Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om te simuleren Cryptococcus infectie, Amoeba, dat is de natuurlijke roofdier van crypto Kokken cellen in de omgeving, kan worden gebruikt als een model voor macrofagen. Dit roofzuchtige organisme, vergelijkbaar met macrofagen, maakt gebruik van fagocytose om geïnternationaliseerde cellen te doden. Met behulp van een confocale laser scanning microscoop worden beelden van interactieve momenten tussen crypto Kokken cellen en Amoeba gevangen. Het resolutievermogen van de elektronen microscoop helpt ook om de ultrastructurele Details van crypto Kokken cellen te onthullen wanneer ze in het amoeba voedsel vacuole worden gevangen. Aangezien fagocytose een continu proces is, worden kwantitatieve gegevens vervolgens in de analyse geïntegreerd om uit te leggen wat er op het tijdpunt gebeurt wanneer een afbeelding wordt vastgelegd. Om specifiek te zijn, worden relatieve fluorescentie-eenheden gelezen om de efficiëntie van amoeba bij het internaliseren van crypto Kokken-cellen te kwantificeren. Voor dit doel, crypto Kokken cellen worden gekleurd met een kleurstof die maakt ze fluoresceren eenmaal gevangen in het zure milieu van het voedsel vacuole. Bij samengebruik kan informatie die via dergelijke technieken wordt verzameld, kritieke informatie bieden om conclusies te trekken over het gedrag en het lot van cellen wanneer ze geïnternationaliseerd worden door amoeba en, mogelijk, door andere phagocytische cellen.
Inleiding
Microben hebben zich in de loop van de tijd ontwikkeld om te bezetten en gedijen in verschillende ecologische niches zoals de open fysieke grenzen van de bodem en het water, onder andere1. In deze niches zijn microben vaak betrokken bij de directe concurrentie voor beperkte middelen; belangrijk, voor voedingsstoffen die ze gebruiken voor de ondersteuning van hun groei of ruimte, die ze nodig hebben om de groeiende bevolking2,3tegemoet te komen. In bepaalde gevallen kunnen sommige holozoïneorganismen zoals amoeba zelfs op crypto Kokken-cellen worden voorgedate als een manier om voedingss....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Cryptococcus coccus en sommige Acanthamoeba castellanii stammen worden beschouwd als bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) pathogenen; Zo moeten onderzoekers gepaste voorzorgsmaatregelen nemen bij het werken met deze organismen. Laboratoriumpersoneel moet bijvoorbeeld specifieke training en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) hebben, zoals Labjassen, handschoenen en oogbescherming. Een biologische veiligheidskast (niveau-2) moet worden gebruikt voor procedures die infectie kunnen veroorzaken14.
1. teelt en standaardisatie van schimmelcellen (gewijzigd van Madu et al. 15 )
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Microben zijn microscopische organismen die niet met het blote oog kunnen worden waargenomen. Echter, hun effect kan resulteren in waarneembare klinisch evidente ziekten, zoals huidinfecties. Bij het bestuderen van bepaalde aspecten van microben, variërend van hun morfologie, bijproducten, en interacties, zijnde kundig voor picturale en video-bewijs is van het allergrootste belang.
We eerst geprobeerd om de interactie tussen cry.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het papier, verschillende technieken werden met succes gebruikt om de mogelijke uitkomst die kunnen ontstaan wanneer amoeba interactie met crypto Kokken cellen onthullen. Ook, we waren geïnteresseerd om te laten zien van de effecten van 3-hydroxy vetzuren op het resultaat van de interacties van Cryptococcus-amoeba.
De eerste gebruikte techniek was confocale microscopie, die stilstaande beelden heeft gerenderd. Het grote nadeel van deze techniek was dat het ons alleen informatie gaf.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Het werk werd gesteund door een subsidie van de National Research Foundation of South Africa (subsidie nummer: UID 87903) en de Universiteit van de Vrijstaat. We zijn ook dankbaar voor diensten en assistentie aangeboden door Pieter van Wyk en Hanlie Grobler tijdens onze microscopie studies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
Referenties
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
