Methodenartikel

Eencellige RNA Sequencing van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen met behulp van handmatig sorteren en dubbele In Vitro transcriptie met Absolute aantallen Sequencing (DIVA-Seq)

DOI:

10.3791/58690

⸱

26 oktober 2018

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de procedure om te isoleren van één fluorescently geëtiketteerde neuronen gevolgd door in vitro transcriptie gebaseerde mRNA versterking voor hoge-diepte eencellige RNA sequencing sorteren handleiding.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eencellige RNA sequencing (RNA-seq) is nu een grote schaal uitgevoerde hulpmiddel voor het analyseren van genexpressie. Commercieel beschikbare eencellige RNA-sequencing platforms verwerken alle invoercellen lukraak. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) wordt soms stroomopwaarts gebruikt voor het isoleren van een specifiek gelabelde bevolking van belang. Een beperking van FACS is de noodzaak voor hoge aantallen invoercellen met aanzienlijk gelabelde breuken, onpraktisch voor het verzamelen en profilering van zeldzame of dunbevolkte gelabelde neuron populaties van de hersenen van de muis. Hier beschrijven we een methode voor het handmatig verzamelen van sparse fluorescently label één neuronen van vers losgekoppeld muis hersenweefsel. Dit proces zorgt voor het vastleggen van single-geëtiketteerden neuronen met hoge zuiverheid en verdere integratie met een in vitro transcriptie gebaseerde amplificatie protocol dat endogene transcript verhoudingen behouden. We beschrijven een dubbele lineaire versterking-methode die unieke molecuul-id's (UMIs) gebruikt voor het genereren van afzonderlijke mRNA graven. Twee rondes van versterking resulteert in een hoge mate van gene detectie per eencellige.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eencellige RNA sequencing (RNA-seq) heeft transcriptomic studies getransformeerd. Terwijl de grootschalige eencellige RNAseq kan worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid van technieken, zoals druppels1,2, microfluidics3, nanogrids4en5van het microwells, sorteren de meeste methoden gedefinieerd celtypes niet die genetisch gecodeerde fluorophores express. Isoleren van een select-celpopulatie, wordt fluorescentie-activated cell sorting (FACS) vaak gebruikt voor het sorteren van gelabelde cellen in de modus van een eencellige. Er zijn enkele beperkingen heeft echter FACS en vereist zorgvuldige monster verwerking stappen. Ten eerste, een groot aantal invoercellen zijn meestal nodig (vaak meerdere miljoen cellen per mL), met een belangrijke fractie (> 15-20%) met de gelabelde bevolking. Ten tweede, cel preparaten mogelijk meerdere rondes van dichtheid kleurovergang centrifugeren stappen voor het verwijderen van gliale breuk, puin en cel bosjes die anders de mondstuk of stroom cel verstoppen misschien. Ten derde, FACS werken meestal kleuring en destaining stappen voor live/dead kleuring (bijvoorbeeld 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) propidium jodide (PI) en Cytotracker kleurstoffen), die extra tijd in beslag nemen. Ten vierde, als een vuistregel voor twee kleuren sorteren (zoals DAPI en groen/rood fluorescente proteïne (GFP/RFP)), meestal twee monsters en één besturingselement nodig zijn, vereisen een labelloze monster naast de gewenste muis stam worden verwerkt. Ten vijfde: filteren wordt vaak uitgevoerd meerdere malen vóór en tijdens het monster sorteren om proactief te voorkomen dat verstopte monster lijnen in een FACS machine. Ten zesde moet tijd worden toegewezen in de meest gebruikte FACS opstellingen te initialiseren en te stabiliseren van de vloeistof stroom druppel kalibratie uit te voeren. Zevende, controle monsters worden meestal uitgevoerd in volgorde vóór het verzamelen van feitelijke monster om compensatie matrices, doublet afwijzing instellen, instellen van poorten, etc. gebruikers ofwel stappen zes en zeven zich tevoren of vereisen de hulp van een technicus in parallel. Ten slotte, post-FACS, er zijn vaak stappen om ervoor te zorgen dat alleen het label enkele cellen aanwezig in elk putje; bijvoorbeeld door het controleren van monsters bij een instelling met hoog-content screening zoals een snelle plaat imager.

Omzeilen van de bovenstaande stappen te vergemakkelijken een relatief snelle, gerichte sequencing van een kleine populatie van één fluorescently geëtiketteerde neuronen, beschrijven we een handleiding sorteren procedure gevolgd door twee rondes van een hooggevoelige in vitro versterking protocol, dubbele in-vitro transcriptie met absolute aantallen sequencing (DIVA-Seq) genoemd. De RNA-versterking en cDNA Bibliotheek generatie zijn aangepast van Eberwine et al. 6 en Hashimshony et al. 7, met enkele wijzigingen aan de muis interneuronen hebben kleinere cellulaire volumes; Bovendien, we hebben ook geconstateerd dat er even nuttig voor excitatory piramidale neuronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de IACUC op de Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. hand sorteren van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen

  1. Trek glas microcapillaries (Zie Tabel van materialen) met 10 – 15 µm afrit diameter een capillaire trekker met de volgende instellingen opgegeven: warmte: 508, pull: leeg, vel: leeg, tijd: leeg.
  2. 120-150 cm flexibele silicone slangen (~0.8 mm binnendiameter) aan een 0,2 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride spuit membraanfilter en een tweerichtings buis ventiel met behulp van geschikte buis connectoren koppelen.
  3. Bereiden van 500 mL koud (4 ° C) kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF, tabel 1) en zuurstof door borrelende 5% koolstofdioxide evenwichtig zuurstof via een Bruissteen gedurende 15 minuten of totdat de oplossing volledig wordt gewist.
  4. Bereiden van 100 mL ACSF met een cocktail van activiteit blokkers in een bekerglas van 150 mL (tabel 1).
  5. Bereiden van 100 mL ACSF met 1 mg/mL Streptococcus breuk IV protease in een bekerglas van 150 mL (tabel 1).
  6. Bereiden van 100 mL ACSF met 1%-oplossing van de foetale runderserum (FBS) in een bekerglas van 150 mL en zuurstof met 5% koolstofdioxide evenwichtig zuurstof via een Bruissteen.
  7. De hersenen van een euthanized muis ontleden door opening van de schedel met een kleine schaar en het halen van de verse hersenen met behulp van fijne pincet zonder beschadiging van de cortex.
    Opmerking: Muizen van elke stam, leeftijd en geslacht kunnen worden gebruikt als gewenste. Bevriezen van de hersenen niet of handmatig sorteren op muizen ingespoten met virussen of andere gevaarlijke of infectieuze agentia uit te voeren.
  8. Houd de hersenen in gekoeld en zuurstofrijk ACSF, waardoor een Bruissteen gekoppeld aan 5% kooldioxide-evenwicht zuurstof tijdens de gehele duur van het segmenteren.
  9. Positie van de hersenen op de vibratome-chuck en snijd coronale of Sagittaal secties bij 300 µm dikte. Verzamelen van zoveel secties zoals die nodig zijn voor het verkrijgen van een minimum van ~ 10 – 50 label cellen tot verschillende honderd cellen. Segmenten op een katoenen ingeschakelde segment houder, in een bekerglas geplaatst, zodat ze zijn badend in zuurstofrijk ACSF gezet.
  10. Verplaatsen van verse plakjes in een bekerglas van ACSF met activiteit blokkers en blok gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur. Houd bruisend zuurstof met Bruissteen.
  11. Verplaatsen van de segmenten aan een bekerglas ACSF met de protease-oplossing voor het uitvoeren van milde spijsvertering bij kamertemperatuur: 20 – 30 min voor P4-14 dieren of tot 45 – 60 min voor P28-56 dieren. Bruisend zuurstof houden.
  12. Wassen ACSF met protease door het bewegen van de segmenten terug naar de ACSF te bekerglas met activiteit blokkers oplossing gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Bruisend zuurstof houden.
  13. Afzonderlijke secties verplaatsen naar een 100 mm petrischaal met ACSF met 1% FBS bij kamertemperatuur. Hebben een minimum van 10 – 50 cellen (maximaal een paar honderd) onder een fluorescente dissectie scope, microdissect gebieden en lagen van belang. Het uitvoeren van de microdissection met een paar fijne pincet of door het aanbrengen van 22 – 28 G injectie naalden op houten houders (spiesen).
  14. De microdissected stukken met behulp van een pipet van Pasteur, verplaatsen naar een 2 mL microfuge buis met ~0.8 mL 1% FBS in ACSF oplossing.
  15. Triturate de ontleed weefsel in de microfuge buis bij kamertemperatuur. Drie lange om eventueel wegspatten Pasteur pipetten met afnemende afrit diameters door te rollen ze boven een open vuur te maken. Uitvoeren van ~ 10 lijnen met elke Pipet, beginnen met de grootste en eindigend met de kleinste.
  16. Afzien van de gedissocieerde cellen in een 100 mm petrischaal met zuurstofrijk ACSF (petrischaal dun kan worden bekleed met 5 mm 1% agar of duidelijk siliconen samengestelde op 1:10 verhouding, indien gewenst). Bewaren bij kamertemperatuur.
  17. Wacht ~ 5-7 min voor de cellen geleidelijk regelen en vervolgens waarnemen van het GFP/RFP signaal onder een Microscoop dissectie.
    Opmerking: Afzonderlijke cellen, puin, en kleine bosjes zichtbaar zullen zijn in fel-veld (BF).
  18. 10 – 15 GFP/RFP cellen kiezen op een moment met behulp van een capillaire Pipet (uit stap 1.1) gehecht aan flexibele silicone slangen (0,4-0,8 mm binnendiameter) en afzien van de cellen in een 100 mm petrischaal met vers zuurstofrijk ACSF.
  19. Door het blokkeren van het einde van de klep van de buis met de tong, plaatst u het capillair dicht bij de cel van belang. Cellen met behulp van capillaire actie op het verlichten van het blok te vangen, en snel weer blokkeren om te voorkomen dat overtollige vocht uit het invoeren van de pipet. Afzien van de cellen op een 100 mm petrischaal met vers zuurstofrijk ACSF door zachtjes blazen, met inachtneming van de capillaire tip onder fluorescentie optica van de dissectie-Microscoop. Doel voor het verzamelen van ~ 100 – 150 cellen totale.
  20. Herhaal stap 1.19 of twee keer meer (afhankelijk van puin) en overdracht een totaal van ~ 50-75 cellen naar een nieuwe 100 mm petrischaal, ervoor te zorgen dat verontreinigingen zoals puin minimaal in de heldere-veld differentiële interferentie contrast (DIC) optica zijn.
  21. Tot slot met een verse microcapillary Pipetteer telkens, kies een eencellige in niet meer dan 0,5 µL volume en verdrijven het in een enkele 0,2 mL microfuge buis (of een strip van acht 0,2 mL microfuge buizen) met 1 µL van monster collectie buffer met inleidingen N10B1-N10B96 (tabel 2). Breken de pipet tip in de microfuge buis om ervoor te zorgen dat de cel in de collectie buffer blijft. Gooi de pipetten.
  22. Blokkeer de cellen door buizen op droog ijs te zetten en op te slaan op de lange termijn in een vriezer-80 ° C totdat ze klaar om te worden verwerkt voor RNA versterking.

2. eerste ronde RNA-amplificatie

Opmerking: De volgende procedure is voor één strip van acht 0,2 mL microfuge buizen. De schaal van de reacties zo nodig.

  1. Synthetiseren van het eerste deel van cDNA (eerste ronde).
    1. Heat strips uit stap 1.22 op 70 ˚C gedurende 5 minuten, gevolgd door 4 ˚C gedurende 5 minuten; Herhaal dit twee keer.
    2. Monteren op ijs reverse-transcriptase (RT) master mix/eerste-onderdeel synthese master mix met behulp van de volgende ingrediënten (Zie Tabel van materialen): 10 x eerste-onderdeel buffer (2 µL), dNTP mix (4 µL), RNase remmer (1 µL) en enzym (1 µL).
    3. Kort centrifugeren de strip op een tafelblad centrifuge voor het verzamelen van alles aan de onderkant. Houd op ijs.
    4. Voeg 1 µL van RT master mix/eerste-onderdeel synthese master mix de bovenstaande buizen (total volume van 1 µL van monster buffer uit cel collectie + 1 µL van RT = 2 µL/buis). Meng goed door pipetteren. Kort draaien om te verzamelen van de gehele inhoud aan de onderkant en houd het op ijs.
    5. Incubeer de bovenstaande buis/s bij 42 ° C gedurende 2 uur in een lucht oven. Zet de buizen op ijs onmiddellijk te beëindigen van de reactie en ga naar tweede-onderdeel synthese stap.
  2. Het tweede onderdeel van cDNA synthetiseren (eerste ronde).
    1. Tweede onderdeel master mix (80 µL) maken op ijs in de volgende volgorde in een tube van 1,5 mL: nuclease-gratis water (63 µL), 10 x tweede onderdeel buffer (10 µL), dNTP mix (4 µL), de polymerase van DNA (2 µL) en RNaseH (1 µL). Meng de ingrediënten goed door vortexing, dan draaien om te verzamelen aan de onderkant en houd op ijs.
    2. Looppas van het begin van de thermische cycler, het volgende programma vooraf cool de eenheid, klaar om te beginnen met stap 2.2.3 (deksel warmte = uit; 16 ° C gedurende 2 uur, 4 ° C houden), en pauzeren bij 16 ° C.
    3. Een 80 µL/strip (of 10 µL/buis) van tweede onderdeel master mix aan elke buis van de strip en houd op ijs toevoegen. De strip overbrengen in de thermische cycler en hervatten van de 16 ° C-stap hierboven gestart. Incubeer de strip voor 2 h bij 16 ° C.
    4. Na de tweede-onderdeel synthese stap, plaats u de buizen op ijs over te gaan tot de volgende cDNA zuivering stap.
  3. Zuiveren van dubbele gestrande cDNA (eerste ronde).
    Opmerking: Alle centrifugations zijn uitgevoerd bij ~ 8000 x g bij kamertemperatuur. Nooit meer bedragen dan 16.000 x g om te voorkomen dat schade aan het filterelement.
    1. Start 100 µL van nuclease-gratis water tot 50-55 ° C voor later gebruik in een droog verwarming blok Verwarming. Nooit hoger zijn dan de 58 ° C om te voorkomen dat gedeeltelijke denaturatie van cDNA.
    2. Voeg 250 µL van cDNA bindende buffer tot een 1,5 mL koker. Controleren op precipitaten in de buffer, dan warm bufferoplossing tot 37 ° C gedurende 10 minuten te ontbinden opnieuw precipitaten.
    3. CDNAs van een enkel 8-buis strip overbrengen aan de cDNA bindende buffer. De cellen in deze stap voor verder stroomafwaarts processen (8 cellen in 1 buis) combineren. Meng grondig door pipetteren 2 - 3 keer en flicking 3 - 4 keer. Spin te verzamelen van de inhoud aan de onderkant.
    4. Zet de cDNA filter cartridge stevig in wassen buizen (van een in vitro transcriptie (IVT) kit). De bovenstaande mix toevoegen naar het midden van het filter. Centrifugeer bij 8.000 x g voor ~ 1 min of totdat het door het filter. Negeren de doorstroming en vervangen van de buis wassen.
    5. 500 µL van was buffer uit de IVT kit toevoegen aan de kolom.
      Opmerking: Zorg ervoor dat ethanol is toegevoegd aan het wassen buffer eerder.
    6. Centrifugeer bij 8.000 x g voor ~ 1 min of totdat het door het filter. De doorstroming en centrifuge weer bij 8.000 x g gedurende ~ 1 min de cartridge leeg te negeren.
    7. Het filter cDNA overbrengen in een cDNA elutie buis (1,5 mL nuclease-gratis buis). Toepassing 8,5 µL voorverwarmde nuclease-gratis water naar het midden van het filter. 2 min wachten samen en centrifugeer bij 8.000 x g voor ~1.5 min.
    8. Elueer opnieuw met 8,5 µL voorverwarmde nuclease-gratis water en onmiddellijk overgaan tot de eerste ronde IVT.
      Opmerking: Double-stranded cDNA herstel volume worden ~ 16 µL.
  4. Voer een reactie in vitro transcriptie (IVT) voor versterkte RNA (aRNA) productie van cDNA (eerste ronde).
    1. De kruising lucht oven ingesteld op 37 ° C.
    2. De master mix voorbereiden IVT op ijs in de volgende volgorde: tot 16 µL van de eluted double-stranded cDNA uit stap 2.3.8, Voeg 4 µL van T7 ATP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 CTP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 GTP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 UTP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 10 x reactie buffer; en 4 µL van T7 enzym mix. Meng goed, spin, en houd op ijs.
    3. Voeg 24 µL van de master mix van IVT aan elke buis met 16 µL van cDNA. Meng de inhoud door pipetteren voorzichtig en grondig. Incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 14 h.
      Opmerking: Incubatie gedurende < 12u ernstig beïnvloedt opbrengst.
    4. Voeg 60 µL van niet-diethyl-pyrocarbonate (niet-DEPC) behandeld RNase-gratis water ter vergroting van het volume aan 100 µL en stop de reactie van IVT.
  5. De aRNA zuiveren.
    Opmerking: Alle centrifugations zijn uitgevoerd bij ~ 8000 x g bij kamertemperatuur. Nooit meer bedragen dan 16.000 x g om te voorkomen dat schade aan het filterelement.
    1. Verwarming ~ 200 µL nuclease-gratis water tot 50-55 ° C voor later gebruik in een droog verwarming blok of PCR machine starten Nooit hoger zijn dan de 58 ° C om te voorkomen dat gedeeltelijke denaturatie van aRNA.
    2. ARNA overbrengen in een tube 1,5 mL nuclease-vrij. 350 µL van aRNA bindende buffer aan elk monster aRNA toevoegen. Voeg 250 µL van 100% ethanol aan elke buis en meng door 3 keer door pipetting (do niet vortex te mengen en spin).
    3. Overbrengen in de mix onmiddellijk de RNA zuivering kolom door toe te voegen zachtjes naar het midden van het filterelement. Centrifugeer bij 8.000 x g ~ 1 min of totdat de mix heeft doorgegeven volledig door het filter. Negeren de doorstroming en hergebruiken van de afvalinzameling buis
      Opmerking: RNA zal starten neerslaan op de toevoeging van ethanol.
    4. 650 µL van was buffer aan elke cartridge filter toevoegen. Centrifugeer gedurende ~ 1 min op 8.000 x g of totdat de hele buffer is verstreken. Negeren de doorstroming en de spin van de filters voor een extra ~ 1 min om sporen van de buffer wassen te verwijderen.
    5. Het filter overbrengen in een verse aRNA collectie buis. Voeg 100 µL voorverwarmde (50-55 ° C) van de nuclease-vrij van het water naar het midden van het filter. 2 min wachten en Centrifugeer gedurende ~1.5 min op 8.000 x g of totdat het voorbij in de buis van de collectie.

3. tweede ronde versterking

  1. Het eerste onderdeel cDNA synthetiseren (tweede ronde).
    1. Overdracht aRNA uit stap 2.5.5 naar een 200 µL microfuge buis en vacuüm concentreren de 100 µL elutant 10 µL. gebruik geen warmte, het uitvoeren van de vacuüm concentrator voor 65 min. vergelijken met 10 µL van het water in een buis van 200 µL te schatten van het verminderde volume.
    2. Verwarm de kruising lucht oven tot 42 ° C.
    3. 2 µL van willekeurige hexamer primers uit de IVT kit toevoegen aan aRNA, vortex kort, en spin om te verzamelen van de inhoud.
    4. Incubeer de microfuge buis bij 70 ° C gedurende 10 minuten in een thermische cycler, dan plaatst het op het ijs.
    5. Voorbereiding van de volgende RT master mix: 2 µL van 10 x eerste onderdeel synthese buffer, 4 µL van dNTP mix, 1 µL van RNase remmer en 1 µL van ArrayScript enzym. Mix goed in een 200 µL microfuge buis door zachtjes vortexing, draai vervolgens verzamelen de inhoud te plaatsen op het ijs.
    6. Toevoegen van 8 µL van de RT-meester mix (eerste deel) aan elke microfuge buis. Plaats de buizen in een incubator lucht 42 ° C gedurende 2 uur.
    7. Voeg 1 µL van RNaseH naar de bovenstaande reactie. Meng goed door pipetteren 2 - 3 keer en flicking 3 - 4 keer, en draaien om te verzamelen van de inhoud. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten op een PCR-machine. Na incubatie, overgaan tot tweede-onderdeel synthese stap onmiddellijk.
  2. Het tweede onderdeel van cDNA synthetiseren (tweede ronde).
    1. Voeg 3 µL van T7-RA5 primer (op 25 ng/µL werkverdunning, tabel 2) en 2 µL van RNase-vrij water aan elk monster cDNA. Meng goed, en spin om te verzamelen van de inhoud.
    2. Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten in een thermische cycler. Plaats de reactie op het ijs.
    3. Voorbereiden van de RT-master mix (tweede deel) op ijs: 58 µL van nuclease-gratis water, 10 µL van 10 x tweede onderdeel buffer, 4 µL van dNTP mix en 2 µL van polymerase van DNA. Meng goed door vortexing en spin te verzamelen van de inhoud. Houd op ijs.
    4. 74 µL van de bovenstaande mix aan elke buis uit stap 3.2.2 toevoegen. Meng goed door 2 tot 3 keer pipetteren en flicking 3 - 4 keer, draai vervolgens aan voor het verzamelen van de inhoud. Houd op ijs en houden.
    5. Cool vooraf de thermische cycler tot 16 ° C door het uitschakelen van de hitte van de deksel. Plaatsen van de buizen in de thermische cycler voor 2 h bij 16 ° C.
    6. Na de tweede-onderdeel synthese stap, plaats de buizen op ijs te gaan met de cDNA zuivering stap, of bevriezen bij-20 ° C.
      Opmerking: cDNA zuivering wordt aangeraden vóór het invriezen.
  3. CDNA zuivering uitvoeren (tweede ronde).
    Opmerking: Alle centrifugations zijn uitgevoerd bij ~ 8000 x g bij kamertemperatuur. Nooit meer bedragen dan 16.000 x g om te voorkomen dat schade aan het filterelement.
    1. Begin verwarmen van water nuclease-gratis tot 50-55 ° C voor later gebruik in een droog verwarming blok. Nooit hoger zijn dan de 58 ° C om te voorkomen dat gedeeltelijke denaturatie van cDNA.
    2. CDNA overbrengen in een tube 1,5 mL nuclease-vrij. Voeg 250 µL van cDNA bindende buffer toe aan elke buis. Controleer precipitaten in de buffer en warm de bufferoplossing tot 37 ° C gedurende 10 minuten te opnieuw te ontbinden. Meng grondig door 2 tot 3 keer pipetteren en flicking 3 - 4 keer. Spin te verzamelen van de inhoud.
    3. Stevig plaatsen de cDNA filter cartridge in de wash-buizen De bovenstaande mix toevoegen naar het midden van het filter. Centrifugeer bij 8.000 x g voor ~ 1 min of totdat het door het filter. Negeren de doorstroming en vervangen van de buis wassen.
    4. Voeg 500 µL van was buffer. Zorg ervoor dat ethanol is toegevoegd aan het wassen buffer eerder. Centrifugeer bij 8.000 x g voor ~ 1 min of totdat het door het filter.
    5. Gooi de doorstroming en Centrifugeer nogmaals bij 8.000 x g gedurende ~ 1 min om de cartridge leeg. Het filter cDNA overbrengen in een cDNA elutie buis.
    6. Toepassing 8,5 µL voorverwarmde nuclease-gratis water naar het midden van het filter. 2 min wachten samen en centrifugeer bij 8.000 x-g voor ~1.5 min. Elute weer met extra 8,5 µL voorverwarmde nuclease-gratis water.
      Opmerking: Double-stranded cDNA herstel volume worden ~ 16 µL.
    7. Ga onmiddellijk naar tweede ronde IVT of bevriezen cDNA bij-20 ° C's nachts.
  4. Het uitvoeren van een tweede ronde van de aRNA productie met IVT.
    1. Hybridisatie lucht oven ingesteld op 37 ° C (36 ° C setpoint).
    2. De master mix voorbereiden IVT op ijs in de volgende volgorde: tot 16 µL van de eluted double-stranded cDNA uit stap 3.3.7, Voeg 4 µL van T7 ATP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 CTP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 GTP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 UTP oplossing (75 mM); 4 µL van T7 10 x reactie buffer; en 4 µL van T7 enzym mix. Meng goed, spin kort voor het verzamelen van de inhoud, en houd op ijs.
    3. Voeg 24 µL van de master mix van IVT aan elke buis met 16 µL van cDNA. Meng de inhoud door pipetteren voorzichtig en grondig. Incubeer bij 37 ° C gedurende 14 h buis.
      Opmerking: Incubatie gedurende 12 h < ernstig is van invloed op opbrengst.
    4. Voeg 60 µL van niet-DEPC behandeld RNase-gratis water ter vergroting van het volume aan 100 µL en stop de reactie van IVT.
  5. ARNA zuivering uitvoeren (tweede ronde).
    Opmerking: Alle centrifugations zijn uitgevoerd bij ~ 8000 x g bij kamertemperatuur. Nooit meer bedragen dan 16.000 x g om te voorkomen dat schade aan het filterelement.
    1. Verwarming ~ 200 µL nuclease-gratis water tot 50-55 ° C voor later gebruik in een droog verwarming blok of PCR machine starten Nooit hoger zijn dan de 58 ° C om te voorkomen dat gedeeltelijke denaturatie van de aRNA.
    2. De aRNA overbrengen in een tube 1,5 mL nuclease-vrij. 350 µL van aRNA bindende buffer aan elk monster aRNA toevoegen. Voeg 250 µL van ACS grade 100% ethanol aan elke buis en meng 3 keer door pipetting (do niet vortex te mengen en spin).
      Opmerking: RNA zal starten neerslaan op de toevoeging van ethanol.
    3. Overbrengen in de mix onmiddellijk de RNA zuivering kolom door toe te voegen zachtjes naar het midden van het filterelement. Centrifugeer bij 8.000 x g ~ 1 min of totdat de mix heeft doorgegeven volledig door het filter. Negeren de doorstroming en hergebruiken van de afvalinzameling buis.
    4. 650 µL van was buffer aan elke cartridge filter toevoegen. Centrifugeer gedurende ~ 1 min op 8.000 x g of totdat de hele buffer is verstreken. Negeren de doorstroming en de spin van de filters voor een extra ~ 1 min om sporen van de buffer wassen te verwijderen.
    5. De filters overbrengen in een verse aRNA collectie buis. Voeg 100 µL voorverwarmde nuclease-gratis water naar het midden van het filter. 2 min wachten en Centrifugeer gedurende ~1.5 min op 8.000 x g of totdat het voorbij.
    6. Aliquot 2 µL in een buis voor de spectrofotometer (bij 260 nm golflengte) en bioanalyzer verspreid analyses om te controleren op aRNA opbrengst en kwaliteit.
      Opmerking: Concentratie moet ten minste 5 ng/µL; anders, het verwerpen van het monster. Het monster kan worden opgeslagen voor ~ 1 jaar bij-80 ° C. Vermijd bevriezen-ontdooien van de monsters.
    7. Controleer de monsters met behulp van een bioanalyzer om te visualiseren goede verspreiding van aRNA producten volgens de fabrikant protocol (Figuur 2).

4. versterkte RNA fragmentatie en opruimen

  1. Meng op ijs (totale volume 40 µL, combineer 2 buizen van aRNA niet-overlappende monster streepjescodes) de volgende: 36 µL van aRNA (200 ng totaal) en 4 µL van RNA fragmentatie buffer. Incubeer het mengsel bij 94 ° C gedurende 90 s.
  2. Onmiddellijk bewegen het mengsel ijs en voeg 4 µL van RNA fragmentatie stop buffer. Stel het volume aan 100 µL door 56 µL van nuclease-gratis water toe te voegen.
  3. Toevoegen van 350 µL van RLT buffer van de RNA-zuivering kit (Zie Tabel van materialen) en meng goed door pipetteren. Voeg 250 µL van EtOH, meng goed door pipetteren en overbrengen van het monster naar de RNA zuivering spin kolom. Spin voor 15 s bij 8.000 x g.
  4. Overdracht van de kolom naar de nieuwe collectie buis en voeg 500 µL van RPE buffer. Spin voor 15 s bij 8.000 x g. negeren de doorstroming. Voeg 500 µL van 80% EtOH en spin voor 2 min op 8.000 x g.
  5. De kolom naar een nieuwe collectie buis, open deksel van kolom, en spin voor 5 min op volle snelheid overbrengen.
  6. Overbrengen van de kolom naar een nieuwe collectie buis, en elueer met 16 µL van nuclease-gratis water, spinnen bij volledige snelheid voor 1 min.

5. bibliotheek voorbereiding

Opmerking: IVTs kunnen worden samengevoegd op dit punt, als er geen overlapping in barcodes gebruikt. De behandeltijd fosfatase is 40 min. Poly-nucleotide kinase behandeltijd 1 h.

  1. Tot 16 µL van gefragmenteerde aRNA in een tube van de PCR 0,7 mL, Voeg 4 µL van de volgende mix: 2 µL van 10 x fosfatase buffer, 1 µL van Antarctische fosfatase en 1 µL van recombinante ribonuclease remmer (bijvoorbeeldRNaseOUT). Incubeer in een thermische cycler met het volgende protocol: 37 ° C gedurende 30 minuten, 65 ° C gedurende 5 minuten, en houd bij 4 ° C.
  2. Voeg aan de buis van de PCR 0,7 mL vanaf stap 5.1, 30 µL van de volgende mix: 17 µL van nuclease-gratis water, 5 µL van 10 x fosfatase buffer, 5 µL van ATP (10 mM), 1 µL van recombinante ribonuclease remmer en 2 µL van PNK. Incubeer in de thermische cycler bij 37 ° C gedurende 60 minuten, dan houd bij 4 ° C.
  3. Voer een kolom opruimen van fosfatase en aRNA PNK behandeld.
    1. Draai volume om 100 µL door 50 µL nuclease-gratis water toe te voegen. Voeg 350 µL van RLT buffer en meng goed. Voeg 250 µL van EtOH, meng goed door pipetteren en overbrengen van het monster naar de RNA zuivering spin kolom.
    2. Spin voor 15 s op 8.000 x g. overdracht van de kolom naar een nieuwe collectie buis en voeg 500 µL van RPE buffer.
    3. Spin voor 15 s bij 8.000 x g. negeren de doorstroming en voeg 500 µL van 80% EtOH.
    4. Spin voor 2 min op 8.000 x g. overdracht de kolom naar een nieuwe collectie buis, open het deksel van de kolom, en spin voor 5 min op volle snelheid.
    5. Overdracht van de kolom naar een nieuwe collectie buis en elueer met 14 µL van nuclease-gratis water, spinnen bij volledige snelheid voor 1 min om te herstellen van een ~ 10 µL volume van het materiaal. Gooi de kolom. Het volume te verlagen tot 5 µL met behulp van een vacuüm concentrator voor ~ 10 min.
  4. Afbinden een 3' adapter met behulp van een commerciële kit (Zie Tabel van materialen).
    1. Verdun de 3'-adapter (RA3) van TrueSeq kit 3 plooien met nuclease-gratis water en slaan de aliquots bij-20 ° C.
    2. Voeg 1 µL van verdunde 3' adapter aan 5 µL van fosfatase en RNA PNK-behandeld. Incubeer bij 70 ° C gedurende 2 minuten, en plaats dan onmiddellijk de buis op ijs ter voorkoming van secundaire structuur ontstaan.
    3. Voeg 4 µL van de volgende mix: 2 µL van 5 x HM afbinding buffer (HML), 1 µL van RNase remmer en 1 µL van T4 RNA ligase 2 (afgekapt). Incubeer de buis op de voorverwarmde thermische cycler bij 28 ° C gedurende 1 h (onverwarmde of met het deksel open).
    4. Met de reactiebuis nog op de thermische cycler, voeg 1 µL van eindeoplossing (STP) en zachtjes Pipetteer het gehele volume omhoog en omlaag 6 – 8 keer naar meng. Incubeer de reactiebuis op de thermische cycler bij 28 ° C gedurende 15 minuten, dan plaatst u de buis op ijs blijven.
    5. Voeg 3 µL nuclease-gratis water te verkrijgen van een totaal volume van 12 µL. gebruik 6 µL en het opslaan van de resterende 6 µL bij-80 ° C.
  5. Het uitvoeren van een omgekeerde transcriptie reactie.
    1. Combineren van de volgende handelingen uit in een PCR-buis: 6 µL van RNA adapter-afgebonden en 1 µL van RNA RT primer (RTP). Incubeer de buis bij 70 ° C gedurende 2 minuten, dan plaatst u onmiddellijk de buis op ijs.
    2. Voeg 5.5 µL van de volgende mix: 2 µL van 5 x eerste onderdeel buffer, 0,5 µL van 12.5 mM dNTP mix, 1 µL van 100 mM DTT, 1 µL van RNase remmer en 1 µL van reverse-transcriptase. Incubeer de buis in de voorverwarmde thermische cycler bij 50 ° C gedurende 1 uur, dan plaatst u de buis op ijs (monsters kunnen worden bewaard bij-20 ° C).
  6. PCR versterking met 11-15 cycli te verrijken 5', 3'-primer ligaturen product uitvoeren.
    1. Voeg aan elke reactie van omgekeerde transcriptie, 35.5 µL van de volgende mix: 8,5 µL van ultra pure water, 25 µL van het PCR-mix (PML) en 2 µL van RNA PCR Inleiding (RP1). Aan elke reactie, voeg 2 µL van een uniek geïndexeerde RNA PCR primer (RPIX, X = 1 t/m 24).
    2. Versterken van de buis in de thermische cycler met behulp van PCR fietsen oorzaken: 98 ° C gedurende 30 s; 12-15 cycli van 98 ° C voor 10 s; 60 ° C bij 30 s; 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 10 minuten; Houd vervolgens bij 4 ° C.

6. PCR Product schoonmaakbeurt en maat keuze

  1. Prewarm AmpureXP magnetische kralen bij kamertemperatuur. Vortex 50 µL de kralen totdat ze goed verspreide, vervolgens toevoegen aan de 50 µL PCR reactie (1:1 PCR product: kralen). Meng de inhoud omhoog tot tien keer naar meng.
  2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten plaats op een magnetische staan voor ten minste 5 minuten, totdat de vloeistof wordt duidelijk weergegeven. Verwijder en 95 µL van het supernatans dat negeren.
  3. Voeg 200 µL van vers bereide 80% EtOH. Incubeer gedurende ten minste 30 s, dan verwijderen en negeren de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de kralen. Herhaal dit nogmaals.
  4. Luchtdroog de kralen gedurende 15 minuten of totdat volledig droog. Resuspendeer met 32.5 µL van resuspensie buffer. Pipetteer het gehele volume op en neer tien keer naar meng.
  5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten plaats op een magnetische stand gedurende 5 minuten, totdat de vloeistof wordt duidelijk weergegeven. 30 µL van het supernatans overbrengen in een nieuwe buis. Voeg 20 µL nuclease-gratis te verkrijgen van een 50 µL totaal volume water.
  6. Uitvoeren van grootte selectie van PCR producten met vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) magnetische kralen.
    1. 0.7 x-volume (35 µL) van SPRI parels aan de buis in stap 6.5 en meng grondig voorbereid door pipetteren toevoegen. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Plaats de buis op een magnetische voet en wacht gedurende 5 minuten of totdat de afzonderlijke kralen. Verwijder het supernatant zorgvuldig zonder verstoring van de kralen.
    3. Voeg 200 µL van vers bereide 85% EtOH. Wacht 30 s, dan verwijderen de EtOH. De kralen voor 10 min. drogen.
  7. Voeg 20 µL nuclease-gratis water. Plaats de buis terug op de magneet, wacht 5 minuten, en Pipetteer af het vloeibare gedeelte zonder verstoord of aanraken van de kralen. Opslaan van het DNA bij-20 ° C.

7. bepaling van de hoeveelheid van de bibliotheek en de kwaliteit

  1. Controleer de concentratie van DNA met een spectrofotometer bij 260 nm golflengte (verwachte concentratie ten minste ~ 5 – 10 ng/µL).
  2. 1 µL van elk monster worden uitgevoerd op een bioanalyzer met behulp van een hoog-gevoeligheids DNA-chip te onderzoeken grootteverdeling (verwachte piek op 300-400 bp (Zie Figuur 3)).

8. de monster indiening

  1. Combineren van niet-overlappende sequencing PCR barcodes (1:1 verhouding). Bijvoorbeeld, combineren PCR producten van monsters met RPI-1 en de RPI-2, de RPI-3 en de RPI-4 in gelijke nanogramgebied bedragen, volgens het RNA sequencing core's totale invoer monster bedrag eis aanbevelingen.
  2. Pas na combineren, de totale concentratie aan 5 ng/µL en ten minste een 10 µL volume of zoals aanbevolen door de kern van de faciliteit sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, GABAergic neuronen handmatig werden gesorteerd op (Figuur 1) en RNA versterkt, vervolgens werd verfilmd een cDNA Bibliotheek (Figuur 2) en sequenced op hoge diepte8. De versterkte RNA (aRNA) producten varieerde van 200-4000 bp in grootte, met een verdeling van de piek iets boven 500 bp (figuur 3A). De kraal-gezuiverd cDNA...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De handleiding sorteren protocol is geschikt voor een gecontroleerde RNA sequencing van neuron populaties die dun met de label in de hersenen van muizen of vertegenwoordigen een zeldzame celpopulatie die anders niet haalbaar is om te studeren met behulp van de huidige high-throughput cel Sorteer- en versterking methoden. Cellen die zijn onderworpen aan FACS meestal ondergaan schede en monster lijn druk in het bereik van ~ 9-14 psi, afhankelijk van de grootte van het mondstuk en gewenste gebeurtenis tarieven. Daarnaast op...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH (5R01MH094705-04 en R01MH109665-01 tot en met Z.J.H.), door het CSHL Robertson Neuroscience Fonds (Z.J.H.) en door een NARSAD Post-Doctoral Fellowship (naar A.P.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ERCC RNA Spike-In Control MixesThermo FisherCat# 4456740
SuperScript IIIThermo FisherCat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo FisherCat# 10777019
RNA fragmentation bufferNew England BiolabsCat# E6105S
RNA MinElute kitQiagenCat# 74204
Antarctic phosphataseNew England BiolabsCat# M0289
Poly nucleotide kinaseNew England BiolabsCat# M0201
T4 RNA ligase2, truncatedNew England BiolabsCat# M0242
Ampure Xp magnetic  beadsBeckman CoulterCat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beadsThermo FisherCat# B23317
DL-AP5TocrisCat# 0105
CNQXTocrisCat# 1045
TTXTocrisCat# 1078
Protease from Streptomyces griseusSigma-AldrichCat# P5147
Message Amp II kitThermo FisherCat# AM1751
CarbogenAirgasCat# UN3156
Sylgard 184Sigma-AldrichCat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kitIlluminaCat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chipAgilentCat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chipAgilentCat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).LeicaModel MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.Warner instrumentsModel GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette pullerSutter Instruments CoP-97
VibratomeThermo MicromHM 650V
Vibratome tissue cooling unitThermo MicromCU 65

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228(2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883(2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101(2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentielabeling van neuronenhandmatige cel sorteringDIVA Seq methodemuizenbreinweefselcapillaire microdissectieUMI gebaseerde amplificatiegen detectie per cel

Gerelateerde artikelen