Een geoptimaliseerde Rhizobox Protocol bij het visualiseren van de wortelgroei en responsiviteit gelokaliseerde nutriënten

Samenvatting

Visualiseren en meten wortel groei in situ is zeer uitdagend. We presenteren een aanpasbare rhizobox methode voor het bijhouden van de ontwikkeling van de wortel en proliferatie na verloop van tijd in reactie op de voedingsstoffen verrijking. Deze methode wordt gebruikt voor het analyseren van maïs genotypische verschillen in wortel plasticiteit in reactie op een organische stikstofbron.

Samenvatting

Wortels zijn notoir moeilijk te bestuderen. De bodem is zowel een visuele en mechanische barrière, waardoor het moeilijk is om bij te houden wortels in situ zonder destructieve oogst of dure apparatuur. We presenteren een klantgerichte en betaalbare rhizobox-methode, waarmee de niet-destructieve visualisatie van wortelgroei na verloop van tijd en is bijzonder goed geschikt voor het bestuderen van wortel plasticiteit in reactie op de bron van de gelokaliseerde patches. De methode werd gevalideerd door maïs genotypische variatie in plasticiteit reacties op patches met ¹⁵N-geëtiketteerden peulvrucht residu te bepalen. Methoden worden beschreven verkrijgen representatieve developmental metingen na verloop van tijd meten wortel lengte dichtheid in resource-bevattende en controle patches, berekening van groeicijfers van de wortel, en vervolgens bepalen ¹⁵N herstel door plant roots en shoots. Voordelen, waarschuwingen en mogelijke toekomstige toepassingen van de methode worden ook besproken. Hoewel zorg men moet zich ervan vergewissen dat de experimentele omstandigheden niet wortel groeigegevens doen bias, levert het rhizobox protocol gepresenteerd hier betrouwbare resultaten indien uitgevoerd met voldoende aandacht voor detail.

Inleiding

Hoewel vaak over het hoofd gezien ten opzichte van hun bovengrondse tegenhangers, wortels spelen een cruciale rol in de plant voedingsstoffen acquisitie. Gezien de aanzienlijke koolstof kosten van wortel bouw en het onderhoud, planten geëvolueerd mechanismen voor de ontwikkeling van de wortels alleen waar foerageren is de investering waard. Wortelstelsel kan zo efficiënt en dynamisch mij resource patches door prolifererende in hotspots, upregulating tarieven van opname, en snel translocating voedingsstoffen naar het floëem voor verder vervoer¹. Plasticiteit reacties kunnen sterk verschillen tussen plant soorten of genotypen^2,3 en afhankelijk van de chemische vorm van de nutriënten betrokken^4,5. Variatie in wortel plasticiteit moet verder, als begrip complexe wortel reacties op heterogene bodem middelen zou kunnen meedelen fok- en beheerstrategieën om efficiënter nutriënten gebruik in de landbouw worden onderzocht.

Ondanks zijn noodzaak en relevantie voor begrip plant systemen plaatst visualiseren en kwantificeren van de wortel plasticiteit op relevante schalen technische uitdagingen. Opgraven van de kroon van de wortel uit de bodem ("shovelomics"⁶) is een gemeenschappelijke methode, maar fijne wortels exploiteren kleine poriën tussen de bodem aggregaten en opgraving leidt onvermijdelijk tot een zekere mate van verlies van deze kwetsbare wortels. Bovendien, destructieve oogst maakt het onmogelijk om het volgen van veranderingen in een wortelsysteem na verloop van tijd. In situ beeldvormende methoden zoals X-ray berekend tomografie directe visualisatie van wortels en bodem middelen toestaan op hoge ruimtelijke resolutie⁷, maar zijn duur en gespecialiseerde apparatuur vereist. Hydrocultuur experimenten vermijden verplichtingen in verband met de winning van wortels uit de bodem, maar wortel morfologie en het platform verschillen in waterige media ten opzichte van de mechanische beperkingen en biofysische complexiteit van bodems^8,9. Ten slotte kunnen niet rhizosfeer processen en functies worden geïntegreerd met ontwikkelingsstoornissen plasticiteit in deze kunstmatige media.

Presenteren we een protocol voor de bouw en het gebruik van rhizoboxes (smalle, duidelijke-zijdige rechthoekige containers) als een goedkope, aanpasbare methode te karakteriseren wortelgroei in de bodem na verloop van tijd. Speciaal ontworpen frames aanmoedigen wortels groeien bij voorkeur tegen het achterpaneel vanwege Geotropie, verhogen van de nauwkeurigheid van wortel lengte metingen. Rhizoboxes worden gebruikt bij het bestuderen van de wortelgroei en rhizosfeer interacties^10,11,12, maar de methode die hier gepresenteerd biedt een voordeel in de eenvoud met haar single-vaks ontwerp en goedkoop materialen, en is ontworpen om te bestuderen wortel reacties op gelokaliseerde voedingsstoffen. De methode kan echter ook worden aangepast aan het bestuderen van een aantal andere wortel en rhizosfeer processen zoals intra/interspecies concurrentie, ruimtelijke verdeling van chemische verbindingen, microben of enzymactiviteit. Hier, onderzoeken we genotypische verschillen tussen maïs hybriden in reactie op patches van ¹⁵N-geëtiketteerden peulvrucht residu en hoogtepunt representatieve resultaten te valideren van de methode rhizobox.

Protocol

1. bereiding van de voorkant en achterkant panelen en Spacers

1. De voor- en achterkant panelen voor te bereiden.
   1. Snijd twee stukken van duidelijk 0.635 cm dik acryl tot 40,5 cm breed door 61 cm lang per doos of koop voorgesneden stukjes (Zie Tabel van materialen).
   2. Met behulp van een boor ontworpen voor acryl, boorgaten 0.635 cm in diameter 1.3 cm vanaf de kant randen op 2.5, 19, 38 en 53,3 cm vanaf de bovenkant. Boorgaten 1.3 cm vanaf de onderkant op 2.5, 20,3 en 38 cm vanaf de linkerkant (Figuur 1).
      Opmerking: Het is het meest efficiënte gebruik van een boor pers voor een stack van zes tot tien bladen op een tijd, maar een hand boor kan ook worden gebruikt.
   3. Verwijder eventuele beschermende bekledingen van de acryl en voorzichtig schoon beide panelen voor het monteren van de vakken.

Figuur 1: lay-out van boorgaten. Gaten zijn geboord 1.3 cm vanaf de kant randen op 2.5, 19, 38, 53,3 cm van de bovenkant en 1.3 cm vanaf de onderkant op 2.5, 20,3 en 38 cm vanaf de linkermarge. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. De zijkant en onderkant spacers voor te bereiden.
   1. Snij drie spacers per doos van hoge-dichtheid polyethyleen (HDPE) of aankoop twee voorgesneden kant spacers (0.635 cm dik, 2,5 cm breed, 57 cm lang) en een voorgesneden onder spacer (0.635 cm dik, 2,5 cm breed, 40.5 cm lang). Zie de tabel van materialen.
   2. Hiermee lijnt u de spacers tussen de voor- en achterkant panelen langs de zijkanten en onderkant van het vak. Met behulp van een hand boor of boor press, boor door de bestaande gaten in de voorkant en weer terug, zodat de gaten alle drie lagen netjes passeren.
   3. Houd de lagen plaatsen met behulp van klemmen of door het installeren van een combinatie van bouten, moeren en sluitringen in elk nieuw geboord gat (zie stap 3.1).

2. installatie van een strook van Polyester slaan bij de bodem van de doos

Opmerking: Dit zal verhinderen bodem en water lekken via de gewrichten tussen de afstandhouders.

1. Polyester batting in 2.5 cm breed door gesneden stroken 40.5 cm lange (Zie de Tabel van de materialen).
2. Met de achterkant flat en de tussenringen bovenop liggen, leggen de beste slagman direct boven de onderkant spacer en houd hem in de plaats met de bovenzijde (Figuur 2).

Figuur 2: gemonteerd rhizobox met beste slagman. Een smalle strook van beste slagman aan de onderkant van de rhizobox voorkomt dat bodem en zand lekt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. assemblage van de Rhizoboxes

1. Monteren van de rhizoboxes met behulp van 20-draad schroeven (3,2 cm lengte van 0.635 cm diameter), wasmachines (0.635 cm interne diameter) en hex noten (formaat passen de schroeven, Zie Tabel van materialen.
2. Draai elke schroef vast door middel van een wasmachine, voorpaneel, spacer, achterpaneel, wasmachine en hex nut. Zorg ervoor dat de schroeven zijn zeer strak; Als het vak is losjes geassembleerd, zal bodem morsen uit door middel van de kloof tussen de panelen en zijkant afstandhouders.
   Opmerking: Acryl is gemakkelijk bekrast, en de krassen kan interfereren met metingen van de wortel, dus de geassembleerde vakken met zorg behandelen. Vermijd stapelen vakken tenzij beschermend materiaal wordt geplaatst tussen hen.
3. Bereiden twee patch Spoorverbreders (spacers die worden gebruikt voor het maken van de behandeling en controle patches) per doos. Gesneden afstandhouders van hoge-dichtheid polyethyleen (HDPE) bladen of koop ze pre knippen (0.635 cm dik, 3.8 cm breed, 28 cm lang; Zie Tabel van materialen). Boor een gat 0.635 cm in diameter in elke spacer, 2 cm van de bovenkant over de middellijn (Figuur 3).

Figuur 3: Patch spacers. Schroeven ingebracht via de center van HDPE-strips houd ze vallen in het vak. De rhizobox is gevuld met grond rond de afstandhouders, de bodem is wordt bevochtigd en de afstandhouders worden verwijderd zodat de lege patches van de behandeling en controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. Een schroef door elk gat met een moer te beveiligen, zodat de spacer kan worden gedeeltelijk ingevoegd in de rhizobox totdat de schroef gaan verhindert verder (Figuur 3).
   Opmerking: Wanneer de bodem is bevochtigd rond de afstandhouders en de afstandhouders worden verwijderd, twee lege ruimten zal blijven die kan gevuld worden met de passende substraten voor de stikstof bevattende behandeling patch en de patch van de controle.

4. gebouw PVC Frames ter ondersteuning van de Rhizoboxes in een hoek

Opmerking: Wanneer het vak wordt geplaatst in een hoek, Geotropie zal de wortels om te groeien tegen het achterpaneel zodat alle wortels zichtbaar voor tracering zijn. De PVC (polyvinylchloride) afmetingen in Figuur 4 resulteren in een frame die onderhoudt van de rhizobox op een ongeveer 55 ° hoek aan de Bank.

1. Knippen 13 stukken van 1,3 cm diameter PVC per doos: 2 × 44 cm lengtes, 3 × 42 cm lengtes, 2 × 36,3 cm lengtes, 2 × 25,4 cm lengtes en 4 × 3.8 cm lengtes (Zie Tabel van materialen).
   Opmerking: Een zaag hakken wordt sterk aanbevolen voor de efficiëntie en zelfs delen.
2. Gebruik 4 × 2-weg ellebogen, 2 × 3-weg ellebogen en 4 T-gewrichten (Zie Tabel van materialen) te monteren van het vak zoals weergegeven in Figuur 4.
   Opmerking: Frames moet stabiel zonder extra lijm, maar PVC lijm kan worden gebruikt indien nodig.

Figuur 4: Frame ter ondersteuning van rhizoboxes. De lichtgewicht frame is opgebouwd uit PVC snijden aan de opgegeven lengtes en met elkaar verbonden via de gezamenlijke typen aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

5. Naai beschermende gevallen aan licht en warmte

Opmerking: Wortels voorkomen dat licht, zodat deze gevallen licht uitsluiten om ervoor te zorgen dat waargenomen wortel plasticiteit reacties worden gedreven door de bron van nutriënten in de patches en niet door licht te vermijden. Lichte ontbering weefsel vermindert ook de temperatuur in de rhizoboxes, helpt om hittestress te vermijden.

1. Snijd het licht ontbering weefsel (gespecialiseerde materiaal dat aan de ene kant wit en zwart aan de andere) in stukken ongeveer 95 cm breed en 69 cm lang (Zie Tabel van materialen). Een steen per vak is vereist.
2. Vouw elk stuk doormidden langs de lange zijde om te vormen van een mouw 47.5 cm × 69 cm. Met behulp van een naald van de naaimachine ontworpen voor denim, zware quilten draad en een smalle naad, naai de onderkant en ¾ van de weg omhoog de zijde van elke mouw. PIN de bovenste hoeken samen met een veiligheidsspeld.

6. bereiding van 1:1 (V/V) bodem: zand substraat te vullen van de Rhizoboxes

1. Verzamelen van ongeveer 1000 cm³ van de bodem van het veld (op de site van belang) per doos. Droog de bodem tot constant gewicht in ondiepe lade op 60 ° C.
   Opmerking: De bodem voor dit experiment werd verzameld onmiddellijk na oogst in een autonoom beheerde maïsveld van 0\u201210 cm (diepte).
2. Het malen van de bodem met een mortier en een stamper geschiedde door een zeef van 2 mm. Meet de bulkdichtheid van de bodem door een bekend volume van de bodem af te wegen.
3. Verkrijgen van zand (zoals spelen zand, die goedkoop kan worden gekocht bij een ijzerhandel; Zie Tabel van materialen) en meet de bulkdichtheid.
4. Afmeten van gelijke hoeveelheden zand en grond in een emmer en meng. Gebruik een trechter om te vullen het vak langzaam en gelijkmatig tot 2,5 cm vanaf de bovenkant, zonder schudden van het vak als u wilt dat het substraat te regelen. Meten van dit volume van substraat; het moet ongeveer 1,272 cm³.
5. De bulkdichtheid van zand te vermenigvuldigen met de helft van dit volume te verkrijgen van de massa van het zand nodig voor elk vak. Doe hetzelfde met de bulkdichtheid van de bodem te verkrijgen van de massa van de bodem nodig voor elk vak.
   Opmerking: Voor het veld grond en zand gebruikt in dit experiment, was dit 976 g zand en 774 g van de bodem, maar deze bedragen zullen variëren afhankelijk van de bulkdichtheid van de bodem gebruikt.
6. Label van één grote zip-top plastic zakje per rhizobox, wegen de juiste massa van zand en grond in de zak en meng grondig.
7. Analyseren van deze 1:1 grond- en substraat voor het gehalte aan nutriënten en de natuurlijke overvloed van ¹⁵N (δ¹⁵N).

7. substraat voorbereiding voor de behandeling en controle Patches

1. Label twee kleine zip-top plastic zakken per rhizobox, één voor de behandeling patch en één voor de patch controle. Weeg 30 g van de bodem: zand substraat van elke grote tas (stap 6.6) in de twee bijbehorende kleine zakken.
2. Meng het substraat met een ¹⁵N-geëtiketteerden stikstofbron voor de pleister behandeling. Hiervoor, weeg 1 g van ¹⁵N-geëtiketteerden plantaardige residuen of andere N-bron (het bedrag kan worden aangepast als gewenste) in de zak van elke behandeling (zip-top zakje), en meng zorgvuldig.
   Opmerking: Voor dit experiment, een mengsel van ¹⁵N-geëtiketteerden klaver en wikke residu werd gebruikt. Klaver en wikke zaden waren geplant in een 1:1 mix van vermiculiet en zand, en gegroeid onder voorwaarden van de broeikasgassen. Planten werden dagelijks met gedeïoniseerd water gedrenkt en tweemaal per met 1/100 kracht van Long-Ashton oplossing¹³ met ¹⁵N-geëtiketteerden stikstof bronnen. Alle bovengrondse biomassa is gekapt op vier weken na het planten, gedroogd en gemalen passeren door een zeef van 2 mm. Als een andere voedingsstof is gekozen, met name als dat element in de bodem, mobiele is worden proefprojecten voor het testen van uitspoeling aangemoedigd. Slow release vormen van voedingsstoffen kunnen worden gebruikt of een ontwerp van verschillende rhizobox kan worden gekozen om te beperken uitloging (bijvoorbeeld door aparte compartimenten¹⁰) indien nodig.

8. veilig laden Rhizobox met substraat, en tot vaststelling van de behandeling en controle Patches

1. Weeg elke lege rhizobox en opnemen van de gewichten voor later gebruik.
2. Plaats twee patch spacers (zie stap 3.2) in één rhizobox totdat de schroef hen verhindert verder te gaan. Mark van de diepte van de onderste rand met een lichte mark aan de zijkant van de rhizobox (Figuur 3) en verwijder de afstandhouders.
3. Met behulp van een trechter met een opening van de stam dat zo smal als de opening van de rhizobox, vullen de rhizobox van de overeenkomstige grote zak van substraat tot de aangegeven diepte. De trechter heen en weer langzaam en gelijkmatig verplaatsen zodat het substraat gelijkmatig vult en geen preferentiële stroom kanalen schept.
4. Wanneer het substraat de gemarkeerde diepte bereikt, zet u de spacers terug in 5 cm aan beide kanten van het vak. Blijven vullen het vak totdat het niveau van het substraat ongeveer 5 cm van de bovenkant van de doos is (er moet nog in de zak substraat).
5. Natte grondig rond elke spacer.
   Opmerking: In dit experiment, dit werd bereikt door het leveren van 50 mL water via infuus vervuilers ingevoegd tussen de buitenste rand van elke spacer en de kant van de rhizobox, en gieten 50 mL water gelijkmatig tussen de twee afstandhouders. Langzame irrigatie is noodzakelijk voor uniforme bevochtiging.
6. Verwijder de afstandhouders, terwijl de bodem nat is, waardoor een lege holte voor de patches.
7. Tape een transparantenfolie aan de buitenkant van elke rhizobox (Zie Tabel van materialen). Mark van de ene kant als behandeling en controle, en vul de patches van de passende zakken met behulp van de trechter. De grenzen van elke patch op de transparantie met permanente marker te traceren.
8. Vul de rhizobox gelijkmatig met de resterende substraat. Het traceren van de bovenkant van het substraat op de transparantie.
9. Herhaal voor de resterende rhizoboxes. Sla alle tassen voor oogst.

9. zelfs water tot 60% Water-Holding capaciteit

Opmerking: Deze hoeveelheid bodemvocht werd gevonden om te voorkomen dat planten ervaren droogte stress terwijl het voorkomen van de ontwikkeling van zuurstofvrije omstandigheden of algengroei.

1. Het meten van de capaciteit van de water-holding (WHC) van de substraat-¹⁴.
2. Bereken het ideale gewicht van elk vak; hier gedefinieerd als de som van het gewicht van de lege rhizobox in combinatie met het gewicht van het substraat op 60% water-holding capaciteit.
3. Vermenigvuldig de WHC (gram water / gram droge ondergrond) door 0.6 te verkrijgen van de massa van water in het substraat op 60% gehouden WHC. Deze massa aan de massa van de droge ondergrond en de massa van de ¹⁵N bron toevoegen.
4. Het leeg gewicht van elk vak toevoegen aan het nummer hierboven verkregen.
5. Weeg de vakken zodra ze zijn ingevuld. Het gewicht van elk vak (in g) op dit punt van zijn ideale gewicht (in g) berekend in stap 9.2 aftrekken. Water met dit volume (in mL) van-geïoniseerd (DI) water langzaam en gelijkmatig.
   Opmerking: Deze stap kan worden gedaan met behulp van druppelirrigatie of drenken met de hand. Als drenken met de hand, kunt u het water volledig kansloos alvorens toe te voegen meer om te voorkomen dat vocht van heterogene bodemgesteldheid en preferentiële stroom kanalen.

10. Zaaimaterialen kieming en -transplantatie

1. Als unplanted gebruiken, gereserveerd die rhizoboxes.
2. Oppervlakte-steriliseren maïs zaden door roeren voor 1 min 5% NaOCl, dan Spoel grondig in DI water.
   Opmerking: In dit experiment, zaden van zes verschillende maïs genotypen werden gebruikt om te onderzoeken van de genotypische verschillen in wortel plasticiteit.
3. Gesteriliseerde zaden ontkiemen door te plaatsen ze op een natte laboratorium weefsel (bijvoorbeeld Kimwipe) in petrischalen en die betrekking hebben op met een andere vochtige weefsel. Er mag geen stilstaand water. Plaats petrischalen op een donkere plaats voor 48\u201272 h totdat de radicle gewoon begint te ontstaan.
4. Gebruik een smalle spatel te graven een gat tot 2,5 cm diepte in het midden van elke rhizobox. Transplantatie van een gekiemd zaad in het gat, ervoor te zorgen dat de radicle gericht rechtstreeks naar beneden.
   Opmerking: Als het radicle is schuin tegenover beide patch, de vergelijking van de groeicijfers van de wortel zal een vertekend beeld geven.
5. De locatie van het zaad op de transparantie te traceren.
6. Dekking van het zaad en water met DI water aan tot 50 mL.

11. planten groei

1. Planten groeien voor 25 dagen (of zo lang als gewenst), behoud van 60% WHC gedurende de groeiperiode. Wortelgroei van de monitor door het traceren van de wortels.
2. Wegen elk vak elke 3\u20124 dagen en water totdat het binnen 5 g van het ideale gewicht. Stop drenken de rhizoboxes vier dagen vóór de oogst ter vergemakkelijking van de scheiding van de panelen. Verwijder onkruid met de hand vaak zodat alleen de plantenwortels van belang aanwezig zijn.
3. Traceren zichtbare wortels om 3\u20124 de dagen met behulp van een permanent marker met duidelijk te onderscheiden kleuren voor elke dag van de tracering.
   Opmerking: De diameter van de verschillende markeringen kunnen worden gebruikt voor primaire en laterale wortels, indien gewenst. Het kan zinvol zijn om criteria voor root tracering meteen omdat een zekere mate van subjectiviteit is betrokken, met name als meerdere onderzoekers overtrekken wortels zullen of als wortels van verschillende orders of diameter te onderscheiden met verschillende markeringen te definiëren. In dit experiment, de juistheid van de opsporing van zichtbare wortels aan slechts één kant van het vak is getest door het traceren van zichtbare wortels aan beide zijden en vergelijken van totale wortel lengte gemeten op de gescande transparanten tot totale wortel lengte gemeten door het wassen en het scannen van de wortels. De correlatie tussen de overgetrokken en gescande wortel lengte was belangrijk ongeacht of alleen de transparantie in de rug of beide transparanten werden gebruikt. Daarom is het mogelijk om gewoon traceren zichtbare wortels op het achterpaneel.

12. oogsten scheuten, en het verkrijgen van Root en bodemmonsters voor analyse

1. Leggen van de eerste rhizobox flat en verwijder alle schroeven.
2. Oogst de shoot monsters. Clip scheuten aan de basis, een bodem met DI water afspoelen en drogen op 60 ° C. Grind schiet met een mortier en een stamper passeren door een zeef van 2 mm en weeg deelmonsters in tin capsules voor isotoop analyse (zie punt 14).
3. Met behulp van de transparantie als een gids, gesneden rond de behandeling en controle patches met een scheermes. Gebruik een lepel of spatel te schep de wortels en de daaraan vastzittende rhizosfeer bodem in de respectievelijke behandeling of besturingselement zak.
   Opmerking: Hoewel vele methoden bestaan om aparte rhizosfeer bodem, de bodem onder invloed van plant roots¹⁵, en de rizosfeer kan worden beschouwd als een verloop in plaats van een strikt afgebakende zone¹⁶, deze methode volgt de gebruikte definitie van de bodem die voldoet plantenziekterisico wortels na het schudden van¹⁷.
4. Schep de resterende wortels en bodem in de derde tas.
5. Passeren van de behandeling, controle, en bulk van monsters door een zeef van 2 mm te scheiden van de wortels van substraat, een zichtbare wortels of fragmenten verwijderen > 1 cm in lengte met een fijne pincet. Houd deze monsters los van elkaar voor een totaal van drie wortel en drie monsters van het substraat.

13. validering van schetsen en schatting van relatieve Root groeicijfers

1. Behandeling, controle, scannen en bulk monsters en berekenen van de lengte van de wortel.
   1. Werken met één monster tegelijk, spoel wortels zorgvuldig met DI water te verwijderen van alle resterende substraat. Monsters in een duidelijke lade zo rangschikken dat de wortels niet overlappen.
   2. Scan monsters met behulp van een scanner die compatibel is met de wortel analysesoftware (bijvoorbeeld WinRhizo). Ervoor zorgen dat de software gekalibreerd is om te onderscheiden betrouwbaar wortels van de achtergrond van de afbeelding.
   3. De software gebruiken voor het meten van de lengte van de totale wortel en wortel lengte in de klassen van de diameter van belang (bijvoorbeeld < 0,2 mm, 0.2\u20120.4 mm 0.4\u20120.8 mm 0.8\u20121.6 mm, > 1,6 mm).
2. Bereken de wortel lengte dichtheid (RLD) voor de behandeling en controle patches en voor elke rhizobox als geheel.
   1. Berekenen van het volume van behandeling en bestrijding patches door te vermenigvuldigen met het gebied getraceerd op transparanten (zie stap 8.1) door 0.635 cm, de diepte van het vak. Deze volumes gebruiken voor het berekenen van de wortel lengte dichtheid in behandeling en controle patches met behulp van de lengte van de totale wortel in elke patch (zie stap 13.1.3).
      
   2. Berekenen van het volume van substraat in elk rhizobox door vermenigvuldiging van het gebied getraceerd op de transparantie (zie stap 8.1) door 0.635 cm. Bereken RLD wat betreft de behandeling en controle patches.
      
3. Valideren van de root methode traceren door vergelijking van gescande wortelstelsel en getraceerd beelden.
   1. Transparanten scannen en berekenen van de lengte van de totale wortel met behulp van de software. De gescande afbeelding opslaan voor groei tarief berekeningen.
   2. Som van de totale wortel lengte metingen van behandeling, controle, en bulk monsters voor elk vak (zie stap 13.1.3).
   3. Test de gescande en getraceerde metingen van de totale wortel lengte om te zien of de correlatie statistisch significant is.
      Opmerking: Als dat zo is, de tracering methode is gevalideerd en relatieve groeicijfers op elk tijdstip kunnen worden berekend. Als dat niet het geval is, alleen de gegevens van gescande wortelsysteem biedt een nauwkeurige indicatie van de wortelgroei. Dit zou het geval zijn als tracering methodologie inconsistent was of als wortels niet even zichtbaar voor alle genotypen, bijvoorbeeld waren.
4. Als de tracering-methode werd gevalideerd, berekenen relatieve wortel groeicijfers voor elke rhizobox.
   1. Wortel analysesoftware gekalibreerd om onderscheid tussen de kleuren gekozen tracering voor het meten van totale wortel lengte in behandeling, controle, en bulk monsters op elk tijdstip te gebruiken. Het berekenen van cumulatieve totale wortel lengte op elk tijdstip.
   2. Relatieve wortel groeicijfers (RGR_wortel) voor elke rhizobox alsook wat betreft de behandeling en controle patches voor elke time interval t₁-t₂ als volgt berekenen.
      
      Opmerking: Hier L₁ is de totale wortel lengte in de patch (cumulatieve som van 11.3) t₁ dagen na het verplanten van (DAT) en L₂is totale wortel lengte in de patch op t₂ DAT.

14. analyse van ¹⁵N partitionering onder wortel schieten en behandeling bodemmonsters

1. Droge wortels bij 60 ° C, weeg biomassa, en slijpen om te passeren door een zeef van 2 mm.
2. Droge deelmonsters van behandeling bodem op 60 ° C.
3. Pakket wortels en behandeling in tin capsules als met de scheuten.
   Opmerking: Ideale monster gewicht per capsule moet afzonderlijk berekend worden voor scheuten, wortels en bodem op basis van de geschatte C/N-verhouding van het materiaal om het streefbedrag van totale N voor analyse. Neem contact op met de stabiele isotoop faciliteit waar de monsters zijn in te dienen voor meer informatie. Voor dit experiment waren de sample voorbereiding instructies en monster gewicht Calculator geboden door de UC Davis stabiele isotoop faciliteit gevolgd¹⁸.
   Let op: Wees extra voorzichtig te mengen monsters gelijkmatig vóór verpakking in capsules en bereiden van meerdere capsules per monster. Als monsters zijn niet gelijkmatig gemengd, kan duidelijk herstel van ¹⁵N overschrijden het bedrag dat oorspronkelijk aanwezig.
4. Analyseren van de totale hoeveelheid N, δ15 en ¹⁵N inhoud van elke schieten, wortel en behandeling bodemmonster.
   Opmerking: In dit experiment, plant monsters werden geanalyseerd via verbranding met een PDZ Europa ANCA-GSL elemental analyzer geïnterfacet aan een PDZ Europa 20-20 isotoop ratio massaspectrometer op de UC Davis stabiele isotoop faciliteit (UCD SIF). Bodemmonsters werden met een Elementar Vario EL kubus elemental analyzer geïnterfacet aan een PDZ Europa 20-20 isotoop ratio massaspectrometer op de UCD SIF geanalyseerd.
5. Berekenen van het bedrag van ¹⁵N verkregen van het label in de plant schiet en wortel monsters.
   1. Eerst, berekent het bedrag van ¹⁵N boven atmosferische ¹⁵N in elk zwembad, ¹⁵P *:
      
      ¹⁵P is waar de ¹⁵N-inhoud in de atomaire % van de pool van belang.
   2. Ten tweede, berekenen het bedrag van ¹⁵N boven atmosferische ¹⁵N in het label, ¹⁵L *:
      
      waar is ¹⁵L de inhoud ¹⁵N in atomaire % van de gelabelde N bron.
   3. Ten derde, berekent het bedrag van totale N in elk zwembad, N_p:
      
      waar m_p = de massa van het zwembad (bijvoorbeeld totale droge schieten of wortel biomassa) en %_p is het percentage van N van die groep.
   4. Ten slotte de resultaten van 14.5.1\u201214.5.3 in de Ndff vergelijking¹⁹ voor het berekenen van de hoeveelheid N verkregen van het label, N_lte gebruiken:
      
      Opmerking: De Ndff vergelijking wordt gebruikt om te bepalen van de hoeveelheid N van een gelabelde bron die door planten wordt teruggewonnen. Het wordt ervan uitgegaan dat geen isotopische discriminatie tijdens N-opname door de plant optreedt en over het algemeen geldig voor N bronnen verrijkte ~1\u201210%^{19 is}.

Resultaten

Wortels groeide bij voorkeur tegen de achterkant van de doos, zoals verwacht. De lengte van de totale overgetrokken wortel op de achterkant van de doos die varieerden van 400 tot 1,956 cm, in vergelijking tot 93-758 cm op de voorkant van de doos. Paarsgewijze Pearson correlatiecoëfficiënten waren berekend tussen de lengte van de gescande wortel en getraceerde wortel lengte op de voorkant van de doos, achterkant van het vak en de som van de voor- en achterkant werd gebruikt om te bepalen o...

Discussie

De rhizoboxes beschreven in dit protocol kan worden gebruikt voor uiteenlopende vragen in de wortel en de rhizosfeer wetenschap, en hebben gevonden Divers gebruikt elders^{10,20,21,22,23 , 24 , 25}. andere onderzoekers hebben gevangen time-lapse beelden van rhizoboxes²¹<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.27 cm diameter PVC-buis	JM Eagle	530048	305 cm per doos, gesneden in lengtes zoals gespecificeerd in het protocol
PVC zijellebogen	Lasco	315498	2 per doos
PVC 90-graads ellebogen	Charlotte	PVC 02300 0600	4 per doos
PVC T-verbindingen	Charlotte	PVC 02402 0600	4 per doos
Gedrukte acryl panelen	TAP Plastics	N/A	2 per doos, 0.64 cm dik x 40.5 cm breed x 61 cm lang
HDPE afstandshouders (zijkant)	TAP Plastics	N/A	2 per doos, 0.64 cm dik x 2.5 cm breed x 57 cm lang
HDPE afstandshouders (bodem)	TAP Plastics	N/A	1 per doos, 0.64 cm dik x 2.5 cm breed x 40.5 cm lang
HDPE afstandshouders (patch)	TAP Plastics	N/A	2 per doos, 0.64 cm dik x 3.8 cm breed x 28 cm lang
Polyester vulling	Fairfield	#A-X90	2.5 cm x 40.5 cm strip per doos
20-draads schroeven	N/A	N/A	3.2 cm lang, 0.64 cm diameter
Schroevendraaiers	N/A	N/A	0.64 cm interne diameter
Zeskantmoeren	N/A	N/A	afgemeten om de schroeven te passen
Lichtdeprivatie stof	Americover, Inc.	Bold 8WB26.5	1 stuk 95 cm breed en 69 cm lang per doos
Zand	Quikrete	Nr. 1113
Veldgrond	N/A	N/A
Transparanties voor traceren	FXN	FXNT1319100S	Een per zijde van de te traceren doos