Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

Summary

Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.

Abstract

Om te simuleren Cryptococcus infectie, Amoeba, dat is de natuurlijke roofdier van crypto Kokken cellen in de omgeving, kan worden gebruikt als een model voor macrofagen. Dit roofzuchtige organisme, vergelijkbaar met macrofagen, maakt gebruik van fagocytose om geïnternationaliseerde cellen te doden. Met behulp van een confocale laser scanning microscoop worden beelden van interactieve momenten tussen crypto Kokken cellen en Amoeba gevangen. Het resolutievermogen van de elektronen microscoop helpt ook om de ultrastructurele Details van crypto Kokken cellen te onthullen wanneer ze in het amoeba voedsel vacuole worden gevangen. Aangezien fagocytose een continu proces is, worden kwantitatieve gegevens vervolgens in de analyse geïntegreerd om uit te leggen wat er op het tijdpunt gebeurt wanneer een afbeelding wordt vastgelegd. Om specifiek te zijn, worden relatieve fluorescentie-eenheden gelezen om de efficiëntie van amoeba bij het internaliseren van crypto Kokken-cellen te kwantificeren. Voor dit doel, crypto Kokken cellen worden gekleurd met een kleurstof die maakt ze fluoresceren eenmaal gevangen in het zure milieu van het voedsel vacuole. Bij samengebruik kan informatie die via dergelijke technieken wordt verzameld, kritieke informatie bieden om conclusies te trekken over het gedrag en het lot van cellen wanneer ze geïnternationaliseerd worden door amoeba en, mogelijk, door andere phagocytische cellen.

Introduction

Microben hebben zich in de loop van de tijd ontwikkeld om te bezetten en gedijen in verschillende ecologische niches zoals de open fysieke grenzen van de bodem en het water, onder andere¹. In deze niches zijn microben vaak betrokken bij de directe concurrentie voor beperkte middelen; belangrijk, voor voedingsstoffen die ze gebruiken voor de ondersteuning van hun groei of ruimte, die ze nodig hebben om de groeiende bevolking^2,3tegemoet te komen. In bepaalde gevallen kunnen sommige holozoïneorganismen zoals amoeba zelfs op crypto Kokken-cellen worden voorgedate als een manier om voedingss....

Protocol

Cryptococcus coccus en sommige Acanthamoeba castellanii stammen worden beschouwd als bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) pathogenen; Zo moeten onderzoekers gepaste voorzorgsmaatregelen nemen bij het werken met deze organismen. Laboratoriumpersoneel moet bijvoorbeeld specifieke training en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) hebben, zoals Labjassen, handschoenen en oogbescherming. Een biologische veiligheidskast (niveau-2) moet worden gebruikt voor procedures die infectie kunnen veroorzaken¹⁴.

1. teelt en standaardisatie van schimmelcellen (gewijzigd van Madu et al. ¹⁵ )

....

Results

Microben zijn microscopische organismen die niet met het blote oog kunnen worden waargenomen. Echter, hun effect kan resulteren in waarneembare klinisch evidente ziekten, zoals huidinfecties. Bij het bestuderen van bepaalde aspecten van microben, variërend van hun morfologie, bijproducten, en interacties, zijnde kundig voor picturale en video-bewijs is van het allergrootste belang.

We eerst geprobeerd om de interactie tussen cry.......

Discussion

In het papier, verschillende technieken werden met succes gebruikt om de mogelijke uitkomst die kunnen ontstaan wanneer amoeba interactie met crypto Kokken cellen onthullen. Ook, we waren geïnteresseerd om te laten zien van de effecten van 3-hydroxy vetzuren op het resultaat van de interacties van Cryptococcus-amoeba.

De eerste gebruikte techniek was confocale microscopie, die stilstaande beelden heeft gerenderd. Het grote nadeel van deze techniek was dat het ons alleen informatie gaf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane	Sigma-Aldrich	D27802	-
1.5-mL plastic tube	Thermo Fisher Scientific	69715	-
15-mL Centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	7252018	-
50-mL Centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	1132017	-
8-Well chamber slide	Thermo Fisher Scientific	1109650	-
Acetone	Merck	SAAR1022040LC	-
Amoeba strain	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC medium 712	ATCCÒ	712TM	Amoeba medium
Black 96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	152089	-
Centrifuge	Hermle	-	-
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	-
Confocal microscope	Nikon	Nikon TE 2000	-
Epoxy resin:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221 resin	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)	[4] ALS	[4] R1067	-
Fluorescein isothiocyanate	Sigma-Aldrich	F4274	-
Formic Acid	Sigma-Aldrich	489441	-
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Microplate reader
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Glutaraldehyde	ALS	R1009	-
Hemocytometer	Boeco	-	-
Lead citrate	ALS	R1209	-
Liquid Chromatography Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific		-
Methanol	Sigma-Aldrich	R 34,860	-
Orbital shaker	Lasec	-	-
Osmium tetroxide	ALS	R1015	-
pHrodo Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solution	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	-
Rotary shaker	Labcon	-	-
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate	[2] Merck	[2] 106345
Transmission electron microscope	Philips	Philips EM 100	-
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154	-
Ultramicrotome	Leica	EM UC7	-
Uranyl acetate	ALS	R1260A	-
Vacuum dessicator	Lasec	-	-
Vial	Sigma-Aldrich	29651-U	-
YNB	Lasec	239210	-
YPD agar	Sigma-Aldrich	Y-1500	-