijder adapter sequenties van het ruwe luidt als volgt.
  2. De schone leest toewijzen aan verschillende soorten RNAs.
    1. Aantekeningen tRNAs doordat twee incongruenties omdat de sterk veranderde tRNA-sequenties frequente basis misincorporation door reverse-transcriptase.
    2. Aantekeningen toevoegen aan miRNAs door te verwijzen naar de miRNAs van de mens van miRBase v21 waardoor nul incongruenties. Sinds miRNAs gelden A en U nontemplated 3' eind toevoegingen, sequenties die wijs niet zijn 3' ontdaan van maximaal drie A en/of T nts waarna leest zijn toegewezen aan menselijke miRNAs en andere miRNAs uit miRBase v21 waardoor nul incongruenties.
    3. Aantekeningen aan andere relevante kleine RNAs (snRNA, snoRNA, piRNA en Y RNAs) doordat een mismatch.
    4. De resterende niet-toegewezen leest aan lange datasets van RNA (rRNA, andere RNA van Rfam en mRNA) om te beoordelen van de afbraak toewijzen.
    5. Aantekeningen van de sequenties aan het menselijk genoom.
    6. Aantekeningen van de sequenties aan bacteriële genoom.
    7. Normaliseren van miRNA expressie met de volgende formule: miRNA telt / het totaal telt van alle toegewezen miRNAs) x 106.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in dit protocol beschreven methode is geoptimaliseerd voor het verzamelen van exRNA van MSC cultuur voor de volgende generatie sequencing. De algemene regeling van de workflow is in Figuur 1 aan de linkerkant en de respectieve kwaliteitscontrole controlepunten zijn aan de rechterkant.

De morfologie van de cellen op de dag van inzameling voor gedifferentieerdeproductie (Figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor de volgende generatie sequentiebepaling van exRNAs waarmee differentiële expressie analyses van lage input monsters. Vasthouden aan een specifiek protocol voor EV en exRNA isolatie is belangrijk omdat zelfs kleine veranderingen (dat wil zeggen, de ultracentrifugatie stap of een verandering in de rotor type) invloed op transcriptome uitoefenen kunnen en miRNA niveaus13,14. Dus, ongeacht hoe de exRNA geïsoleerd is, is het belan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan Mr. Claus Bus en mevrouw Rita Rosendahl op iNANO voor hun technische bijstand. Speciale dank aan Dr. Daniel Otzen voor het toestaan van het frequente gebruik van zijn ultracentrifuge. Deze studie werd gesteund door het innovatiefonds Denemarken (MUSTER-project).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Knoglemerg-afgeleide mesenchymale stamcellenATCCPCS-500-012Cellen gebruikt in dit protocol zijn gekocht van ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001Aangeduid als mesenchymale stamcelgroeimedium (MSC-media)
Exosomen-gedepleteerde FBSGibcoA2720801
ExRNA verzamelmengsel: MSCGM maar met de FBS vervangen door exosomen-gedepleteerde FBS
Trypsin-EDTAGibco25200056
T175 FlaskSarstedt833.912
Penicilline-StreptomycineGibco15140122
FosfaatbufferoplossingSigma806552
UltracentrifugeBeckman Coulter
Polycarbonaatfles met dopsamenstellingBeckman Coulter355618
Beckman Coulter Type 60 TiRotor gebruikt hier
NucleoCounterChemometecNC-3000Celteller
β-glycerofosfaatCalbiochem35675Componenten van het osteogene differentiatiemedia
DexamethasonSigmaD4902-25MGComponenten van het osteogene differentiatiemedia
2-Fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzoutSigma49752-10GComponenten van het osteogene differentiatiemedia
1α,25-Dihydroxyvitamin D3SigmaD1530-1MGComponenten van het osteogene differentiatiemedia
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA en totale RNA-zuiveringset voor stap 4.8
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1514Chip-gebaseerde capillaire elektroforesemachine en chips voor RNA- en DNA-analyse
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAChip-gebaseerde capillaire elektroforesemachine en chips voor RNA- en DNA-analyse
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Chip-gebaseerde capillaire elektroforesemachine en chips voor RNA- en DNA-analyse
KAPA Library Quantification KitsRocheKK4824Bibliotheekkwantificeringskit gebruikt hier
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)IlluminaRS-200-0012Kleine RNA-bibliotheekvoorbereidingskit gebruikt in dit protocol - gebruikt in stap 5
Pippin PrepSage ScienceGeautomatiseerde DNA-gelextractor gebruikt in dit protocol; handmatige extractie kan ook worden uitgevoerd
MinElute PCR Purification KitQiagen28004PCR-zuivering in stap 5.17
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor LabTrimmen van low-quality reads in stap 6
cutadaptAdapterverwijdering in stap 6
BowtieMapping van schone reads in stap 6
SamtoolsOm het expressieprofiel te maken in stap 6
BedtoolsOm het expressieprofiel te maken in stap 6

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184(2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292(2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498(2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA isolatieNanodeeltjes trackinganalyseEthanolprecipitatieLibraryconstructieQPCR kwantificeringHigh throughput sequencingKwaliteitscontrole controlepuntenInzameling van cultuurmedia

Gerelateerde artikelen