Methodenartikel

Voortplantingstechnieken voor het monitoren en beheersen van de eierstokken in amfibieën

17.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58675

⸱

12 mei 2019

 ,  ,  ,  , 
1Reproductive Sciences, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes, Museum National d'Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden, Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife

In dit artikel

Samenvatting

De studie van de biologie geeft waardevolle informatie over de reproductieve, fysiologische, embryologische en ontwikkelingsprocessen die organismen van vele taxonomische groepen aandrijgen. Hier presenteren we een uitgebreide gids over verschillende methodologieën die kunnen worden gebruikt om ovariële controle en monitoring in amfibieën te bestuderen.

Samenvatting

Ovariële controle en bewaking in amfibieën vereisen een veelzijdige aanpak. Er zijn verschillende toepassingen die met succes voortplantingsgedrag en de verwerving van gameten en embryo's voor fysiologisch of moleculair onderzoek kunnen opwekken. Amfibieën dragen bij tot een-12:45-derde van gewervelde onderzoek, en van belang in deze context is hun bijdrage aan de wetenschappelijke gemeenschap kennis van reproductieve processen en embryologische ontwikkeling. Echter, de meeste van deze kennis is afgeleid van een klein aantal soorten. De laatste tijd heeft de Decimatie van amfibieën over de hele wereld een toenemende interventie van natuurbeschermers nodig. De kolonies voor in gevangenschap levende dieren die in reactie op het extinctie risico blijven opduiken, maken bestaande onderzoeks-en klinische toepassingen van onschatbare waarde voor de overleving en reproductie van amfibieën die onder de menselijke zorg worden gehouden. Het succes van elke in gevangenschap levende bevolking is gebaseerd op zijn gezondheid en voortplanting en het vermogen om levensvatbare nakomelingen te ontwikkelen die de meest uiteenlopende genetische representatie van hun soort dragen. Voor onderzoekers en dierenartsen is het vermogen om ovariële ontwikkeling en gezondheid te bewaken en te beheersen daarom noodzakelijk. De focus van dit artikel is om de verschillende geassisteerde voortplantingstechnieken te belichten die kunnen worden gebruikt om de ovariële functie in amfibieën te bewaken en, waar nodig of nodig, te controleren. In het ideale geval moeten reproductieve en gezondheidsproblemen worden verminderd door middel van een goede gevangen veehouderij, maar zoals bij elk dier zijn gezondheids-en reproductieve pathologieën onvermijdelijk. Niet-invasieve technieken omvatten gedrags beoordelingen, visuele inspectie en palpatie en morphometrische metingen voor de berekening van lichaamsconditie indices en echografie. Invasieve technieken omvatten hormonale injecties, bloed bemonstering en chirurgie. Ovariële controle kan worden uitgeoefend op een aantal manieren afhankelijk van de toepassing vereist en soorten van belang.

Inleiding

Amfibieën worden al lang erkend als belangrijke biologische en medische modellen door een breed scala aan onderzoeksdisciplines. Gegevens verkregen door het bestuderen van bepaalde soorten zoals Xenopus laevis en X. tropicalis, de Luipaard kikker (Lithobates (voorheen Rana) Culex pipiens) en de axolotl (Ambystoma mexicanum) zijn toegepast op een aantal andere gewervelde diersoorten, waaronder mensen. De veterinaire, veehouderij en geassisteerde voortplantingstechnieken die zijn voortgekomen uit het bestuderen van deze en andere amfibieën bieden bijstand aan degenen die belast zijn met het ontwikkelen van succesvolle zorg, onderhoud en duurzaamheid van zeldzamer populaties in gevangenschap 1 , 2 , 3 , 4.

De rente wint aan het gelijktijdige gebruik van in en ex-situ conservatie-gebaseerde benaderingen om het tij van uitsterven te keren voor velen bij risico-amfian soorten1,2. Dit artikel bevat de methoden die momenteel beschikbaar zijn voor het bewaken en controleren van de amfibieën ovariumfunctie in model soorten van Anuranen en Caudates. Bovendien worden bestaande technieken voor het aanpakken van een gemeenschappelijke voortplantings pathologie van het bewaren van eieren gepresenteerd.

Zoals in veel taxonomische groepen omvat de amfifiele ovariële controle een reeks nauw gesynchroniseerde interacties tussen de omgeving en de fysiologie. Temperatuur en de fotoperiode (bekend als nabije signalen) worden gedecodeerd door het oog en de hersenen waar ze snel worden omgezet in genetische, hormonale en circadiane processen (Ultimate signalen)3,4. De in dit artikel bedoelde methoden voor het bewaken en beheersen van de ovariële functie omvatten invasieve en niet-invasieve technieken. Institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) de onderzoeks-en onderwijsvereisten definiëren niet-invasieve technieken die minimaal tot geen lichamelijke pijn of mentale nood veroorzaken en geen pijnstillende middelen nodig hebben5. Hier, niet-invasieve technieken omvatten visuele inspectie en palpatie, gedrags waarnemingen, Morfometrische beoordelingen en echografie. Integendeel, de technieken van bloedinzameling, hormoon toediening en chirurgie (ovariectomie en verwijdering van bewaarde eieren) worden geclassificeerd als invasief omdat ze kunnen resulteren in wat pijn of ongemak en vereisen anesthesie of post-procedurele medicamenteuze therapie.

Niet-invasieve ovariële bewakingstechnieken kunnen gemakkelijk worden opgenomen in de dagelijkse verzorgingsroutine voor de meeste gevangen amfibieën. Afhankelijk van de soort kan ovariële graviiteit vaak worden bepaald door een eenvoudige visuele inspectie (glazen kikker). In andere gevallen kan palpatie aangeven of een vrouwtje gravid is. Verschillende body condition indices (BCI) zoals gewicht, snuit urostyle length (Sul), snuit-vent length (SVL) en Standard Mass Index (SMI) zijn beschikbaar voor het voorspellen van de aanwezigheid of afwezigheid van eieren4,6,7, 8,9. Echter, zorg moet worden genomen met de interpretatie van de resultaten als de meeste niet overwegen leeftijd, lichaamsvorm of samenstelling (bijvoorbeeld, water vastgehouden versus ovariële massa of vet)6. Definitieve reproductieve diagnoses kunnen worden bereikt via echografie met meer diepgaande kennis opgedaan met betrekking tot de ontwikkeling van eieren en de fasering van de ovariële cyclus4,7. Echografie biedt ook een manier om reproductieve pathologieën en bijbehorende fysiologische omstandigheden te bevestigen en te monitoren4,8.

Naast het verstrekken van informatie over gezondheidsstatus, kan bloed bemonstering worden gebruikt om voortplantingshormonen te meten. Als hormoon profilering is het uiteindelijke doel, het is belangrijk om te voorkomen dat stress-gerelateerde invloeden die kunnen Verwar systemische steroïde gegevens. Terwijl een potentieel krachtige monitoring tool, er is nog een studie waaruit blijkt aangeboren endocrinologische reacties op exogene hormoon toediening in elke soort amfian. Bloed kan veilig worden genomen van verschillende sites; bij kikkers zijn dit de ventrale buik ader, linguale plexus, femorale ader en hart9,10. In Caudates wordt bloed opgevangen uit de staart ader van de ventrale. De mate van invasiviteit, de hoeveelheid terughoudendheid die nodig is, de behoefte aan verdoving, de delicatesse van het orgaan dat wordt getarget, en de grootte van het dier zijn factoren die overwogen moeten worden bij het kiezen van een verzamel techniek voor de amfinotische patiënt. Dit artikel presenteert de techniek van het verzamelen van bloed uit het gezicht maxillaire of musculocutaneous ader van kikkers zoals oorspronkelijk beschreven door Forzan et al.9.

Ovariële controle is soortspecifiek en, als zodanig, hormoon protocollen moeten worden getest en geoptimaliseerd. Anders dan de seizoensgebondenheid en de bijbehorende circulerende hormoon milieu, ovariële controle kan ook nauw verband houden met leeftijd, tijd doorgebracht in gevangenschap en blootstelling aan herhaalde hormoon toediening, waarvoor er weinig informatie in de literatuur11 , 12 , 13. de implementatie van hormoon therapieën om reproductieve gedragingen, gameten productie, rijping en ovipositie te ontlokken is uitgegroeid tot een algemeen gemelde aanpak voor het oplossen van algemene reproductieve problemen in verband met gevangenschap4, 8,14,15,16. Omdat de mechanismen die de reproductie van de voortplanting in gewervelde dieren sterk behouden, zijn er een aantal hormonen, neuropeptiden en commercieel verkrijgbare geneesmiddelen therapeutisch gebruikt in andere taxonomische groepen die ook betrouwbaar kunnen worden gebruikt in een aantal amfian soorten (tabel 1). Gonadotropine releasing hormoon (GnRH) en humaan choriongonadotrofine (HCG) (of variaties daarvan, d.w.z. pmsg en eCG)17,18, hetzij individueel of in combinatie, zijn gebruikt op grote schaal in amfian Captive fokprogramma's waaronder: de Southern Rocky Mountain Boreal (Anaxyrus boreas Boreas)4,19,20; de Toad, Dusky Gopher Frog, Rana sevosa (Langhorne et al., ongepubliceerd)7; de Gulf Coast Waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming pad, Anaxyrus baxteri18; de Bullfrog, Rana catesbiana21; de Amerikaanse pad, Anaxyrus americanus22; de gras kikker, Lymnodyaster tasensis23; de coqui, Eleutherodactylus coqui24; de Xenopus, Xenopus laevis25; de Gunther toadlet, Pseduophryne guentheri26; de noordelijke Luipaard kikker, Lithobates Culex pipiens; de Argentijnse Horned-kikker, Ceratophrys sierlijke; de Cranwell Horned-kikker, C. cranwelli; de Amerikaanse grond-kikker, Odontophrynus americanus27; en de vuursalamander (Salamandra)228. Steroïdhormonen, zoals progesteron (P4), zijn minder vaak gemeld, maar hebben aangetoond goede werkzaamheid bij het opwekken van ovulatie en ovipositie in sommige soorten anuranen16,18,29. Prostaglandinen (vooral prostaglandine 2-alpha (pgf2α)) zijn betrokken bij de ovulatie samen met corticosteroïden30,31,32,34 en bereiken hoge niveaus tijdens de ovulatoire fase31.

In in vitro studies is pgf2α een krachtige inductor van de ovulatie31, terwijl het in vivo ovipositie van ingehouden eieren in Rana Schorsmarpissa4,30,32kan induceren. Hypofyse extracten zijn ook effectieve inductoren van de ovulatie15,16,34; bezorgdheid over bioveiligheid en het potentieel voor ziekte overdracht zijn echter vaak een afschrikmiddel voor gevangen fokkolonies bij het overwegen van deze aanpak35.

De laatste sectie van dit artikeldetails chirurgische procedures en biedt alternatieve benaderingen voor het uitbreiden van ovariële studies of steun met de resolutie van reproductieve pathologieën. Ovariectomieën worden meestal uitgevoerd in amfibieën om eicellen voor embryologisch onderzoek te verkrijgen. Het kan echter ook een remedie bieden voor ingehouden eieren wanneer een andere optie mislukt. Hoewel deze procedure is invasief, vereisen volledige anesthesie en incisies om de Eier massa's bloot, het vereist geen euthanasie. Bovendien, na gedeeltelijke ovariectomie, dieren kunnen een volledig herstel te maken en blijven reproductief actieve na chirurgie8,36.

De hieronder beschreven protocollen beschrijven de invasieve en niet-invasieve methoden voor de controle van de eierstokken en de monitoring in Anuranen en Caudates. De specifieke soorten die zijn gekozen om technieken te illustreren in Anuranen zijn R. mucosa en X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensis, en A. mexicanum bestaan uit de soorten die worden gebruikt voor het beschrijven van technieken in caudates.

Protocol

Salamander procedures werden goedgekeurd door Cincinnati Zoo & Botanical Garden (CZBG) institutionele zorg en gebruik Comité (IACUC) protocollen 11-106, 13-110, 14-133 en 15-138. Alle kikker-en Toad-procedures werden goedgekeurd door de San Diego Zoo Global (SDZG), het institutioneel zorg-en gebruiks Comité (IACUC) protocollen: 15-001, 16-005 en 18-003.

De verzorging en behandeling van dieren werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Nationaal Natuurhistorisch Museum (Parijs) (Museum National d'Histoire Naturelle-Ménagerie du Jardin des Plantes (MNHN)), in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen (Commissie de génie génétique, direction départementale des Services Vétérinaires, richtlijn 2010/63/EU van de Europese Unie, besluit nr. C75-05-01-2 voor het Europees Verdrag voor gewervelde dieren dat voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden wordt gebruikt. Alle in deze studie gebruikte protocollen zijn goedgekeurd onder het referentienummer 68-037.

1. niet-invasieve ovariële bewakingstechnieken

  1. Visuele inspectie en palpatie
    1. Houd de vrouwelijke Anuran op een van de drie manieren die hieronder worden beschreven.
      1. Bevestig de kikker of de pad van de Toad met de ring en de kleine vinger, ondersteuning van de rugzijde (abdomen) van het lichaam van de kikker met de index en middelvinger en de ventrale zijde met de duim (Figuur 1a).
      2. Houd de kikker of Toad in de dominante hand met een duim op de buik en de rest van de vingers die de achterkant van het dier beveiligen. Met behulp van de niet-dominante hand om de buik van het dier te palperen, voelen als er subdermale Hobben (Figuur 1b).
      3. Rust de kikker of de buik van een pad op de Palm van de hand, de voorste armen over de wijsvinger en een duim op de bovenrug.
    2. Aangezien Caudates volledig water in de natuur zijn, voert u een visuele inspectie uit op een van de twee hieronder beschreven manieren.
      1. Verplaats het dier naar een aparte 4 L-container met tank water. Houd de container (deksel vastgezet) omhoog en glans zaklamp aan de onderzijde om de aanwezigheid/afwezigheid van eieren te visualiseren.
      2. Anesthetize in MS222 (0,5 g/L; Tricaïne methanesulfonaat, gebufferd met 0,5 M NaHCO3). Na inductie, roteer het dier op zijn rug en onderzoek de buik.
  2. Morfometrische beoordelingen
    1. Kikvorsachtigen
      Opmerking: anesthesie is niet vereist.
      1. Met behulp van remklauwen, meet het dier van de punt van de mond, langs het midden van het lichaam naar de punt van de staart te verkrijgen SUL en SVL (Figuur 2a, B).
      2. Tare een plastic container op een digitale precisie schaal. Plaats het dier in een getarreerde recipiënt en weeg (figuur 2c).
      3. Voor grotere dieren, zoals een bullfrogs, of bij het verkrijgen van gewichten in het veld, gebruik een ophang schaal (figuur 2D).
      4. Zoals in veel anuran soorten, onderscheiden R. Schorsmarpissa volwassen vrouwtjes van mannetjes door hun grotere omvang en het ontbreken van huwelijksevoorwaarden (duim) pads op de handen (Figuur 3).
      5. Bereken de conditie van het lichaam, als een basis beoordeling van de algehele gezondheid met de volgende formule:
        Fulton's index: K = massa ÷ lengte3
        Opmerking: Fultons index maakt gebruik van een dimensionale balans van volume met betrekking tot massa en lengte waarbij 3 de schaal exponent is die de massa en lengte isometrisch relateert.
    2. Caudates
      1. Tare schaal met een lege zak voor het plaatsen van de niet-anesthetized dier binnen. Zorg voor het niet introduceren van overtollig water (figuur 2D) en snel handelen als dieren slijm afscheiden als een stress reactie om te worden ingetogen.
      2. Het verkrijgen van volwassen maatregelen door het immobiliseren van individuen in een rechte positie aan de onderkant van een herverzekbaar plastic zak of in een aparte plastic container die geschikt is voor uitgebreide remklauwen.
      3. Meet de lichaamslengte met remklauwen (figuur 2e).
      4. Meet de caudatus van de punt van de snuit tot de punt van de staart (SVL) om de groei te monitoren.
  3. Gedrags waarnemingen
    1. Houd dieren fysiek in real-time of gebruik een videocamera om gedrag te registreren.
    2. Waarnemingen van dieren registreren gedragingen categoriseren en een ethogram construeren (Figuur 4).
    3. Voortplantingsgedrag classificeren
      Opmerking: Figuur 4 is een voorbeeld van één type voortplantingsgedrag dat in anuranen is waargenomen.
  4. Echografie
    Opmerking: de ultrasone transducer van keuze, in dit geval, 7,5 MHz lineair of een multi-frequentie (10-6 MHz) micro-convex, is aan te bevelen voor Necturus en een 10 MHz sonde en wateroplosbare, zoutvrije gel voor R. Schorsmarpissa. Het uitvoeren van echografie op salamanders kan anesthesie vereisen (zie paragraaf 1,5 voor instructies).
    1. Kikvorsachtigen
      1. Voer echografie uit op R. Schorsmarpissa met behulp van twee personen (figuur 5a).
      2. Eerste persoon: Houd het dier met de dominante hand en breng het in water oplosbare, zout vrije gel aan op de buik van het dier.
      3. Tweede persoon (Ultra-Sonographer): Neem de 10 MHz-sonde in de dominante hand en breng deze aan op de buik en zorg ervoor dat u goed contact maakt tussen de sonde en de gel.
      4. Schuif naar binnen van net onder de armput naar het midden van de buik van het dier om de hele eierstok te visualiseren.
      5. Ultra-Sonographer: gebruik een niet-dominante hand om het frame te bevriezen en de gewenste beelden op de echografie te vangen.
      6. Categoriseer de fase van de ovariële cyclus door het beoordelingssysteem dat is ingesteld voor het genus4 (tabel 2, figuur 5b-F).
      7. Spoel elke gel van het dier af aan het einde van de procedure.
    2. Caudates
      1. Overdracht niet-anesthetized Necturus naar 4 l rechthoekige container gevuld met 2 l tank water.
      2. Minimaliseer de bewegingen van dieren door de kamer verlichting uit te schakelen en/of een hand over het hoofd van het dier te beker.
      3. Plaats de transducer op een afstand van 1-2 cm van de lichaams wand.
      4. Lokaliseer het hart op het ventrale middellijn-niveau naar de voorpoten en verplaats de transducer vervolgens DISTAAL en onderzoek het ovariumweefsel7.
      5. Categoriseer vrouwtjes volgens het beoordelingssysteem vastgesteld voor het genus4 (Figuur 6a, B, C).
      6. Verkrijg nauwkeurige metingen van eieren in het midden-tot laat-gravid stadium door beelden te vangen wanneer het lichaam van het dier zich onder een hoek van de transducer bevindt (d.w.z. niet lineair, maar lichtboog; Figuur 6b). Anders maken overlappende follikels het moeilijk om de individuele Eier grootte te differentiëren.
  5. Anestheticum inductie en herstel
    1. Kikvorsachtigen
      1. Anesthetize in MS222 (0,5 g/L; Tricaïne methanesulfonaat gebufferd (0,5 M NaHCO3) zoals eerder beschreven.
      2. Gebruik de rechtse reflex als een primaire indicator van de mate waarin het dier is verdoiliseerd. Volledig verlies van reflex toont een toestand van diepe anesthesie.
      3. Verwijder het dier uit het waterbad-gebaseerde anesthesie (MS-222) zodra de rechtse reflex is verdwenen.
      4. Leg het dier op een natte (met verdoving vrij water) doekje.
      5. Zorg ervoor dat u het dier tijdens de gehele chirurgische ingreep vochtig houdt.
      6. Intuberen kleine amfibieën met rode rubberen katheters, ongeboeid buizen of klassieke geboeid Endotracheale buizen zonder de manchet te blazen.
      7. Zorg voor een lage zuurstoftoevoer (0,5-0,75 L/min) met 0,5-1% Isofluraan.
      8. Stop de Isofluraan na de procedure, maar houd de zuurstoftoevoer gedurende 1 minuut.
      9. Extubate van het dier en spoel het dier grondig met verdovend vrij gedechloreerd water gedurende 2 minuten.
      10. Plaats het dier in een ondiepe hoeveelheid van het gechloreerde water of op een natte handdoek.
      11. Evalueer het herstel van het dier door zachtjes op een achterlijf te trekken om te verlengen. Elke reagerende contractie van de ledemaat duidt op opname reflex.
      12. Monitor andere indicatoren van herstel, zoals IG respiraties (keel beweging) en de rechtse reflex.
      13. Overweeg de amfian hersteld wanneer alle van de reflexen zijn teruggekeerd, en hart-en ademhalings frequenties zijn teruggekeerd naar pre-verdoving waarden.
    2. Caudates
      1. Anesthetize Necturus en AMBYSTOMA in MS222 (0,5 g/L tricaïne methanesulfonaat, gebufferd met 0,5 M NaHCO3, (MS222) in een 4 L rechthoekige tank.
      2. Plaats een lucht steen (1 inch) en luchtpomp in de tank en zet deze op een constante stroom om voldoende oxygenatie te bieden.
      3. Wanneer de ledemaat en de rechtse reflex verloren gaan, verwijdert u het dier uit de op water-bad gebaseerde anesthesie (MS-222) en zet u het dier op een natte (met verdovend-vrij, met chloorwater) handdoek.
      4. Behoud de huid en het Kieuw vocht met een knijp fles tank water.
      5. Om het dier te herstellen, voorzichtig plaats het ventrale kant naar beneden in een 4 L plastic container gevuld met 2 L tank water met een lucht steen.
        Opmerking: herstel begint met Gill knipperen, gevolgd door de mogelijkheid om de staart te bewegen en vooruit en uiteindelijk functionele beweging van ledematen.
      6. Keer het dier terug naar de originele behuizing tank en monitor de volgende 24 uur nauwkeurig.
        Opmerking: andere anesthesie methoden voor amfibieën bestaan en deze worden beschreven in Wright en Whitaker8.

2. invasieve ovariële monitor-en controletechnieken

Opmerking: deze procedure is aangepast van Forzán et al.10.

  1. Houd de kikker in de dominante hand en DEP de venipunctie zijde van het gezicht van de kikker droog met een steriel doekje of gaas.
  2. Droog het gezicht om te voorkomen dat het bloed te veel over de huid verspreidt.
  3. Steek de naald (26 G 1/2 "en 27 G 1/2"), met de schuine kant naar boven, door de huid waar de opstaande huid rond het oog en de bovenkaak Ridge elkaar ontmoeten om het punt van een driehoek te vormen (gele omtrek) (figuur 7A) toegang tot de Vena facialis in de buurt van de Vena orbitalis posterior.
  4. Prik de gelaats ader onder het rechter oog en boven de nok van de bovenkaak, beginnend tussen 1-2 mm terug van de middellijn van het oog (figuur 7A).
    Opmerking: voor kleinere kikkers (onder de 20 g) plaatst u de invoegpositie dichter bij een positie direct onder de middenlijn van het oog.
  5. Hoek de microhematocriet buis naar beneden om de zwaartekracht te helpen bloedtoevoer in de buis. Bloed moet onmiddellijk na punctie stromen (figuur 7b, C).
  6. Bij het eerste teken van de bloedtoevoer, plaats het uiteinde van de microhematocriet buis op de prikplaats en verzamel 1-2 volledige microhematocriet buizen van bloed en plaats buizen in geschikte recipiënten voor inzameling (afbeelding 7b, C).
  7. Als bloed niet gemakkelijk stroomt, of het volume is zeer laag, verschuiven van de invoeging van de naald lichtjes of steek de naald in de andere kant van het gezicht.
  8. Stop met bloeden door op gaas stevig op de prikplaats te drukken voor ten minste 20 sec.
  9. Laat de kikker 10 minuten uit het water om te bevestigen dat de prikplaats niet opnieuw wordt geopend.
  10. Gebruik een nieuwe naald en nieuwe microhematocriet buizen voor elke gesamplede kikker.

3. hormoon inductie

  1. Hormoon voorbereiding
    1. Bereid hormoon injecties onmiddellijk voorafgaand aan gebruik om te zorgen voor een maximaal effect.
    2. Selecteer een hormoon uit de selectie in tabel 1.
    3. Bepaal de concentratie van het hormoon dat moet worden geïnjecteerd met een μL of mL/g lichaamsgewicht16.
    4. Verdun het hormoon in een van de volgende: water, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zoutpan amfifaater's Solution (SARS) of Saline.
    5. Niet meer dan een injectievolume van 200 μL voor kikkers met een gewicht van 30-70 g en 300 μL voor kikkers met een gewicht van 80-110 g (persoonlijke observatie)16.
    6. Voor een juiste houd van een dier tijdens de hormoon toediening van een dier variërend van 10-100 g, gebruikt u een van de geschikte methoden voor het houden beschreven in punt 1,1.
  2. Kikvorsachtigen
    1. Bereken de vereiste concentratie per individu met behulp van een gram per lichaamsgewicht berekening (g/lichaamsgewicht).
    2. Vlak voor de toediening, reconstitueer in een steriel verdunningsmiddel naar keuze.
    3. Zorg ervoor dat er geen bubbels in de spuit achterblijven vóór de injectie.
    4. Houd het dier veilig in de niet-dominante hand en dien de injectie met een dominante hand toe.
    5. Toedienen injectie volgens de hormoon specificaties. De meest voorkomende injecties in anuranen zijn sub-cutane, intra-peritoneale of intra-gespierde (Figuur 8).
    6. Dien IP-injecties toe in het onderste deel van de buik of in het onderste gedeelte van de rugzijde van het lichaam in de buurt van het achterbeen (Figuur 9).
    7. Toedienen van intra-gespierde injecties bij voorkeur in de achterpoten.
  3. Caudates (Necturus)
    1. Reconstitueer het hormoon van keuze in steriel water volgens de hierboven beschreven gram per lichaamsgewicht methode.
    2. In het geval van Necturus, gebruik doses van 1.7-2.3 μg GnRH/g lichaamsgewicht.
    3. Verwijder Necturus uit verdoving kamer en plaats op een oppervlakte van 45 ° bedekt met chirurgische draperen.
    4. Plaats het dier met het hoofd naar beneden gericht.
    5. Naderings kwadrant van de buik (caudal van het achterbeen) in een hoek van 15-20 °. Wees voorzichtig om geen lucht in de spuit te introduceren.
    6. Injecteer (IP) met een insulinespuit en 27-30 G naald.
    7. Injecteer het hormoon met behulp van een insulinespuit en 27-30 G naald.

4. chirurgie

  1. Algemene chirurgische voorbereiding en procedure
    1. Om aseptische procedures te handhaven, gebruik heldere steriele plastic gordijnen om de chirurgische plaats te isoleren. Verminder de verdamping door de omringende huid vochtig te houden.
    2. Bevochtig alle materialen die de huid van het dier met steriel water zullen contacteren. Maak de huid incisie met een nummer 15 of nummer 11 scalpel Blade.
      Opmerking: een combinatie van koud staal, radio chirurgie of diode laser. Hemostase in milde hemorrhagische procedure kan worden bereikt door elektrocauter of diode laser.
    3. Gebruik met katoen getipt speren of applicatoren om de toepassing van gelokaliseerde druk op kleine vaten die bloedverlies bijhouden, mogelijk te maken.
    4. Gebruik met katoen getipt speren of applicatoren om kleine krappe ruimtes te beheren in plaats van standaard gaas pleinen.
    5. Gebruik micro-instrumenten, zoals oftalmologische instrumenten, met fijne, kleine tips, wanneer u een operatie uitvoert op dieren met een gewicht van minder dan 1 kg.
    6. Gebruik plastic, zelfvoorzienende OPROLMECHANISMEN (bv. Lone Star oprolmechanisme) om te passen in verschillende maten incisies.
    7. Gebruik ooglid OPROLMECHANISMEN voor het intrekken van coelomic incisies.
    8. Gebruik vergrotings instrumenten waar nodig voor het uitvoeren van een operatie aan kleinere patiënten.
      Opmerking: analgesie is vereist bij elke chirurgische ingreep in amfibieën. Het niet toedienen van adequate analgesie tijdens de operatie is in verband gebracht met vertraagde terugkeer van normale functies. Bovendien potentieert analgesie de effecten van anesthetica (tabel 3)34.
  2. Kikvorsachtigen
    1. Zodra X. laevis is verdoofd zoals beschreven in stap 1.5.1, Positioneer het dier dan in dorsale ligpositie (Figuur 10A, C).
    2. Bereid het chirurgische veld aseptisch voor door vochtig steriel gaas met verdunde Povidon-jodiumoplossing (1/10) op de plaats voor 10-15 s of 0,75% chloorhexidine-oplossing op de operatieplaats te vegen gedurende ten minste 10 minuten voor de operatie35.
    3. Maak een 3 mm paramedische huid incisie in het midden coelom (tussen de schouders en de cloaca) met een vette beroerte verlaten van een schone incisie met behulp van een No. 15 of No. 11 scalpel.
      Opmerking: men kan een diode laser ook gebruiken voor huid incisies.
    4. Verhoog het abdominale membraan, maak en incisie en ontleden zorgvuldig met behulp van een No. 15 of No. 11 scalpel. (Figuur 10B, D).
    5. Trek de coelomische incisies op met ooglid OPROLMECHANISMEN (of passende apparatuur).
    6. Accijns een deel van de Eier massa zonder liggende bloedvaten.
    7. Voor volledige ovariectomie, cauteriseren omringende bloedvaten door elektrocauterie of laserdiode (Figuur 11).
    8. Met behulp van monofilament hechtmiddel, nauwe celiotomie incisie met een onderbroken, everting hecht patroon.
  3. Caudates
    1. Zodra een. mexicanum is verdoofd, plaats het in de juiste laterale ligigheid, met het linker bekken ledemaat eenvoudig tegen de staartbasis geplaatst.
    2. Bereid het chirurgische veld aseptisch door het plaatsen van vochtig steriel gaas met verdunde Povidon-jodiumoplossing (1:10) op de plaats voor 10-15 s. alternatief, gebruik steriel gaas geweekt in 0,75% chloorhexidine oplossing en plaats op de operatieplaats voor ten minste 10 min vóór de operatie (figuur 12a)36,37 .
    3. Teken een lijn tussen de schouder en de achterpoten om het lichaam in drie gelijke delen te verdelen (figuur 12B).
    4. Maak de incisieplaats tussen de tweede en derde delen.
    5. Pak de onderliggende spier en til weg van de coelomic Viscera.
    6. Voorzichtig te forceren kleine hemostatica door de coelomic spier massa en in de coelomic holte.
    7. Trek de coelomische incisies op met ooglid OPROLMECHANISMEN (of enig geschikt materiaal) (figuur 12C).
    8. Voor volledige ovariectomie, cauteriseren omringende bloedvaten door elektrocauterie of laserdiode (figuur 12D).
    9. Met behulp van monofilament hechtmiddel, nauwe celiotomie incisie met een onderbroken, everting hecht patroon.

Resultaten

Morphometrie en reproductie

Visualisatie van de vrouwelijke reproductieve status in amfibieën varieert afhankelijk van de soort. De meest effectieve methode is echografie; Sommige soorten kunnen echter een verschillende mate van transparantie van hun huid vertonen (figuur 13a, B, C). Visuele inspectie kan vaak duidelijk de verschillen illustreren tussen een zwangere en een niet-zwangere vrouwtje wanneer de huid halfdoorzichtig is, zoals waargenomen in n. alabamensis en n. maculosus (figuur 13a, B); of doorschijnend zoals geïllustreerd door de glazen kikker (figuur 13C). De donker gevlekte huid kleuring op de buik van N. beyeri verbiedt deze beoordeling. In R. Schorsmarpissa, de huid is niet doorschijnend, maar merkbare verschillen kunnen worden gedetecteerd tussen vrouwtjes die zwangere zijn in vergelijking met degenen die onlangs hebben oviposited omdat de huid slap is, en het dier ziet er dunner (gele lijn) in vergelijking met een vrouwelijk dat is zwangere (blauwe lijn) (figuur 13D). Met ervaring kan de handler zich vertrouwd maken met het verschil tussen een grote vrouw en een zwangere één, maar de bevestiging van zwangere stage zal echografie vereisen. Body Mass indices in amfibieën kunnen worden berekend met behulp van een aantal formules, maar hun toepassing als een voorspellend instrument voor reproductie is betwisbaar. In het geval op R. Schorsmarpissa, correlatie tussen Fultons index, gezondheid en reproductieve status blijft onduidelijk.

Voortplantingsgedrag en echografie

Onze resultaten laten zien hoe het voortplantingsgedrag in R. Schorsmarpissa karakteriseren voor de voorspelling van ovipositie (Figuur 4). Verschillende stadia van enkele uren tot enkele weken omvatten, hofmakerij waar een man actief achtervolgt een vrouwtje (figuur 4a), de mannelijke mounts en stevig gespen op de rug van de vrouw, genaamd in (figuur 4b). Eenmaal geamplexed, het paar kan blijven in in voor 1 – 5 weken en het paar zal andere gedragingen naast in weer te geven. Amplexus is een zeer actief gedrag dat omvat de mannelijke knijpen het vrouwtje in een zachte pompende manier (figuur 4c); het vrouwtje beweegt rond en begint met af en toe hand-standgedrag weer te geven (figuur 4D, E); en dichter bij de tijd van oviposition, het vrouwtje, in een hand-stand, zal leunen tegen oppervlakken die ze eieren kan vasthouden op terwijl de man haar buik krachtig pompt (in dit geval is het mogelijk om ook observeren de vrouwelijke wrijven haar buik naar beneden van onder haar arm kuilen naar de cloaca. Dit kan een mechanische manier zijn om eieren langs de oviducts te duwen) (figuur 4F, G).

Deze studie illustreert hoe echografie informatie kan bieden waarmee de reproductieve status in vrouwelijke R. Schorsmarpissa en Necturus wordt vastgesteld. Vier stadia van ontwikkeling zijn vertegenwoordigd in R. Schorsmarpissa (figuur 5c, D, E, F) en worden ook gekarakteriseerd in Necturus4 (Figuur 6a, B, C). Bovendien kunnen residuele eieren niet worden uitgezet, wat leidt tot het vasthouden van eieren (figuur 5g, figuur 15a, B). Fase 1 toont een eierstok direct na ovipositie waar follikels moeilijk te visualiseren zijn (figuur 5c). Fase 2 wordt weergegeven door het verschijnen van echogene stippen (witte vlekjes) die in de eierstok zijn verspreid (figuur 5d). Fase 2 en 3 worden vertegenwoordigd door grotere, afgeronde echogene stippen met donkere centra die bespannen medium tot grote follikels vertegenwoordigen (figuur 5e, F). Van 2013-2017, gevangen vrouwelijke Necturus werden onderzocht door echografie op een maandelijkse basis. Tijdens elk examen werden individuen een cijfer score toegekend volgens de voortplantings criteria die voor het geslacht werden vastgesteld (tabel 2). Het percentage vrouwtjes dat jaarlijks nieuwe eieren ontwikkelt, gemiddeld 88,2 ± 3,01% (tabel 5). Terwijl de ontwikkeling van eieren hoog was, werd ovipositie niet verzekerd (Figuur 16). Een meerderheid van de vrouwtjes die ovipositie onderging de volledige aanvulling van eieren afgezet, terwijl sommige individuen slechts een fractie van de eieren die zich ontwikkeld nedergelegd. Die R. Schorsmarpissa en Necturus vrouwtjes met ingehouden eieren gelijktijdig met vloeibare winst in de lichaamsholte waren naar buiten visueel vergroot met rode vlekken op de huid consistent met burst bloedvaten (figuur 14a, B ) . De mate van vochtretentie kan verder worden beoordeeld via echografie (figuur 15B). In beide soorten onderhielden de bewaarde eieren atresie of namen ze een meer echogene uitstraling aan (figuur 14c, D, figuur 15a).

Hormoon toediening

Afhankelijk van de diepte van het type injectie zal de hoek en de diepte van de naald variëren. Voor de meeste injecties moet de diepte van de naald niet meer dan 1 -2 mm diep zijn bij het werken met soorten zoals R. Schorsmarpissa , maar zal variëren in de invalshoek van de penetratie. Prostaglandin injecties vereiste een intra-gespierde (IM) naald inbrengen haaks op 90 °, in de achterpoot van R. Schorsmarpissa terwijl intra-peritoneale (IP) injecties, met een vergelijkbare diepte voor intra-gespierde injecties, werden toegediend in het gebied van de coelomische holte bij een 45 ° (Figuur 10). De toediening van Amphiplex had geen significant effect bij het verhogen van het aantal eieren dat werd afgezet door met hormonen behandelde vrouwtjes in vergelijking met controles (P = 0,547), noch waren er verschillen in het aantal embryo's dat gecleaved was (P = 0,673) of overleefde naar Tadpole (P = 0,629) (tabel 4). In het algemeen, het percentage van de vrouwtjes ovipositing daalde van 80% in 2011 aan 28% in 2014. Het aantal vrouwtjes ovipositing in 2015 was significant hoger dan 2013 (P = 0,0002), 2013 (P = 0,0001) en 2014 (P = 0,0026) maar niet 2011 (P = 0,0885), bevestigt het idee dat vrouwtjes van deze soort niet jaarlijks mogen fokken en dat hormonale protocollen in. Voor R. Schorsmarpissa vrouwtjes met tekenen van het bewaren van het ei, intra-gespierde injecties van pgf2α had een 60% slagingspercentage in inducerende uitzetting van degenererende eieren. Echter, in 1 van de 5 vrouwtjes geïnjecteerd, PGF2α was niet voldoende om volledige uitzetting veroorzaken en sommige eieren bleef in het vrouwtje tot het volgende broedseizoen. Zeventien Necturus vrouwtjes kregen LHRH/(GnRH) en 13 kregen een schijninjectie van steriel water om te dienen als een controle (tabel 5). In totaal gingen zeven vrouwelijke Necturus (n = 4 alabamensis, n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) naar oviposit elf volledige klauwen die werden toegeschreven aan beide GnRH behandeld (n = 6) en controle (n = 5) individuen. Drie vrouwtjes (n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) oviposited vijf gedeeltelijke klauwen (Figuur 13). Dit fenomeen leek niet te worden geassocieerd met exogene hormoonbehandeling als drie controle vrouwtjes op dezelfde manier afgezet gedeeltelijke koppelingen (tabel 5). Oviposition trad op gedurende een periode van 37 dagen (3/31-5/7) in de loop van vijf jaar (tabel 5). Er was geen verschil (P = 0,194) in ovipositie tarieven tussen LHRH/GnRH behandeld (41 ± 13,08%, bereik 17-67%) en controle (66,75 ± 11,79%, bereik 50-100%) Vrouwen. LHRH/GnRH behandelde vrouwtjes afgezet eieren gemiddeld 7,44 ± 1,41 (bereik 3-13) dagen na de injectie. Gezien de volledig aquatische aard van de soort en onvermogen om handmatig te bedwingen zonder anesthesie was het noodzakelijk om te zorgen voor een passend niveau van sedatie voor het uitvoeren van IP-hormoon injecties (zie paragraaf 3,2 voor instructies over anesthesie).

Bloedafname, anesthesie en chirurgie

De bloedbemonsterings techniek in dit artikel werd genomen van forzan et al. 201310 en heeft bewezen een effectieve manier om bloed te verzamelen van R. Schorsmarpissa met minimale invasiviteit en stress. Met behulp van microhematocriet buizen kan ongeveer 35-45 μl plasma of serum worden opgevangen per 70 μL volbloed (Figuur 7). Maximum afname volume in R. Schorsmarpissa was 1 volledige microhematocriet buis per 10 g kikker, tot 4 tubes per kikker voor kikkers 40 g en groter. Dit was een conservatief Verzamel volume van 0,7 mL per 100 g, 70% van de maximale aanbeveling van 1,0 mL per 100 g (aangepast van Allender en Fry, 2008)13.

Anesthesie en chirurgie in amfibieën worden zelden gerapporteerd, maar het is belangrijk op te merken dat de doses en werkzaamheid zal variëren in een soort-specifieke manier. In Bombina orientalis bijvoorbeeld, heeft MS222 een zeer laageffect, zelfs met hoge doses (1 g/l) terwijl in boreale Toads, Anaxyrus boreas Boreas, 1 g/L is snel (materie van minuten) en langdurig (3 + h) (Calatayud, persoonlijke observatie). In R. muscosa, anesthesie vereist doses gemeld voor A. Boreas Boreas en heeft een soortgelijk effect en hersteltijden. Vasten amfibieën voorafgaand aan anesthesie is meestal niet nodig als hun strottenhoofd blijft strak gesloten, zelfs onder algemene anesthesie. Echter, indien noodzakelijk geacht, vooral als de verdoving procedure is het opnemen van celomic chirurgie, dieren kunnen worden gefaald 24 h voorafgaand aan de anesthesie.

Tijdens de operatie is de rechtse reflex de primaire indicator dat het dier verdooniseerd is geworden. De rechtse reflex is het vermogen en de mate van gemak waarmee een dier rechtop kan terugkeren nadat het op zijn rug is geplaatst. Verlies van de reflex suggereert een lichte fase van anesthesie. Een chirurgische vlak wordt aangegeven door verlies van de Onttrekkings reflex die licht trekt aan de ledemaat om het recht te trekken en het dier niet langer in staat is om het op te nemen7. Een voortplantings operatie heeft geen overweldigende obstakels en de amfiomen patiënten genezen voornamelijk goed tolererend bloedverlies dan hogere gewervelde dieren. Chirurgie moet snel doorgaan, duurt ongeveer 15 minuten van begin tot eind. De stappen moeten ongeveer als volgt worden getitreer: < 1 minuut voor de initiële incisie en < 2 minuten voor celiotomie en oprolmechanisme, < 2-3 minuten voor isolatie per eierstok en < 1 minuut voor de hechting van het vat of cauterisatie en huid hechting < 4 minuten. De totale hersteltijd na de operatie met MS222 protocollen zijn ongeveer 45 minuten, maar dit kan soortspecifiek zijn. In A. Boreas Boreas en R. Schorsmarpissa hersteltijden kunnen langer zijn, tot 1 – 2 h. Bij het uitvoeren van een operatie moet voorzichtigheid worden gegrepen om te voorkomen dat de longen, het maagdarmkanaal of een gedistingeerd blaas worden geprikt, en niet om de macroscopische klieren, lymfe harten en bloedvaten te beschadigen, vooral de mid-ventrale ader. Afhankelijk van het seizoen kan de aanwezigheid van grote vetlichamen de visualisatie van andere organen moeilijk maken. Eenmaal zichtbaar wakker, worden de reacties van een dier op de stimulatie van de ledematen, zoals weerstand tegen een zacht uitrekken van een achterste ledemaat of knipperen wanneer het gebied rond het oog wordt gestimuleerd (persoonlijke observatie), geclassificeerd als terugtrekkings responsen. De rechts reflex samen met andere herstelindicatoren, waaronder de terugtrekking reflexen en IG bewegingen, zijn belangrijke indicatoren van herstel.

Administration
Algemene naamSoort(en)HormoonProcedurePriming compoundPriming dosis gemeldAantal priming dosesTiming (HR voorafgaand aan de ovulatoire dosis)Samenstelling (en) toegediend voor de uiteindelijke ovulatory/ovipositionDosesVerwijzing
Puerto Ricaanse kuif padLemur van peltophryneGnRH & hCGIpHcg1,5 IU/g2hCG-48GnRH HCG GnRHa + hCG0,2 μg; 4 IU; 0,5 μg + 4 IECalatayud et al. ongepubliceerd
Berg geel-legged kikkerRana SchorsmarpissaAmphiplex, LutIpGnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH)0,4 μg/g124GnRH + MET1 x 0,4 μg/g + 10 μg/gCalatayud et al., 2018
PGF2αImPGF2α5 ng/g148PGF2α5 ng/g
Zuidelijke rotsachtige berg boreale padAnaxyrus boreas BoreashCG, GnRHIpHcg3,7 IU/g296, 24hCG + GnRHa13,5 IE/g + 0,4 μg/gCalatayud et al., 2015
Noordelijke cricket kikkerAcris crepitanAmphiplextoegevoegd aan water (10 mL)GeenGeen0naGnRH + MET0,17 μg + 0,42 μg/μlSnyder et al., 2012
Noordelijke Luipaard kikkerLithobates Culex pipiensAmphiplexIpGeenGeen024GnRH + MET1 x 0,4 μg/g + 10 μg/gTrudeau et al., 2010
Argentijnse gehoornde kikkerOrnataAmphiplexIpGeenGeen024GnRH + MET1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Cranwell de gehoornde kikkerCeratophrys cranwelliAmphiplexIpGeenGeen024GnRH + MET1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Amerikaanse grond kikkerGewone zwarte dwergAmphiplexIpGeenGeen024GnRH + MET1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Donkere kikkerRana sevosahCG, GnRHIpHcg3,7 IU/g296, 24GnRH + hCG1 x 0,4 μg/g + 13,5 IE/gGraham et al., 2018
Algemene coquiEleutherodactylus coquiVis, aviaire, zoogdier & GnRH (D-Ala, des-Gly, ETH LHRH), hCGScmLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; HcgGeen0namLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg7μg, 33 μg; 28μg; 7μg, 20μg; 5, 10, 15, 20 μg; 165 IUMichael et al 2004
Gunther van zadelpadGepseudophryne guentheriGnrhGnRHa0,4 μg/g126GnRHa met of zonder priemgetal0,4 μg/gSilla 2010
Bevestiger kikkerPseudophryne bevestigiLucrinScLucrin1 μg126Lucrin5 μgByrne & Silla, 2010
Noordelijke bevestiger kikkerPseudophryne pengilleyiGnRHa GnRH (D-Ala, des-Gly, ETH LHRH)TaGeenGeen0naGnRHa0,5-2,0 μg/gSilla et al., 2017
Gulf Coast WaterhondNecturus beyeri[des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RH ethylamideacetaat zout hydraatIpGeenGeen0naLHRH100 μg/500 μLStoops et al., 2014
Zuidelijke Bell kikker/growling gras kikkerLitoria raniformisdes-Gly10, D-Ala6-[LHRH]ScGeenGeen0nades-Gly10, D-Ala6-[LHRH]50 μgMann et al., 2010
Pad van FowlerAnaxyrus fowleriGnRH, hCG, P4IpHcg3,7 IU/gBrowne et al., 2006
Axolotl (Mexicaanse salamander)Ambystoma mexicanumFollikelstimulerend hormonenImGeenGeen0naFsh400IUTrottier en Armstrong, 1974
Afrikaanse klauwde kikkerXenopus laevishCG & P4toegevoegd water; IpPMSG, hCGMarcec, 2016
TijgersalamanderAmbystoma tigrinumhCG, LH
Wyoming padAnaxyrus baxterihCG, GnRHa, P4IphCG + GnRHa100 IU + 0,8 μg172hCG + GnRHa100 IU + 0,8 μgBrowne et al., 2006
Noordelijke Luipaard kikkerLithobates Culex pipiensHypofyse-extract (PE), P4, testosteron (T), corticosteron [C], Amphiplex, domperidon (D)SC, IPGeenGeen0naPE, PE + T, PE + P4, PE + C; Amphiplex, GnRH + D~ 100 IU (LHRH) in 1 mL; PE + 0.002 μg/μL; PE + 0,01 mg/50mL; PE + 0,1 mg/50mL; 0,4 μg/g + 10 μg/g;  0,4 μg/g + DWright, 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013
Ground FrogGewone oecumeniensisExtracten van de hypofyse, hCG, GnRHa, PZIpGnRHa0,9-1,2 μg/g + PZ 10 μg/g120PE PE + hCG; GnRH + PZPE vol; PE vol + 100 IU hCG; GnRH (0,9-1,2 μg/g) + PZ (10μg/g)Clulow et al., 2018
Groene en gouden Bell kikkerLitoia AureaGnrhIpGnRHa10 μg172GnRHa + hCG20 μg + 300 IEClulow et al., 2018
Grote gestreepte kikkerGewone boktorhCG & PMSGScPMSG, hCG50 IU & 25 IE; 1x100 IE2 2PMSG-144 & 96;  hCG-24Hcg100IUClulow et al., 2012
Voor meer hormoon protocollen en soorten Zie Wright en Whitaker, 2001

Tabel 1: Amfian soorten en enkele van de exogene hormonen die op hen zijn getest zoals gerapporteerd in de literatuur. Humaan choriongonadotrofine (hCG); Gonadotropin Releasing-hormoon (GnRH); Lutenizing hormoon-releasing hormoon (LHRH); de letters m, a en f vertegenwoordigen "zoogdier", "aviaire" en "vis"; zwangere merrie serum gonadotrofine (PMSG); progesteron (P4); Follikelstimulerend hormoon FSH); hypofyse-extract (PE); testosteron (T); corticosteron (C). Dopamine antagonisten vermeld omvatten: domperidon (D); Pimozide (P); Metoclopramide (MET). Amphiplex is de naam gegeven aan een verbinding die bestaat uit GnRH en Metoclopramide27. Lucrin is een in de handel verkrijgbare GnRH-agonist met het werkzame bestanddeel Leuprorelin acetaat. 4 , 7 , 17 , 18 , 19 , 20 , 26 , 27 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45

RangReproductieve statusBeschrijving
0Niet-gravidGeen eieren zichtbaar.
1Vroege zwangereEieren zichtbaar (1-2mm in grootte) geen aparte echogene lijn geassocieerd met ei.
2Mid zwangereEieren 2-3mm in grootte, verschillende echogene lijn (en) geassocieerd met elk ei.
3Late zwangereEieren 4-5mm in grootte, echogene lijnen nog steeds zichtbaar, duidelijke toename van de anechoïsche verschijning van ei.
4Bewaarde eierenVerschillende graden van echogene materiaal aanwezig in interne Eier structuur, nemen op amorfe vorm. Sommige kunnen zeer echogene en in verband met vochtretentie in de lichaamsholte worden.

Tabel 2: beoordelingssysteem dat wordt gebruikt om de reproductieve toestand van vrouwelijke Necturus in gevangenschap te scoren Rana Schorsmarpissa door ultrasonografie.

DrugDosering en routeOpmerkingen-referentie
Buprenorphin50 mg/kg (intracelomic)Experimentele studie in een oostelijk rood gevlekte newt (Notophthalmus viridescens). Analgesie moet worden gegeven voor de operatie. (Koeller, 2009)
Butorphanol1 – 10 mg/kg (IM of intracelomic)Er zijn verschillende specifieke respons. Het wordt geadviseerd om te beginnen bij 1 mg/kg.
Butorphanol0,5 mg/L (bad)Experimentele studie in een oostelijk rood gevlekte newt (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009)
Fentanyl1 mg/kgAnalgesie > 4 h, voortdurend door naltreone (Stevens, 1997)
Meloxicam0,1 tot 0,2 mg/kg (IM)(Minter, 2011)

Tabel 3: protocollen voor analgesie in amfibieën.

Rana Schorsmarpissa
Jaar20142015
Nr. ♀1818
Eier ontwikkeling61%94%
Controle ♀46
Amphiplex ♀47
Gemiddelde dag na Amphiplex naar oviposit10,510,9
Ovipositie rate (Amphiplex)22,20%33,33%
Oviposition rate (controle)22,20%38,88%

Tabel 4: vergelijking van de voortplantingsparameters tussen het amphiplex-behandelde in vergelijking met de vrouwelijke controle Rana Schorsmarpissa in 2014 en 2015.

Necturus sp.
Jaar12345
Nr. ♀67777
Eier ontwikkeling83%100%86%86%86%
LHRH ♀35360
Controle ♀22306
Dag na-LHRH naar Oviposit575,5 (bereik 3-8)13N/a
Ovipositie rate (LHRH)60%2067%17N/a
Oviposition rate (controle)50%50%100%N/a67%
* n = 1 ♀ geen Eier ontwikkeling

Tabel 5: vergelijking van reproductieve parameters tussen LHRH (GnRH) -behandelde en controle (steriel water) gevangen vrouw Necturus van drie soorten over een periode van 5 jaar (2012-2017).

figure-results-1
Figuur 1: drie methoden voor het vasthouden van een kikker. A) procedure 1. B) procedure 2. C) procedure 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Morfometrische Beoordelingen. (a, B) SVL/SUL (C, D). gewicht, in R. Schorsmarpissa en D. Necturus. (E). maat meting met remklauwen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: seksueel dimorfisme onderscheidt zich door huwelijksevoorwaarden duim pads op volwassen R. Schorsmarpissa mannetjes in vergelijking met vrouwtjes. A) vrouwelijk (B) mannelijk. Het onderste paneel toont de lengte van mannelijke versus vrouwelijke. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: karakteriseren van het voortplantingsgedrag leidend tot ovipositie in R. Schorsmarpissa A) Courting. B) amplexus. C) mannelijke knijpende vrouwtjes terwijl in amplexus. (D, E) Geamplexed vrouwtje in een hand-stand. (F, G) Abdominale contracties en oviposition. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: echografie uitgevoerd op R. Schorsmarpissa A-B met reproductieve status volgens ontwikkelingsfase4. (A, B) het uitvoeren van echografie op Rana muscosa. C) graad 0. D) graad 1. (E) graad 2. F) graad 3. G) graad 4 (ovulated en bewaarde eieren) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Echografisch beeld van Necturus. A) graad 1. B) graad 2. C) eieren van klasse 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: bloedafname in R. muscosa. A) bloedafname door het prikken van de Vena orbitalis posterieure de gezichts ader net boven de kaaklijn in het midden van de baan. (B, C) Bloed komt vrij op het huidoppervlak en wordt opgevangen met een gehepariniseerd capillaire buis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: injectie methoden bij amfibieën. Afhankelijk van de diepte van het type injectie zal de hoek en de diepte van de naald variëren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: hormonale injectie in R. muscosa. Inductie van ovipositie door hormonale behandeling in Rana Schorsmarpissa vrouwtjes geïnjecteerd met amphiplex intra-peritoneaal. Eierstokken kunnen worden gevonden in de coelomic holte Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: voorbereiding voor de operatie. A) aseptisch preparaat van het chirurgische gebied met behulp van verdunde Povidon-jodiumoplossing (1/10), Trachycephalus resinifictrix. B) Reinig de scalpel incisie in een Xenopus laevis of, (C) laser-diode huid incisie, Lithobates catesbeianus. D) Vermijd beschadiging van de mid-ventrale ader, Trachycephalus resinifictrix. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: Ovariectomie in Xenopus laevis. A) grote vetlichamen blootstellen en verplaatsen om de eimassa te achterhalen. B) de accijns een deel van de Eier massa zonder dat de bloedvaten worden afzeend. C) de omringende bloedvaten door elektrocauterie te cauteriseren voor volledige ovariectomie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-12
Figuur 12: pre-chirurgische voorbereiding en ovariectomie in A. mexicanum. A) steriel gaasje, gedrenkt in 0,75% chloorhexidine-oplossing toegepast op de operatieplaats (B). Een lijn tussen de schouder en de achterpoten verdeelt het dier in drie gelijke delen en de blauwe vlek markeert de plaats op incisie. C) de coelomische incisies met oprolmechanismen van het ooglid intrekken. D) voor volledige ovariëctomie, cauteriseren de omringende bloedvaten door elektrocauterie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-13
Figuur 13: visuele beoordeling van de voortplantings stadia. (a, B) Visuele evaluaties van de reproductieve fase door middel van semi-doorschijnende huid, Necturus. C) doorschijnende huid, Hyalinobatrachium (glazen kikker). D) visuele beoordeling van R. Schorsmarpissa vóór (rechts, blauwe lijn) en na ovipositie (linker-gele lijn). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-14
Figuur 14: het bewaren van eieren. (a, B) Vrouwelijke Rana Schorsmarpissa met ernstige geval van ei retentie. (C) echografie toont oude degenererende, eieren (boven) en grotere eieren (middelste en onderste paneel) de en gevangen in de coelom. D) bewaarde eieren die door manuele strippen zijn opgezocht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-15
Figuur 15: Ultrasone beelden van ingehouden eieren in Necturus die (a) echogeen in uiterlijk (cirkel) werden en geassocieerd zijn met (B) vochtretentie in de lichaamsholte (pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-16
Figuur 16: percentage vrouwelijke Necturus in gevangenschap dat volledige of gedeeltelijke klauwen (2013-2017) in vergelijking met die welke niet oviposit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Directe handling, visuele observatie en Morfometrische maatregelen bieden niet-invasieve technieken en zijn de eerste beoordelingscriteria voor het bepalen van het voortplantings stadium van de vrouw. Deze studie toont echter aan dat zwangere eierstokken niet altijd betrouwbaar geïdentificeerd kunnen worden door palpatie. Afhankelijk van de soort kunnen zwangere eierstokken soms visueel worden gedetecteerd via semi-doorschijnend (figuur 13a, B) of volledig doorschijnende huid aan de ventrale zijde van het dier (figuur 13c). Vrouwtjes die ovipositie hebben voltooid, kunnen duidelijke veranderingen in hun uiterlijk vertonen in vergelijking met zwangere-vrouwtjes (bijv. losse huid en verlies tot 30% van hun lichaamsmassa, figuur 13D). Tijdens de fokkerij zullen mannetjes en vrouwtjes bepaalde gedragingen vertonen die informatie geven over de nabijheid van ovulatie en ovipositie. In het geval van R. Schorsmarpissa indicaties dat een vrouwtje is dicht bij ovipositie beginnen met de vrouwelijke invoeren van handstands.

De toepassing van ultrasone technologie op anuranen en caudates maakt de diagnose van de aanwezigheid of afwezigheid van eieren mogelijk en of ovipositie geassocieerd is met volledige of gedeeltelijke afgifte van ontwikkelde eieren. Deze methode biedt dus een vollediger en nauwkeurigere beoordeling van de reproductieve status zonder te worden beperkt tot het bepalen van de status van gravid/non-gravid via een visualisatie techniek die varieert door de transparantie van de buikhuid, of epidermale consistentie tussen de verschillende soorten amfian. Echografie kan met relatief gemak worden uitgevoerd en met weinig stress voor de dieren (Figuur 5 en Figuur 13) en kan worden gebruikt om voortplantingscycli te karakteriseren en om de reproductieve status4te bepalen. Het is van cruciaal belang om vertrouwd te raken met de soort; Deze studie toonde echter aan dat Necturus en R. Schorsmarpissa gemeenschappelijke ontwikkelings verschijnselen in hun voortplantings patronen delen, waardoor een vergelijkbare classificatie van het voortplantings stadium mogelijk is (Figuur 5). Door deze technologie is er nu bewijs dat de ontwikkeling van eieren hoog in gevangenschap Necturus en R. Schorsmarpissa is en dat beide soorten een seizoenspatroon volgen. Hoewel de redenen voor deze verschijnselen zijn onbekend en vereisen verder onderzoek, zonder het gebruik van echografie, verschillende gebieden van ovariële dysfunctie, zoals ei retentie en gedeeltelijke oviposition, zou zijn gegaan onopgemerkt. Toekomstige toepassingen van deze techniek zullen worden gebruikt om te bepalen of vrouwtjes in een bepaald jaar voor de fokkerij moeten worden geselecteerd en of ovipositie volledig is.

Een bloed collectie protocol, zoals die gepresenteerd in R. Schorsmarpissa, die is zowel effectief en veroorzaakt minimale nood aan het dier, is optimaal om te bestuderen van hormoon profielen in gevangenschap en wild gevangen anurans (Calatayud, ongepubliceerd). Tot op heden, geen informatie bestaat over de jaarlijkse hormoon profielen van Captive R. Schorsmarpissa en, daarom, geen kennis over hoe hormonen hun gezondheid en reproductie beïnvloeden. Bovendien, met bewijs dat vrouwtjes van deze soort mag niet jaarlijkse fokkers, hormonale profilering zal een andere methode voor het volgen van ovariële cycli. Samen met echografie, hormoon analyse kan leiden tot betere voorspelling van wat vrouwtjes klaar voor oviposition zijn zal. Bovendien zijn in het afgelopen jaar twee gevallen van interseksuele in de gevangen R. Schorsmarpissa populatie gedocumenteerd. Bovendien, de ontwikkeling van duim pads is genoteerd op enkele van de oudere founding vrouwtjes. Redenen hiervoor worden momenteel onderzocht, maar de eerste resultaten suggereren dat het kan betrekking hebben op veranderingen in testosteron niveaus (Calatayud, ongepubliceerd). Veeleisende hormonale cycli bij vrouwtjes van verschillende leeftijden zal ons helpen begrijpen waarom vrouwtjes mannelijk-geassocieerde secundaire geslachtskenmerken kunnen ontwikkelen en of dit is te verwachten in een verouderende populatie.

Exogene hormoontherapie is gebruikt om te overwinnen van reproductieve disfuncties vaak aangetroffen in gevangenschap amfibieën. Echter, voor zowel R. Schorsmarpissa en Necturus populaties in deze studie, geen significante verschillen in ovipositie tussen hormoon-behandelde en controle vrouwtjes werden gedetecteerd over een periode van 2 en 5 jaar, respectievelijk. Dit kan erop wijzen dat hormoon Administration protocol, doses, priming en hormoon combinatie gebruikt was niet voldoende voor de soort. Nauwere analyse van de individuele vrouwelijke reproductieve geschiedenissen suggereert R. Schorsmarpissa mag niet ervaren jaarlijkse fokken, die ook rekening kan worden gehouden met het gebrek aan hormonale effect waargenomen bij behandelde vrouwtjes. Omdat een bepaald percentage van de vrouwtjes consequent het fokken elk jaar overgeslagen, inzicht in de natuurlijke geschiedenis van de soort kan helpen bepalen of er behoefte is aan exogene hormonen en wanneer ze het meest effectief kunnen zijn. De in dit artikel beschreven procedures kunnen worden toegepast op een aantal soorten (tabel 1) en zijn voor anuranen variërend van 5 g tot 150 g; grotere dieren kunnen verschillende spuiten en naald manometers vereisen. De locatie van de injectie varieert met sommige hormonen die intra-musculaire, intra-peritoneale, sub-cutane of intradermale injectie vereisen (Figuur 7).

Chirurgie voor het doel van ovariëctomie is een gemeenschappelijke methode die wordt gebruikt in verschillende amfibetische soorten om eicellen voor embryologische studies te verkrijgen. Ovariectomie kan ook geïndiceerd zijn voor populatie beheersing en medische kwesties zoals het bewaren van eieren. In het geval van partiële ovariectomieën waarbij het oogsten van eicel wordt uitgevoerd voor onderzoeksdoeleinden, moet de operatie ervoor zorgen dat het dier nog steeds reproductief is. Toediening van pgf2α heeft een belofte aangetoond in het oplossen van de retentie van eieren bij vrouwelijke R. Schorsmarpissa. In verschillende individuen heeft PGF2α volledige afzetting van eerder bewaarde eieren opgewekt, maar in andere gevallen trad alleen gedeeltelijke depositie op waarbij handmatige strippen nodig was om alle eieren te verwijderen. Terwijl pgf2α kan dienen als een alternatief voor chirurgie voor het bewaren van eieren in R. Schorsmarpissa, haar vermogen om vergelijkbare pathologische omstandigheden in andere amfibieën te verhelpen, zal soortspecifieke validatie vereisen. Wanneer chirurgische interventie is voorgeschreven voor de Anuran of Caudate patiënt, is het noodzakelijk om te zorgen voor een adequaat vlak van anesthesie voordat incisies worden gemaakt. Astute observatie vaardigheden zijn nodig om de normatieve inductie-en herstel responsen te beoordelen en te monitoren, zoals beschreven in deze studie voor elk van de taxa. Zodra men bekend is met de specifieke anatomie, een geschikte chirurgische aanpak, hemostase, zachte weefsel manipulatie en adequaat postoperatieve Management, vormen reproductieve chirurgie geen overweldigende obstakels.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Natalie heeft graag Dr. Barbara Durrant willen bedanken voor trainingen en assistentie bij echografie en voor Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) voor het toekennen van financiële steun aan mijn Research Associate position bij SDZG. Dank aan Dr. Kylie Cane voor commentaar op het manuscript en de officiële reviewers (wie ze ook mogen zijn). Met dank aan Jonathan Dain onze 2018 Summer Fellow, San Diego Zoo Institute for Conservation Research voor het leveren van Foto's (Figuur 1a, B). Monica Stoops breidt de waardering uit voor de vereniging van dierentuinen en aquaria Conservation Endowment Fund en het Disney wereldwijde instandhoudings Fonds voor het verstrekken van financiële steun aan het vestigen van de in gevangenschap levende Necturus -bevolking. Daarnaast werd ook ondersteuning ontvangen via privé donaties van de advocaat van amfijokken MS. Iris de la Motte. Bedankt, wordt gegeven aan de heer Christopher DeChant en Dr. Mark Campbell voor hun belangrijke bijdrage aan het onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical SystemsGE medical systemsGE logiq Book XPUltrasound
Aloka 500 7.5mHz lineair of IBEX multi-frequentie (10-6mHz) micro-convexGE medical systems8C-RS (10 MHz)Ultrasound probe
BD wegwerp U-100 insulinesyringe (28-29 G naald)Mettler Electronics Corp CASonigelUltrasound gel (wateroplosbaar, zout-vrij)
Hormoon
Gonadotropin releasing hormoonBACHEM4012028synoniem: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetaat
afkorting: GnRH
Lutenizing hormoon releasing hormoonBACHEM, Sigma-Aldrich4033013;     L1898synoniem: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetaat zout;
[D-Ala6}-LHRH acetaat zout hydraat
afkorting: LHRH
Humaan choriongonadotrofineBACHEM, Sigma-Aldrich4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10synoniem: Choriongonadotrofine-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
afkorting: hCG
Prostaglandine 2αSigma-AldrichP40424;synoniem: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dieenzuur tris-zout, PGF2α−Tris;
afkorting: PGF2α
Follikelstimulerend hormoonSigma-AldrichF4021, F8174synoniem: porcine, schapen
afkorting: FSH
ProgesteronSigma-Aldrich46665;      P7556synoniem: Vetranal; P4 wateroplosbaar
afkorting: P4
Hypofyse extractnasynoniem: Controleer de papieren voor de afkomst van amfibieënsoorten
afkorting: PE
Pregnant Mare Serum GonadotropinProspec;      Lee Biosolutions; Sigma-AldrichHOR-272;    493-10; 9002-70-4synoniem: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
afkorting: PMSG
MetaclopromideSigma-AldrichM0763synoniem: 4-Amino-5-chloorchloor-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
afkorting: MET
LucrinBACHEM; Sigma-Aldrich4033014;   L0399synoniem: Leuproreline acetaat
afkorting: Lucrin
LutalysePfizersynoniem: PGF2α - Dinoprost tromethamine
afkorting: Lut
PimozideSigma-AldrichP1793synoniem: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorofenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-on
afkorting: PZ
Amphiplexzie bovensynoniem: Gonadotropin releasing hormoon + metoclopramide
afkorting: GnRH + MET
OvopelOvopelnasynoniem: GnRHa + dopamine receptor antagonist (toegediend 1 pellet/kg)
afkorting: Ovo
OvaprimPentair aquatic eco-systemenOva10synoniem: Zalm gonadotrofine + domperidon
afkorting: Ova
DomperidionSigma-AldrichD122synoniem: 4-(5-Chloor-2-oxo-1-benzimidazoline)-1-[3-(2-oxobenzimidazoline)propyl]piperidine
afkorting: DOM

Referenties

  1. Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
  2. Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311(2013).
  3. Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
  4. Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
  5. National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
  6. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  7. Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020(2018).
  8. Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
  9. Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
  10. Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
  11. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
  12. Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
  13. Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
  14. Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
  15. Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
  16. Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
  17. Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60(2012).
  18. Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34(2006).
  19. Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
  20. Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
  21. Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
  22. Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301(2002).
  23. Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
  24. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6(2004).
  25. Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11(2011).
  26. Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139(2010).
  27. Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36(2010).
  28. Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
  29. Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3(2006).
  30. Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
  31. Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
  32. Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
  33. Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
  34. Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
  35. Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
  36. Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
  37. Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
  38. Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
  39. Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
  40. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6(2004).
  41. Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
  42. Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
  43. Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  44. Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
  45. Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Herprints en machtigingen

Tags

Amfibiereproductieovariectomietechniekechografiehormooninjectiesbloedafnamechirurgische procedureeionwikkelingovariale pathologiebegeleiding in gevangenschap
Voortplantingstechnieken voor het monitoren en beheersen van de eierstokken in amfibieën
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.