-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

Summary

RNA/eiwitcomplexen gezuiverd met behulp van botin-streptavidine strategie worden geëlueerd oplossing onder denatureren voorwaarden in een vorm die ongeschikt zijn voor verdere zuivering en de functionaalanalyse. Hier beschrijven we een wijziging van deze strategie dat gebruik maakt van een foto-cleavable linker in RNA en een zachte UV-elutie stap, inheemse en volledig functionele RNA/eiwitcomplexen oplevert.

Abstract

Voor vele jaren, is het uitzonderlijk sterk en snel gevormde interactie tussen Biotine en daar met succes gebruikt voor gedeeltelijke reiniging van biologisch belangrijke RNA/eiwitcomplexen. Echter deze strategie vertoont een grote nadeel dat het breder gebruik beperkt: de interactie van biotine/daar slechts onder voorwaarden die ook het verstoren van de integriteit van de eluted complexen, vandaar uitschakeling denaturering kan worden doorbroken hun latere functionaalanalyse en/of verdere zuivering door andere methoden. De eluted monsters zijn bovendien vaak besmet met de achtergrond eiwitten die nonspecifically met daar kralen associëren, bemoeilijken de analyse van de gezuiverde complexen door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Deze beperkingen wilt opheffen, ontwikkelden we een variant van de biotine/daar strategie waarin Biotine is aangesloten op een substraat van RNA via een foto-cleavable linker en de complexen geïmmobiliseerd op daar kralen zijn selectief geëlueerd aan oplossing in een inheemse vorm door lange golf UV, verlaten de achtergrond eiwitten op de parels. Kortere RNA-bindende substraten kunnen gesynthetiseerd worden chemisch met biotine en de foto-cleavable linker covalent gekoppeld aan het einde 5' van het RNA, overwegende dat langer RNA substraten kunnen worden voorzien van de twee groepen door een aanvullende oligonucleotide. Deze twee varianten van de UV-elutie-methode zijn getest voor zuivering van de U7 snRNP-afhankelijke verwerking complexen die Histon pre-mRNAs aan de 3'-eind klieven en zij allebei bewezen te gunstig vergelijken met andere eerder zuivering methodes ontwikkeld. De UV-geëlueerd monsters bevatte gemakkelijk detecteerbare hoeveelheid de U7 snRNP dat gratis grote eiwit contaminanten en geschikt voor een directe analyse van massaspectrometrie en functionele testen was. De beschreven methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de zuivering van andere RNA-bindende complexen en gebruikt in combinatie met single - en double-stranded DNA bandplaatsen om DNA-specifieke proteïnen en macromoleculaire complexen te zuiveren.

Introduction

In eukaryoten ondergaan RNA polymerase II gegenereerde mRNA precursoren (pre-mRNAs) verschillende evenementen van de rijping in de kern voordat hij volledig functionele mRNA sjablonen voor de eiwitsynthese in het cytoplasma. Een van deze gebeurtenissen is 3' eind verwerking. Voor de overgrote meerderheid van de pre-mRNAs omvat 3' eind verwerking decollete gekoppeld aan polyadenylatie. Deze twee stappen-reactie wordt gekatalyseerd door een relatief overvloedige complex bestaande uit meer dan 15 eiwitten¹. Dierlijke replicatie-afhankelijke Histon pre-mRNAs worden verwerkt aan de 3'-eind door een ander mechanisme waarin de hoofdrol wordt gespeeld door U7 snRNP, een lage overvloed complex bestaande uit snRNA van de U7 van ~ 60 nucleotiden en meerdere eiwitten^2,3 . De U7 snRNA baseparen met een specifieke opeenvolging Histon pre-mRNA en één van de subeenheden van de U7 snRNP katalyseert de splitsingsproducten-reactie, het genereren van volwassen Histon mRNA zonder een poly(A) staart. 3' eind verwerking van Histon pre-mRNA vereist ook stam-Loop bindende eiwit (SLBP), die een geconserveerde stam-lus ligt bindt stroomopwaarts van de breukzijde en verbetert de aanwerving van de U7 snRNP naar de substraat^2,3. Studies die gericht zijn op het identificeren van de afzonderlijke onderdelen van de U7 snRNP geweest uitdagend vanwege de lage concentratie van de U7 snRNP in dierlijke cellen en de tendens van het complex te distantiëren of gedeeltelijke proteolyse ondergaan tijdens het zuiveringsproces ongehinderd door het gebruik van milde detergentia^4,5,6, hoge zout wast en/of meerdere chromatografische stappen^7,-^8,9.

Onlangs, om te bepalen van de samenstelling van de machines voor het behandelen van de U7-afhankelijke, was een kort fragment van Histon pre-mRNA met biotine op 3' of 5' geïncubeerd met een nucleaire extract en de geassembleerde complexen werden vastgelegd op daar beklede agarose kralen^5,6,10. Als gevolg van de uitzonderlijk sterke interactie tussen Biotine en daar, waren de eiwitten geïmmobiliseerd op daar kralen geëlueerd onder de voorwaarden door te koken in SDS denaturering en geanalyseerd door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Terwijl deze eenvoudige aanpak een aantal onderdelen van de U7 snRNP vastgesteld, leverde het relatief ruwe monsters, vaak besmet met een groot aantal achtergrond eiwitten nonspecifically gebonden aan daar kralen, sommige onderdelen van potentieel te maskeren de machines voor het behandelen en voorkomen van hun detectie op zilver gekleurde gels^5,6,10. Nog belangrijker is, deze aanpak ook uitgesloten geen functionele studies met de geïsoleerde materiaal en haar verdere zuivering aan homogeniteit door aanvullende methoden.

Een aantal wijzigingen werden voorgesteld na verloop van tijd inspelen op het vrijwel onomkeerbare karakter van de interactie van biotine/daar, met de meeste van hen wordt ontworpen ofwel verzwakken de interactie of een chemisch cleavable spacer arm in de Biotine-bevattende reagentia^11,12. Het nadeel van alle wijzigingen van deze was dat ze aanzienlijk de doeltreffendheid van de methode en/of vaak vereist niet-fysiologische omstandigheden tijdens de elutie stap verminderen, de integriteit of de activiteit van de gezuiverde eiwitten in gevaar te brengen.

Hier beschrijven we een andere aanpak om de inherente probleem te verhelpen van de strategie van biotine/streptavidine met behulp van RNA substraten waarin Biotine covalent is bevestigd aan de 5' einde via een foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) ethyl-groep die is gevoelig voor de lange golf UV^13,14. Wij testten deze aanpak voor de zuivering van de beperkende machines voor het behandelen van U7-afhankelijke van Drosophila en zoogdieren nucleaire extracten¹⁵. Na een korte broedtijd van Histon pre-mRNA met biotine en de foto-cleavable linker met een nucleaire extract, de geassembleerde verwerking complexen zijn geïmmobiliseerd op daar kralen, grondig gewassen en voorzichtig vrijgegeven aan oplossing in een native formulier door blootstelling aan ~ 360 nm UV licht. De UV-elutie-methode is zeer efficiënt, snel en eenvoudig, voldoende hoeveelheden van de U7 snRNP te visualiseren van de componenten ervan door Splinter kleuring van zo weinig zoals 100 µL van het extract¹⁵oplevert. Het materiaal UV-geëlueerd is gratis achtergrond eiwitten en geschikt voor directe massaspectrometrie analyse, extra zuivering stappen en enzymatische tests. Dezelfde methode kan worden vastgesteld voor de zuivering van andere RNA/eiwitcomplexen, die relatief korte RNA bandplaatsen vereisen. Biotine en de foto-cleavable linker kunnen ook worden covalent bevestigd aan één - en dubbelstrengig DNA, de UV-elutie-methode voor de zuivering van diverse complexen van de DNA/proteïne potentieel uit te breiden.

Chemische synthese van RNA substraten met covalent gekoppeld Biotine en de foto-cleavable linker is praktisch alleen met de sequenties die overschrijd niet ~ 65 nucleotiden, steeds dure en inefficiënte voor aanzienlijk langere sequenties. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelden we ook een alternatieve benadering die geschikt is voor veel langer RNA-bindende doelstellingen. In deze benadering RNA van elke lengte en nucleotide sequentie is gegenereerd in vitro van de Transcriptie T7 of SP6 en gegloeid om een korte aanvullende oligonucleotide dat bevat Biotine en de foto-cleavable linker eind 5' (trans configuratie). De resulterende duplex wordt vervolgens gebruikt voor het zuiveren van individuele bindende proteïnen of macromoleculaire complexen op daar kralen na hetzelfde protocol beschreven voor de RNA-substraten met foto-cleavable Biotine covalent aangesloten (cis configuratie). Met deze wijziging, kan de foto-cleavable Biotine worden gebruikt in combinatie met in vitro gegenereerd afschriften met honderden nucleotiden, uitbreiding van de UV-elutie-methode voor de zuivering van een brede waaier van RNA/proteïne.

Protocol

1. substraat voorbereiding

Opmerking: RNA substraten korter dan ~ 65 nucleotiden kunnen chemisch gesynthetiseerd worden met biotine (B) en de linker van de foto-cleavable (pc) (samen aangeduid als foto-cleavable biotine of pcB) covalent gekoppeld aan het RNA 5' einde (cis configuratie). RNA substraten met aanzienlijk langere bandplaatsen moeten gegenereerde in vitro van de Transcriptie T7 (of SP6) en vervolgens naar een korte aanvullende adapter oligonucleotide met PCB's deel aan de 5'-eind (trans gegloeid configuratie) (Figuur 1).

1. Voor bandplaatsen bestaande uit minder dan ~ 65 nucleotiden, gebruik een commerciële fabrikant (Tabel of Materials) te synthetiseren chemisch RNA van belang met pcB covalent gekoppeld aan het RNA 5' einde (figuur 1A en figuur 2A). Ontbinden in steriel water tot de gewenste concentratie wordt bereikt en op te slaan in kleine porties bij-80 ° C.
2. Voor bandplaatsen aanzienlijk meer dan ~ 65 nucleotiden, vorm een gedeeltelijke duplex van een in vitro gegenereerd RNA van belang en een aanvullende adapter oligonucleotide met de pcB groep eind 5' (figuur 3A).
   1. De Transcriptie T7 op een gelineariseerde plasmide-DNA of een passende PCR-sjabloon voor het genereren van RNA met de bindende site van belang uitgebreid aan de 3'-eind door een willekeurige ~ 20-nucleotide-volgorde uitvoeren.
   2. Gebruik een commerciële fabrikant (Tabel of Materials) te synthetiseren chemisch een adapter oligonucleotide dat complementair is aan de 3'-uitbreiding in het RNA T7-gegenereerd en bevat pcB eind 5' (figuur 3A).
      Opmerking: Twee 18-atoom spacers en 2-3 niet-complementaire nucleotiden kunnen worden geplaatst aan het einde 5' van de oligonucleotide om potentiële sterische hinder tussen de afhankelijke complex en daar kralen. Het is ook wenselijk dat de oligonucleotide gelijkmatig wordt gewijzigd met een groep 2' O-methyl ter verbetering van de sterkte van de duplex en om weerstand tegen verschillende nucleasen te bieden.
   3. Ontharden de T7 gegenereerde RNA aan de pcB adapter oligonucleotide.
      1. Mix 20 pmol van RNA en 100 pmol van de adapter pcB oligonucleotide (1:5 molaire verhouding) in een 1,5 mL tube met 100 µL van bindende buffer met de volgende samenstelling: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).
         Opmerking: Het is belangrijk dat u een minimale hoeveelheid van de adapter oligonucleotide dat volstaat om te vormen van een duplex met de meeste (zo niet alle) pre-mRNA substraat gebruikt in de onthardende reactie. Dit kon worden gemakshalve bepaald door labeling van RNA substraat eind 5' met ³²P, gloeien de gelabelde substraat met steeds grotere hoeveelheden de adapter oligonucleotide met behulp van diverse buffer voorwaarden en het toezicht op de handhaving van de radioactieve signaal op daar kralen na meerdere wasbeurten van de parels met de bindende buffer.
      2. Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten.
      3. Laat het water om af te koelen tot kamertemperatuur.

2. complexe assemblage

1. 1 mL van een muis nucleaire extract (of een ander uittreksel van keuze) te vullen met 80 mM EDTA pH-8 om een eindconcentratie van 10 mM tot het blokkeren van niet-specifieke metaal-afhankelijke nucleasen die aanwezig in het extract zijn.
   Opmerking: Dit zal resulteren in het aanpassen van de buffer in het extract op de dezelfde samenstelling als die in de bindende buffer (zie stap 1.2.3.1). EDTA heeft geen invloed op in vitro verwerking van Histon pre-mRNAs maar in het zuiveren van proteïnen of eiwitcomplexen die in een magnesium-afhankelijke manier monteren schadelijk kan zijn. In deze gevallen moet de EDTA worden vermeden.
2. 5-10 pmol van het RNA-substraat gelabeld met de pcB-groep in DIS toevoegen (zie stap 1.1) of trans (zie stap 1.2.3.3) tot 1 mL van het extract met 10 mM EDTA.
   Nota: Het bedrag van RNA moet zorgvuldig worden geëvalueerd in een reeks van proef experimenten. Met behulp van teveel RNA substraat voor de zuivering van een beperkende complex misschien contraproductief, de achtergrond van niet-specifieke RNA-bindende proteïnen zonder enig effect op de opbrengst van specifieke proteïnen aanzienlijk te verhogen.
3. Incubeer de RNA-substraat met het extract voor 5 min op ijs, af en toe het mengen van het monster.
   Opmerking: Zowel de tijd en de temperatuur van de incubatie moeten worden empirisch vastgesteld en variëren aanzienlijk, afhankelijk van de specifieke aard van het RNA/eiwit complex.
4. Draai het incubatie-mengsel in een vooraf gekoelde microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 10.000 x g zorgvuldig verzamelen het supernatant vermijden van overdracht van de pellet te verwijderen elke potentiële precipitaten.

3. immobilisatie van het RNA/eiwitcomplexen op daar kralen.

1. ~ 100 µL van daar agarose kraal schorsing van een commerciële leverancier (Tabel of Materials) overbrengen naar een 1,5 mL-buis en verhoog het volume met de bindende buffer (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM EDTA).
   Opmerking: Deze buffer moet dezelfde samenstelling als die in de onthardende mengsel en in het extract gebruikt voor complexe montage (stap 2.1).
2. Verzamel de kralen aan de onderkant van de buis door spinnen voor 2-3 min op 25 x g en het supernatant gecombineerd.
3. Herhaal de procedure wassen/spinnen 2 - 3 keer naar de kralen met de bindende buffer equilibreer.
   Opmerking: Aan het eind van deze stap, de pellet van de parels moet een volume van ~ 30 µL.
4. Laad het supernatant met de geassembleerde complex (stap 2.4) over de geëquilibreerd daar agarose kralen.
5. Draaien van 1 uur bij 4 ° C tot het immobiliseren van RNA en de afhankelijke complexen op de parels.
6. Het verzamelen van de parels aan de onderkant van de buis door spinnen voor 2-3 min op 25 x g.
   Opmerking: Gebruik een schommel uit rotor te voorkomen aanzienlijk verlies van de parels als ze de neiging zich te houden aan de kant van de buis in hoekige rotoren.
7. De bovendrijvende substantie gecombineerd en spoel de kralen tweemaal met 1 mL van de bindende buffer, met behulp van de dezelfde CENTRIFUGEEROMSTANDIGHEDEN.
8. Voeg 1 mL van de bindende buffer en draai het monster 1 uur bij 4 ° C.
   Opmerking: Deze stap kan worden verkort als het complex gevormd op het substraat neiging om zich te distantiëren.
9. Spin down de kralen voor 2-3 min op 25 x g, voeg 1 mL van de buffer en spoel de suspensie tot een nieuwe koker.
10. Voor een extra 1 uur of korter, als het complex niet stabiel is draaien, spin down voor 2-3 min op 25 x g en de kralen overbrengen in een buis 500 µL in 200 µL van bindende buffer.

4. UV-elutie.

1. Inschakelen van een hoge intensiteit UV-lamp uitstralen van 365 nm UV licht gedurende 5-10 minuten vóór het bereiken van volledige schittering.
   Opmerking: Dit is essentieel voor het bereiken van de maximale energie van UV emissie aan het begin van de bestraling.
2. Vul de bodem van een petrischaal (100 mm x 15 mm) met opeengepakte ijs en stapel het over de deksel van de schotel.
3. Kort vortex de buis met het geïmmobiliseerdet complex, plaats het horizontaal op ijs en dekking met de voorverwarmde lamp, ervoor te zorgen dat het monster zich bevindt binnen de afstand van de oppervlakte van de bol 2-3 cm.
   Opmerking: Als de afstand te groot is, gebruik extra petrischalen of andere geschikte objecten om het monster dichter naar de lamp.
4. Bestralen voor een totaal van 30 min, vaak omkeren en vortexing de buis om uniforme Gasbedwelming met behulp van de schorsing UV en oververhitting te voorkomen.
   Opmerking: Om te zorgen voor extra koeling, de UV-elutie stap kan worden uitgevoerd in een koude kamer. Overschakelen naar een petrischaal met vers ijs in geval van buitensporige ijs smelten.
5. Spin down de kralen voor 2-3 min op 25 x g en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
6. Opnieuw draaien de bovendrijvende vloeistof met behulp van dezelfde voorwaarden en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
   Opmerking: Laat een kleine hoeveelheid van de bovendrijvende vloeistof op de bodem om te voorkomen dat residuele kralen.

5. analyse door zilveren kleuring gevolgd door massaspectrometrie.

1. Gebruik SDS/polyacrylamide gelelektroforese een fractie van het supernatans dat UV-geëlueerd en de zelfde breuk van het materiaal liet op de kralen na UV elutie worden gescheiden.
   Opmerking: De analyse kan ook een aliquoot deel van de parels uit het monster vóór UV-elutie genomen.
2. De gel bevat vlek gescheiden eiwitten met behulp van een commercieel beschikbare silver kleuring kit.
3. Evaluatie van de doeltreffendheid van UV-elutie door het vergelijken van de intensiteiten van de eiwitten aanwezig in het UV-geëlueerd supernatant en die links op de parels na UV-bestraling.
4. Accijnzen van de bands van de proteïne van belang en het bepalen van hun identiteit door de Spectrometrie van de massa, met behulp van standaard protocollen^10,15.

6. de globale analyse van UV-geëlueerd monster door massaspectrometrie.

1. Direct een fractie van het supernatans dat UV-geëlueerd analyseren door Spectrometrie van de massa om te bepalen van de gehele proteoom van het gezuiverde materiaal op onpartijdige wijze.
   Opmerking: Dit kan gebeuren door-oplossing behandeling van de gezuiverde monsters met trypsine gevolgd door standaard massa spectrometrie protocollen bij het bepalen van de identiteit van de genereren peptiden^10,15.

Results

De UV-elutie-methode werd getest met twee chemisch gesynthetiseerde RNA substraten covalent aangesloten eind 5' op de pcB-groep (cis configuratie): pcB-SL (Figuur 1) en pcB-dH3/5 m RNAs (Figuur 2). De 31-nucleotide pcB-SL RNA bevat een structuur van de stam-lus gevolgd door een 5-nucleotide één gestrande staart en de volgorde is identiek aan de 3'-eind van volwassen Histon mRNA (dwz., na de splitsing van Histon ...

Discussion

De hier beschreven methode is eenvoudig en naast het opnemen van een foto-cleavable linker en de UV-elutie stap verschilt niet van de gebruikte methoden die van de zeer sterke wisselwerking tussen Biotine en daar profiteren. De UV-elutie stap is zeer efficiënt, meestal het vrijgeven van meer dan 75% van de geïmmobiliseerdet RNA en eiwitten uit daar kralen, waardoor er achter een hoge achtergrond van proteïnen toe die niet-specifiek aan de kralen binden bijbehorende. Doordat deze achtergrond, levert de UV-elutie stap opme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Vraag een offerte aan bij Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612