-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

Summary

RNA/eiwitcomplexen gezuiverd met behulp van botin-streptavidine strategie worden geëlueerd oplossing onder denatureren voorwaarden in een vorm die ongeschikt zijn voor verdere zuivering en de functionaalanalyse. Hier beschrijven we een wijziging van deze strategie dat gebruik maakt van een foto-cleavable linker in RNA en een zachte UV-elutie stap, inheemse en volledig functionele RNA/eiwitcomplexen oplevert.

Abstract

Voor vele jaren, is het uitzonderlijk sterk en snel gevormde interactie tussen Biotine en daar met succes gebruikt voor gedeeltelijke reiniging van biologisch belangrijke RNA/eiwitcomplexen. Echter deze strategie vertoont een grote nadeel dat het breder gebruik beperkt: de interactie van biotine/daar slechts onder voorwaarden die ook het verstoren van de integriteit van de eluted complexen, vandaar uitschakeling denaturering kan worden doorbroken hun latere functionaalanalyse en/of verdere zuivering door andere methoden. De eluted monsters zijn bovendien vaak besmet met de achtergrond eiwitten die nonspecifically met daar kralen associëren, bemoeilijken de analyse van de gezuiverde complexen door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Deze beperkingen wilt opheffen, ontwikkelden we een variant van de biotine/daar strategie waarin Biotine is aangesloten op een substraat van RNA via een foto-cleavable linker en de complexen geïmmobiliseerd op daar kralen zijn selectief geëlueerd aan oplossing in een inheemse vorm door lange golf UV, verlaten de achtergrond eiwitten op de parels. Kortere RNA-bindende substraten kunnen gesynthetiseerd worden chemisch met biotine en de foto-cleavable linker covalent gekoppeld aan het einde 5' van het RNA, overwegende dat langer RNA substraten kunnen worden voorzien van de twee groepen door een aanvullende oligonucleotide. Deze twee varianten van de UV-elutie-methode zijn getest voor zuivering van de U7 snRNP-afhankelijke verwerking complexen die Histon pre-mRNAs aan de 3'-eind klieven en zij allebei bewezen te gunstig vergelijken met andere eerder zuivering methodes ontwikkeld. De UV-geëlueerd monsters bevatte gemakkelijk detecteerbare hoeveelheid de U7 snRNP dat gratis grote eiwit contaminanten en geschikt voor een directe analyse van massaspectrometrie en functionele testen was. De beschreven methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de zuivering van andere RNA-bindende complexen en gebruikt in combinatie met single - en double-stranded DNA bandplaatsen om DNA-specifieke proteïnen en macromoleculaire complexen te zuiveren.

Introduction

In eukaryoten ondergaan RNA polymerase II gegenereerde mRNA precursoren (pre-mRNAs) verschillende evenementen van de rijping in de kern voordat hij volledig functionele mRNA sjablonen voor de eiwitsynthese in het cytoplasma. Een van deze gebeurtenissen is 3' eind verwerking. Voor de overgrote meerderheid van de pre-mRNAs omvat 3' eind verwerking decollete gekoppeld aan polyadenylatie. Deze twee stappen-reactie wordt gekatalyseerd door een relatief overvloedige complex bestaande uit meer dan 15 eiwitten¹. Dierlijke replicatie-afhankelijke Histon pre-mRNAs worden verwerkt aan de 3'-eind door een ander mechanisme waarin de hoofdrol wordt gespeeld ....

Protocol

1. substraat voorbereiding

Opmerking: RNA substraten korter dan ~ 65 nucleotiden kunnen chemisch gesynthetiseerd worden met biotine (B) en de linker van de foto-cleavable (pc) (samen aangeduid als foto-cleavable biotine of pcB) covalent gekoppeld aan het RNA 5' einde (cis configuratie). RNA substraten met aanzienlijk langere bandplaatsen moeten gegenereerde in vitro van de Transcriptie T7 (of SP6) en vervolgens naar een korte aanvullende adapter oligonucleotide met PCB's deel aan de 5'-eind (trans gegloeid configuratie) (Figuur 1).

1. Voor bandplaatsen bestaande uit minder dan ....

Results

De UV-elutie-methode werd getest met twee chemisch gesynthetiseerde RNA substraten covalent aangesloten eind 5' op de pcB-groep (cis configuratie): pcB-SL (Figuur 1) en pcB-dH3/5 m RNAs (Figuur 2). De 31-nucleotide pcB-SL RNA bevat een structuur van de stam-lus gevolgd door een 5-nucleotide één gestrande staart en de volgorde is identiek aan de 3'-eind van volwassen Histon mRNA (dwz., na de splitsing van Histon .......

Discussion

De hier beschreven methode is eenvoudig en naast het opnemen van een foto-cleavable linker en de UV-elutie stap verschilt niet van de gebruikte methoden die van de zeer sterke wisselwerking tussen Biotine en daar profiteren. De UV-elutie stap is zeer efficiënt, meestal het vrijgeven van meer dan 75% van de geïmmobiliseerdet RNA en eiwitten uit daar kralen, waardoor er achter een hoge achtergrond van proteïnen toe die niet-specifiek aan de kralen binden bijbehorende. Doordat deze achtergrond, levert de UV-elutie stap opme.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp	Cole-Parmer	UX-97600-00
Replacement bulb	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor	Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612