Evaluatie van de wisselwerking tussen het complement eiwit C1q en hyaluronzuur bij het bevorderen van de hechting van cellen

Samenvatting

De aanvulling component C1q is een pro-inflammatoire molecuul sterk uitgedrukt in het weefsel microomgeving die kunnen interageren met de extracellulaire matrix. Hier beschrijven we een methode om te testen hoe C1q gebonden aan hyaluronzuur effecten cel adhesie.

Samenvatting

Het is meer en meer aangetoond dat de tumor microenvironment een actieve rol speelt in neoplasie groei en metastase. Door verschillende wegen, kunnen de tumorcellen stromale, immune en endothelial cellen efficiënt aanwerven door stimulerend factoren, chemokines en cytokines af te scheiden. Op zijn beurt kunnen deze cellen veranderen de signalering eigenschappen van de micromilieu door het vrijgeven van groei-bevorderende signalen, metabolieten en extracellulaire matrix componenten om hoge proliferatie en gemetastaseerde competentie te ondersteunen. In deze context, identificeren we dat de aanvulling component C1q, sterk uitgedrukt lokaal door een reeks van menselijke kwaadaardige tumoren, op de interactie met de extracellulaire matrix hyaluronzuur, sterk van invloed op het gedrag van primaire cellen geïsoleerd van de menselijke tumor Specimens. Hier beschrijven we een methode om te testen hoe C1q gebonden aan hyaluronzuur (HA) effecten tumor cel adhesie, ten grondslag liggen aan het feit dat de biologische eigenschappen van de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix (in dit geval HA) kan worden gevormd door bioactieve signalen in de richting van tumor Progressie.

Inleiding

De tumor microenvironment (TME) beïnvloedt de ontwikkeling van kanker en progressie, omdat het kan een tolerante niche voor cel overleving, groei en invasie te bieden. De identificatie van nieuwe belangrijke spelers in TME kan nuttig zijn voor de ontdekking van nieuwe moleculaire hulpmiddelen voor doel therapie. TME omvat een complex en dynamisch netwerk van niet-kwaadaardige cellen, zoals endothelial cellen, fibroblasten en cellen van het immuunsysteem, ingebed in de omliggende extracellulaire matrix (ECM) componenten, waaronder collageen, laminins, fibronectins, proteoglycanen en hyaluronans. Zowel de tumor en niet-tumorcellen synthetiseren en scheiden ECM componenten samen met cytokines, chemokines, groeifactoren en inflammatoire en matrix remodeling enzymen die de algehele verandering van de fysieke, chemische en signalering eigenschappen van TME. Onder deze bestanddelen, hyaluronzuur (HA) is ontstaan om een cruciale rol in de Tumorbiologie uit te oefenen. Ondanks de eenvoudige chemische samenstelling, HA, samen met zijn HA-bindende moleculen (hyaladherins), kan moduleren bloedvat, immuunsysteem responsiviteit en ECM remodeling in een grootte en concentratieafhankelijke wijze¹.

Het complement (C) systeem maakt ook deel uit van de lokale TME, die recentelijk steeds meer aandacht heeft gekregen. Het C-systeem omvat een set van oplosbare en membraan-gebonden eiwitten die betrokken zijn bij de eerste verdedigingslinie tegen niet-zelf-cellen, ongewenste host-elementen en pathogenen. Functioneel, verbindt C de twee-effect wapens van ingeboren en aanpassingssystemen om of directe cel het doden of montage van een ontstekingsreactie²te bevorderen. C de activering kan de tumorgroei onderdrukken, door kankercellen te vernietigen of hun uitgroei te remmen, maar het is steeds duidelijker geworden dat het een tumor-bevorderende activiteit kan bezitten door chronische ontsteking te ondersteunen, bevorderend de totstandbrenging van een immunosuppressieve milieu, inducerende bloedvat, en het activeren van kanker-gerelateerde signalering trajecten³. In deze context, C1q, de eerste erkenning molecuul van de klassieke route van het C-systeem is ontstaan om belangrijke functies uit te oefenen in de tumor microomgeving onafhankelijk van C activering⁴. C1q is aangetoond dat lokaal worden uitgedrukt door een reeks van menselijke kwaadaardige tumoren, waar het kan voorstander van kanker cel adhesie, migratie en proliferatie in aanvulling op bloedvat en metastasen⁵. Interessant C1q wisselwerking met een belangrijk bestanddeel van ECM zoals HA.

We ontwikkelden een techniek om de primaire kankercellen te isoleren van de tumormassa. Verder creëerden we de matrix, die kan stimuleren tumor microenvironment, met name de interactie tussen C1q en hoge moleculair gewicht hyaluronzuur. C1q gebonden aan HA was in staat om de adhesie van de tumorcellen te induceren.

Protocol

De weefselsteekproeven van patiënten werden verzameld na geïnformeerde toestemming na goedkeuring van de ethische overwegingen door de institutionele Raad van het universitaire ziekenhuis van Triëst, Italië.

1. tumor cel isolatie en cultuur (dag 1)

1. Isoleer menselijke mesothelioom cellen van MPM Solid specimens. Fijn gehakt het weefsel met een cutter om fragmenten van ongeveer 2-3 mm² in omvang te verkrijgen en in te broeden in 5 ml van de spijsvertering oplossing samengesteld uit Hanks ' evenwichtige zoutoplossing (Peeters) aangevuld met 0,5 mm ca^{2 +}/Mg^{2 +}, 0,5% trypsine en 50 µ g/ml DNase I, overnachting bij 4 °C.
2. Tumor cel isolatie en cultuur (dag 2)
   1. Na nachtelijke incubatie, plaats de verteerd weefsel voor 30 min in een incubator van 37 °C met zacht schudden.
   2. Vervang de spijsverterings oplossing bij centrifugeren (250 x g) met 3 mg/ml Collagenase type 1 opgelost in 5 mL medium 199 met Peeters en verder Incubeer gedurende 30 min bij 37 °c met zacht schudden.
   3. Blokkeer de enzymatische reactie door toevoeging van 10% warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum (FBS). Hersuspendeer de cellen zeer zorgvuldig met een 5 mL pipet om ervoor te zorgen dat de meeste van de cellen worden vrijgelaten uit het weefsel. Dan, filter de cel schorsing door middel van een 100 µm porie filter.
   4. Zaai de cellen in een kolf van 12,5 cm² en kweek ze bij 37 °c met humaan endothelial cellen serum-vrij medium (HESF), met 10% FBS en aangevuld met EFG (10 ng/ml), basis FGF (20 ng/ml), en 1% penicilline-streptomycine.
      Opmerking: Vervang met vers medium om de 2-3 dagen.

2. HA coating (dag 1)

1. Hersuspendeer hoog moleculair gewicht HA (1,5 kDa) in dubbel gedistilleerd water bij de concentratie van 1 mg/mL⁶.
2. Verdunde HA stockoplossing voor 50 µ g/mL in carbonaat/bicarbonaat buffer (0,1 M, pH 9,6) met zacht pipetten.
3. Bedek de 96-well plaat met 100 µ L van verdunde HA stockoplossing per nacht bij 4 °C.
   Nota: het hyaluronzuur was een vriendelijke gift van Professor Ivan Donati, afdeling van de wetenschappen van het leven, Universiteit van Triëst⁷.

3. C1q coating (dag 2)

1. Na nachtelijke incubatie, vacuüm aspireren de behandelde putten en was de 96-goed plaat met 100 µ L van Dulbecco PBS (dPBS) per put.
2. Laat C1q (25 µ g/mL of verschillende concentraties voor dosis Response experimenten) of BSA (als een negatieve controle) te binden aan plastic immobiled-HA door het incuberen van deze eiwitten bij een concentratie van 25 µ g/mL in 100 µ L van dPBS + 0,5% BSA en 0,7 mM CA^{2 +}/mg^{2 +} . Dan uitbroeden overnachting bij 4 °C.
3. Vacuüm aspireren de putten en was de 96-well plaat met 100 µ L/put van dPBS.

4. Cell labeling met snelle DiI

1. Hersuspendeer 1 x 10⁵ tumorcellen in 500 µ l van dPBS met 10 µ g/ml van de fluorescente kleurstof Fast DiI. Incubeer voor 15 min bij 37 °C in een incubator van 5% v/v CO₂ voor de etikettering, die manueel na 5 min. intervallen mengt.
   1. Voor het verwijderen van overtollige snelle DiI, voeg 10 mL dPBS, pipet voorzichtig omhoog en omlaag, en centrifugeer bij 250 x g voor 7 min. hersuspendeer de cel pellet in 1 ml van de menselijke endothelial serum vrije medium met 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA).

5. de adhesie van de cel op HA/C1q matrices (dag 1)

1. Vacuüm aspireren de putten bekleed met de verschillende matrices (putten werden bekleed in stap 3,2).
2. Distribueer 100 µ L van de gelabelde cel schorsing aan de gecoate putten en Incubeer de plaat voor 35 min bij 37 °C in 5% v/v CO₂ incubator.
3. Verwijder de niet-klevende cellen door opzuigen de bovendrijvende. Was een keer met dPBS bevattende 0,5% BSA, 0,7 mM CA^{2 +} en 0,7 mm mg^{2 +}_.
4. Lyse de aanhangende cellen door toevoeging van 200 µ L/put van 10 mM tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS en lees onmiddellijk de 96-goed plaat met een fluorescentie lezer (544 nm, emissie 590 nm) gebruikend een kaliberbepalingskromme die door de lysis van een stijgend aantal Geëtiketteerdt wordt geproduceerd Cellen.

Resultaten

HA is een negatief geladen High-Molecular-gewicht polysaccharide, die bestaat uit het herhalen van (β, 1-4)-D-glucuronzuur zuur-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glucosamine disacharide eenheden (Figuur 1b)⁷. Het voorkomen van de binding van HA op de 96-well plaat, alsmede de efficiëntie van de immobilisatie werden getest te profiteren van biotinylated HA (bio-HA). Verschillende concentraties van bio-HA, variërend van 10 µ g/mL tot 1 mg/mL, werden o...

Discussie

We beschrijven een eenvoudige methode om te onderzoeken hoe de aanvulling component C1q, interactie met hyaluronzuur, in staat is om het gedrag van de primaire cellen geïsoleerd van menselijke tumor weefsels moduleren. Zowel HA als C1q zijn overvloedig aanwezig in het weefsel micromilieu, zowel onder fysiologische en pathologische omstandigheden, die deelnemen aan verschillende cellen biologische processen. Bijvoorbeeld, C1q is aangetoond aanwezig te zijn in de microomgeving van de placenta waar het gunsten extravillous ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 µm pore filter	BD Falcon	352360
Amphotericin B solution (fungizone)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
basic FGF	Immunological Sciences	GRF-15595
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C-4901
Collagenase type I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
EGF	Immunological Sciences	GRF-10544
FAST DiI	Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Fetal bovine serum	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronectin	Roche	11051407001
Flask for cell culture	Corning	430639	Steriel, geventileerd
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	Aangevuld met EDTA, Glucose, penicilline-streptamicine, gentamicine en fungizone
High molecular weight hyaluronic acid	Vriendelijk cadeau van Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	Aangevuld met EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), en  1% penicilline-streptomycine (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride	Carlo Erba	13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt	Sigma-Aldrich	M7653
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Time-lapse microscopy	Nikon	Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4674