Methodenartikel

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58691

⸱

18 januari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, 2National Emerging Infectious Diseases Laborator, Boston University School of Medicine, 3Department of Entomology, Kansas State University

In dit artikel

Samenvatting

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Samenvatting

De recente opkomst van de flavivirus Zika en neurologische complicaties, zoals Guillain-Barré syndroom en microcefalie bij zuigelingen, heeft geleid tot bezorgdheid over de ernstige openbare veiligheid. Onder de risicofactoren vormt antilichaam-afhankelijke versterking (ADE) de belangrijkste bedreiging, zoals de recente re-opkomst van de Zika-virus (ZIKV) is vooral in gebieden waar de bevolking is blootgesteld en is in een staat van pre immuniteit aan andere nauw verwante flavivirussen, vooral dengue virus (DENV). Hier beschrijven we een protocol voor het kwantificeren van het effect van menselijk serum antilichamen tegen DENV op ZIKV infectie in primaire menselijke cellen of cellijnen.

Inleiding

Onder de muggen overgebrachte virale ziekten is Zika infectie een van de meest klinisch belangrijk1. De infectie wordt veroorzaakt door de flavivirus ZIKV met, in de meeste gevallen, Aedes aegypti als zijn voornaamste vector1,2. Echter, er zijn studies die door Aedes albopictus worden gerapporteerd als een primaire vector in sommige ZIKV uitbraken3. Hoewel de infectie asymptomatisch in veel gevallen is zijn de meest voorkomende symptomen koorts, hoofdpijn en spier pijn2. Er is geen behandeling of vaccin beschikbaar voor ZIKV infectie en de beschikbare behandeling is meestal ondersteunende. Recente uitbarstingen van ZIKV in Zuid-Amerika leidde tot ernstige gevallen van de ziekte en een ongeveer 20-fold toename van de neurologische stoornis in foetussen microcefalie2genoemd. Omdat Zuid-Amerika een gebied is endemisch in verschillende arboviruses zoals DENV en West-Nijl virus, is het van cruciaal belang om te onderzoeken of voorafgaande immuniteit aan andere flavivirus(es) een rol in de ernst van de ZIKV infecties en ziekte speelt.

Door de eeuwen heen, zijn virussen geëvolueerd verschillende strategieën om te vergroten hun kans op besmettelijkheid overnemen van de ontvangende cel machines te onderdrukken de antivirale reactie. Een van de meest fascinerende van alles is het gebruik van host vooraf immune antilichamen door virussen ter verbetering van hun replicatie met het fenomeen ADE4. ADE in alle vier serotypen van DENV geweest goed bestudeerd en aangetoond om virale titers en ziekte resultaat5,6,7te verhogen. In een vorige in vitro onderzoek, hebben we significante verhoging van ZIKV replicatie toe te schrijven aan de reeds bestaande DENV immuniteit in primaire menselijke immune cellen8aangetoond. We toonden ook aan een relevante in vitro methode om de mogelijkheid van DENV bestaande antilichamen te verbeteren ZIKV replicatie in primaire cellen te kwantificeren.

Het protocol dat wij hebben ontwikkeld maakt gebruik van menselijk serummonsters die zijn getest voor DENV neutralisatie in TCID-50 of plaque vermindering neutralisatie test (PRNT) testen, samen met ZIKV in biologisch relevante cellen of cellen die verkregen uit weefsels die ZIKV kunnen infecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Serummonsters gebruikt in deze studie werden verkregen van de menselijke deelnemers van een cohort van Columbia. Sample collectie werd goedgekeurd door de interne review board (IRB) bij Universidad de Pamplona (Columbia, Zuid-Amerika) en Los Potios ziekenhuis8. De monsters werden anoniem verstrekt en onderzoekers hadden geen toegang tot informatie voor de patiënt. De serummonsters werden gecontroleerd voor het serotype DENV. De monsters werden verder bevestigd te neutraliseren DENV infectie in vitro. Voor controle, werden serummonsters van gezonde individuen (HC) uit de VS gebruikt.

Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken van de replicatie van ADE van ZIKV in elk type van de menselijke cel uiting geven aan de Fcγ receptor. Het protocol bestaat uit drie delen (Figuur 1).

1. cellen zaaien en infectie Setup

Opmerking: Voor dit specifieke studie, menselijke primaire macrofagen of U937 MyeloMonocytaire cellijn (ATCC-CRL-1593.2) werden gebruikt. De cellen werden onderhouden in RPMI groeimedium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) bij een incubator 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2). Alles wat de stappen zijn uitgevoerd in een biosafety level 2 (BSL-2) bioveiligheid kabinet onder steriele omstandigheden.

  1. Zaad 3 x 104 cellen per goed in een steriele flat-96-Wells bodemplaat samen met 100 µL van medium en plaats ze in de incubator van de 37 ° C met 5% CO2.
  2. Na het zaaien van de cellen, serummonsters bij kamertemperatuur ontdooien en 10-fold seriële verdunningen maken (dat wil zeggen, 1/10, 1/100, 1/1.000, 1/10.000) door het mengen van de monsters in serumvrij medium. Aliquot de verdunningen in een steriele 96-wells-plaat. Gebruik het virus zonder serum als een extra controle.
  3. Ontdooi de ZIKV voorraad bij 37 ° C in een waterbad voor 1-2 min en snel overbrengen aan ijs voor toekomstig gebruik.
  4. Een 0.1 multipliciteit infectie (MOI) gelijkwaardig bedrag van ZIKV stam MR766 aan de serum aliquots toevoegen.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de verdunningsfactor constant blijft en het totale volume ~ 200 µL is; dat is genoeg voor de triplicates van elke behandeling. Houd drie putten niet-geïnfecteerde te gebruiken als negatieve controle voor downstream-analyse.
  5. Incubeer de verdunningen van het serum met het toegevoegde virus in de incubator van de 37 ° C met 5% CO2 voor 1 h zodat de DENV-antilichamen tegen formulier complexen met de Zika-virionen (voor gemak, hierna te noemen "immuuncomplexen").
  6. De media van de cellen die werden zaadjes in de bodemplaat die flat-96-Wells gecombineerd. Wassen van de cellen met steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1 x PBS).
  7. Voeg 50 µL van de immuuncomplexen aan elk putje en hen uit te broeden in de incubator van de 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 uur.
  8. Na 2 uur incubatie, gecombineerd het medium met de immuuncomplexen uit de cellen, met behulp van een multichannel Pipetteer, en wassen van de cellen 2 x met 1 x PBS om de immuuncomplexen en eventuele niet-vastgemaakte virionen volledig te verwijderen.
  9. Voeg 100 µL van verse volledige media, aangevuld met 10% FBS aan elk goed en Incubeer de cellen in de incubator van de 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur.

2. RNA extractie

  1. Verwijder de 96-wells-plaat uit de incubator en overbrengen naar het biosafety kabinet.
  2. De media gecombineerd, wassen van de cellen 2 x met 1 x PBS, en ga naar RNA extractie.
    Opmerking: RNA kan worden geëxtraheerd door een methode van keuze (Zie de Tabel van de materialen).
  3. Voeg 250 µL van lysis van de cel buffer met 10% β-mercaptoethanol per putje. Pipetteer de buffer op en neer ten minste 5 x samen met krabben van de cellen met het uiteinde van de pipet om de lysis van de procedure te versnellen.
  4. De cel lysates overbrengen in nieuwe, gelabelde, steriele 1,5 mL tubes.
  5. Voeg een gelijke hoeveelheid van 70% ethanol (250 µL). Pipetteer op en neer 4 x - 5 x totdat het mengsel duidelijk is.
  6. Overbrengen in het mengsel (~ 500 µL) label silica gebaseerde kolommen in 2 mL collectie buizen en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 30 s. negeren de stroom door en houden van de kolommen in de dezelfde collectie buizen.
  7. 700 µL van was buffer 1 toevoegen aan elke kolom en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 30 s. negeren de stroom door en houden van de kolommen in de dezelfde collectie buizen.
  8. Voeg 500 µL van was buffer 2 aan elke kolom en centrifuge bij 15.000 x g voor 30 s. negeren het supernatant. Herhaal deze stap 2 x.
  9. Overdracht van de kolommen naar de nieuwe 2 mL collectie buizen en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 2 min. Zorg ervoor dat de silica gebaseerde kolommen helemaal droog krijgen en er geen ethanol is vertrok uit was buffer 2.
  10. Negeren van de 2 mL tubes en plaats de kolommen in nieuwe, steriele, label, 1,5 mL herstel buizen.
  11. Voeg voorverwarmde (42 ° C) 30 µL RNase-vrij water in het midden van elke kolom en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 1 minuut.
  12. Herstellen van de eluted RNA en kwantificeren van de monsters, met behulp van een spectrofotometer bij een 260 nm golflengte.
    Opmerking: In het ideale geval bepalen de zuiverheid van het RNA door berekening van de verhouding tussen de waarden van de extinctie op 260 nm en 280 nm. Gezuiverde-RNA's 260/280 verhouding ligt ideaal tussen 1.8-2.0.

3. kwantitatieve Real-time polymerasekettingreactie

Opmerking: Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) kan worden uitgevoerd met behulp van een SYBR groen mix die meestal bestaat uit SYBR groene ik kleurstof, polymerase van DNA Taq, deoxynucleotide trifosfaat (dNTPs) en een passieve kleurstof. Elke staat is het opsporen van SYBR groene qPCR-machine kan uitvoeren van de reactie en het verwerven van de gegevens worden gebruikt. Voor dit experiment, was een one-step RT-PCR kit gebruikt die een cocktail van SYBR groen had ik, ROX kleurstof, polymerase van DNA Taq, dNTPs en een extra mengsel van reverse-transcriptase (Zie Tabel van materialen). De inleidingen ontworpen tegen de envelop-regio en wordt gebruikt in deze studie te kwantificeren ZIKV genomic niveaus zijn CCGCTGCCCAACACAAG voor ZIKV-qF en CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT voor ZIKV-qR. Als een besturingselement, werd menselijke β-2-microglobulin (B2M) gemeten en gebruikt voor het normaliseren van de expressie van ZIKV (huishouding gene). De primer sequenties te kwantificeren van de B2M genexpressie gebruikt in deze studie zijn CTCCGTGGCCTTAGCTGTG voor B2M-qF en TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT voor B2M-qR. Zorgen om drie technische replicatieonderzoeken voor elk monster voor zowel de ZIKV als de B2M-genen. De installatie van de RT-PCR wordt hieronder kort beschreven.

  1. Installatie van de RT-PCR
    1. Gebruik 100 ng van RNA per monster.
    2. Voeg 1 µL van 10 µM voorraden van zowel voorwaartse als terugwaartse primers van een bepaald gen voor elke reactie.
    3. Voeg 0,25 µL van reverse-transcriptase mix per monster.
    4. Voeg voor elke individuele reactie, 12,5 µL van SYBR groen mix.
    5. Voeg maximaal 25 µL van water. Maak een meester mengen van alle bovengenoemde reagentia behalve RNA, aliquoot in de 96-Wells PCR plaat, en RNA laatst toevoegen.
    6. Het zegel van de plaat met doorzichtig plakband.
    7. Centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 1 minuut mengen van de reagentia.
    8. Zet de plaat in de qPCR-machine.
  2. RT-PCR profiel
    Opmerking: De RT-PCR-profiel weergegeven in tabel 1 gebruiken.
    1. Incubeer de monsters bij 50 ° C gedurende 10 minuten met het oog op de synthese van cDNA (cDNA).
    2. Na de cDNA synthese, activeren de polymerase van DNA Taq bij 95 ° C gedurende 5 min.
    3. Uitvoeren van 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C voor 10 s en primer gloeien en uitbreiding bij 60 ° C gedurende 30 s.
    4. Zet de extra smelt kromme stap (65° C) in het einde.
  3. Data-analyse
    1. De smelt-curve te controleren door te klikken op het tabblad kromme smelt in het programma gebruikt voor het uitvoeren van de qPCR machine, waarin, in het ideale geval een één piek in alle monsters voor een bepaald gen ter bevestiging van de aanwezigheid van slechts één amplicon en een amplificatie waarde meer dan 1.6 als de algoritmefu thm beschouwt 2 als de waarde van de 100%-amplificatie (de versterking-waarde is afhankelijk van het algoritme gebruikt door de qPCR-machine). Zorg ervoor dat u stappen van 0,5 ° C temperatuur tussen stappen en een minimale tijd van 10 houden s in het smelt kromme protocol, voor optimale resultaten.
    2. Na het maken van zeker dat er een interne amplicon en goede versterking waarde, klikt u eerst op op het tabblad gegevens kwantificering te krijgen van een kwantitatieve cyclus (Ct/Cq waarde) van elk monster en exporteren naar Microsoft Excel.
    3. Met behulp van een werkblad, wordt het gemiddelde van elk monster met behulp van de Ct-waarde berekend. Vervolgens klikt u in de formules en selecteer het gemiddelde. Het gemiddelde CT-waarden van elk monster (repliceren) worden gebruikt voor verdere analyse.
    4. Vervolgens berekent de ΔCt met behulp van de formule ΔCt = gemiddelde Ct van de target-gen - gemiddelde Ct van de controle-gen (in dit geval, ΔCt = gemiddelde Ct van de ZIKV-gen - gemiddelde Ct van de B2M-gen).
    5. Berekenen van ΔΔCt om te normaliseren van de gegevens (in dit geval, ΔΔCt = ΔCt ZIKV monsters - B2M monsters).
    6. Bereken dat de vouw verhogen genexpressie door te typen van de formule 2^-(ΔΔCt) voor elke waarde één ΔΔCt genormaliseerd. De resultaten van de-voudige toename uit te voeren statistische tests kunnen worden verkregen, zoals beschreven in eerdere studies9,10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In Figuur 1is er een stapsgewijze Schematische illustratie van de stappen voor het uitvoeren van het ADE-protocol. Het is een schematisch diagram toont de hele procedure van ADE van ZIKV als gevolg van reeds bestaande immuniteit aan DENV. Figuur 2 toont hoe menselijk serum monsters werden onderverdeeld in drie verschillende groepen: DENV besmetting-bevestigd monsters worden aangeduid als de groep DENV-geïnfecteerde, DENV antilich...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kruisallergie van DENV-antilichamen leidt tot het ADE van andere DENV-serotypes heeft de ontwikkeling van een doeltreffend vaccin11belemmerd. ZIKV behoort tot dezelfde familie, Flavivirus, en heeft een aanzienlijke homologie met andere flavivirussen, vooral DENV12. Het belangrijkste doel van neutraliserende antilichamen voor zowel ZIKV als DENV is de envelop eiwitten, die een zeer hoge structurele en quaternaire reeks homologie tussen de twee virussen13

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd genereus ondersteund door de 1R21AI129881-01 (tot T.M.C.), start-up middelen uit de nationale opkomende besmettelijke ziekten-laboratoria, en de Boston University School of Medicine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fetal Bovine Serum GEMINI100-106
iCycler BioRad785BR02188Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 CentrifugeBeckman Coulter 367160
Nanodrop-1000Thermoscientific 1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit Qiagen 204154Gebazig voor 1 stap RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit Qiagen 74106Gebazig voor RNA extractie
RPMI-medium Gibco11875093

Referenties

  1. Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
  2. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).
  3. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
  4. Hawkes, R. A. Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).
  5. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).
  6. Vaughn, D. W., et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).
  7. Khandia, R., et al. Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection. Frontiers of Immunology. 9, 597(2018).
  8. Londono-Renteria, B., et al. A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement. Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).
  9. Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics. 18 (1), 534(2017).
  10. Renn, L. A., et al. High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes. Journal of Visualized Experiments. (97), e52650(2015).
  11. McArthur, M. A., et al. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).
  12. Priyamvada, L., et al. Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology. Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33(2017).
  13. Dai, L., et al. Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus. IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).
  14. Dai, L., et al. Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).
  15. Sirohi, D., et al. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  16. George, J., et al. Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques. Scientific Reports. 7 (1), 10498(2017).
  17. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).
  18. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  19. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).
  20. Charles, A. S., Christofferson, R. C. Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro. PLoS Currents. 8, (2016).
  21. Swanstrom, J. A., et al. Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus. MBio. 7 (4), (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Denguevirusmenselijk serumvirale infectiekwantitatieve PCRRNA extractiecellyseimmuuncomplex

Gerelateerde artikelen