Tot vaststelling van een stabiel cellijn overexpressing een gen van belang zijn voor het bestuderen van de genfunctie kan gebeuren door stabiele transfectie-picking enkele klonen na transfecting hen via retrovirale infectie. Hier laten we zien dat HT29-DR3 cellijnen gegenereerd op deze manier verhelderen de mechanismen door welke dood receptor 3 (DR3) draagt bij tot antimitotics-veroorzaakte apoptosis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tot oprichting van de cellijnen Overexpressing DR3 om te beoordelen van de Apoptotic reactie op anti-mitotische Therapeutics
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bestuderen van de functie van een gen van belang kan worden bereikt door het manipuleren van het niveau van meningsuiting, zoals minderen qua uitdrukkingswijze met vechtpartij cellijnen of het verhogen van de expressie met overexpressie cellijnen. Voorbijgaande en stabiele transfectie zijn twee methoden die worden vaak gebruikt voor exogene genexpressie. Voorbijgaande Transfectie is alleen handig voor korte termijn expressie, overwegende dat stabiele transfectie kunt exogene genen worden geïntegreerd in het genoom van de cel host waar het voortdurend zal worden uitgedrukt. Dientengevolge, is stabiele transfectie meestal werkzaam voor onderzoek in lange termijn genetische verordening. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het genereren van een stabiele cellijn tagged dood receptor 3 (DR3) te verkennen DR3 functie overexpressing. We pakte enkele klonen na een retrovirale infectie teneinde de homogeniteit en de zuiverheid van de stabiele cellijnen. De stabiele cellijnen gegenereerd met behulp van dit protocol maken DR3-deficiënte HT29 cellen gevoelig voor antimitotische geneesmiddelen, aldus bijenpopulatie de apoptotic reactie in HT29 cellen. Bovendien, de vlag-tag op DR3 compenseert de onbeschikbaarheid van goede DR3 antilichaam en vergemakkelijkt de biochemische studie van het moleculaire mechanisme waarmee antimitotische agenten apoptosis induceren.
Inleiding
Heterologe genexpressie is vaak aangewend om te bestuderen van de functie van genen van belang. Twee methoden, voorbijgaande en stabiele transfectie, worden prevalently gebruikt in cellen en moleculaire biologie aan een segment van DNA of RNA invoegen een host cel1,2. Transient-transfected DNA of RNA kan niet worden doorgegeven aan dochtercellen, zodat de genetische wijziging kan alleen worden gehandhaafd voor een korte periode van tijd. Aan de andere kant, in stabiel transfected cellen, zijn exogene genen geïntegreerd in het ontvangende cel genoom, behoud van de expressie in de cellijn. Dus, stabiele transfec....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Houd er rekening mee dat alle hier beschreven muis experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd overeenkomstig de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Tsinghua.
1. generatie van DR3 overexpressie cellijnen
- Bouw van de plasmide voor DR3 expressie (pMXs-IRES-DR3-FLAG) door het invoegen van full-length DR3 cDNA met 3 x vlag in het C-terminus in retrovirale vector pMXs-IRES-Blasticidin op de sites van de beperking van BamHI/XhoI.
- Groeien Plat-A cellen in 60 mm gerechten met 4 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). De volgende dag, wanneer de cellen bereikt 80% - 90% sam....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een karakterisering van HT29 cellen stabiel uiten DR3 is afgebeeld in Figuur 1. De klonen express uiteenlopende niveaus van DR3, terwijl de wild-type-cellen, die als een negatieve controle dienen, geen exogene genexpressie vertonen. Hier tonen we slechts vijf klonen, waaronder kloon 1 en 5 express het hoogste niveau van DR3. We kozen de kloon 1 en 5 voor de volgende experimenten.
De morfologie van c.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit manuscript beschrijven we een methode voor het genereren van HT29-DR3 stabiele cellijnen. HT29-DR3 cellen bieden een model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die door die DR3 draagt bij aan apoptosis geïnduceerd door antimitotische agenten. Deze aanpak is veelzijdig en herhaalbaar. Om te verzekeren het succes van de procedure, vier belangrijke stappen van het protocol moeten worden overwogen. Eerst, produceren een hoog genoeg virus titer, wordt u aangeraden uitvoeren DNA transfectie wanneer de Plat.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies 53110000117 (naar G.W.) en 043222019 (met X.W.) van Tsinghua Universiteit.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Aangevuld met 10% FBS en 1% Penicilline/Streptomycine |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfectie Reagens | Promega | E2311 | |
| Anti-muis secundair antilichaam | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antilichaam | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cellijn | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cellijn | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Kloon Cilinder | Sigma | C1059 | |
| Celbeelding Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Geïnverteerde Microscoop | Olympus | CKX53 | |
| 12-well celkweek platen | Nest | 712001 | |
| 60 mm celkweek platen | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge buizen | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steriele filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well Witte Polystyreen Microplaat | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substraat | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Ontkleurende Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Geautomatiseerde celteller | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
Referenties
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
