Onderzoek naar genetische afhankelijkheden met behulp van CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van testen

Samenvatting

Dit manuscript wordt een geclusterde regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) CRISPR-Cas9-gebaseerde methode voor eenvoudige en snelle onderzoek van de rol van meerdere kandidaat-genen in Acute myeloïde leukemie (AML) celproliferatie in beschreven parallel. Deze techniek is schaalbaar en kan worden toegepast in andere kanker cel beeldlijnen.

Samenvatting

Gene perturbation studies zijn uitvoerig gebruikt om de rol van afzonderlijke genen in AML pathogenese te onderzoeken. Voor het bereiken van volledige gene verstoring, hebben veel van deze studies gebruik van complexe gene knock-out modellen. Deze studies met knock-out muizen bieden een elegante en beproefde systeem voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties, een snelle en schaalbare methode voor de beoordeling van kandidaat-genen die spelen een rol in AML celproliferatie of overleven in AML modellen zal helpen versnellen de parallelle ondervraging van meerdere kandidaat-genen. Recente vooruitgang in de genoom-bewerken technologieën hebben ons vermogen tot het uitvoeren van genetische verstoringen op een ongekende schaal dramatisch verbeterd. Een dergelijk systeem voor het bewerken van het genoom is de CRISPR-Cas9-gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het maken van snelle en effectieve wijzigingen in het genoom van de cel doelgroep. Het gemak en de schaalbaarheid van CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-verwijdering maakt het een van de meest aantrekkelijke technieken voor de ondervraging van een groot aantal genen in fenotypische testen. Hier presenteren we een eenvoudige test met behulp van CRISPR/Cas9 gemedieerde gen-verstoring gecombineerd met hoge gegevensdoorvoer stroom cytometry-gebaseerde mededinging testen te onderzoeken van de rol van genen die een belangrijke rol in de verspreiding spelen kan of overleving van mens en lymfkliertest AML cellijnen.

Inleiding

De afgelopen decennia hebben gezien tal van onderzoeksinspanningen gericht op het identificeren van de bijdrage van belangrijke moleculaire pathways in acute myeloïde leukemie (AML) pathogenese. Traditioneel, is gen-verstoring van AML cellen uitgevoerd met behulp van voorwaardelijke knock-out muizen of korte-haarspeld RNA (shRNA). Terwijl de knock-out muizen bieden een geavanceerde systeem voor spatio-temporele controle van gen-verwijdering, is het genereren van gene knock-out muizen arbeidsintensief, tijdrovend en duur. Bovendien, gen-uitsparingen met behulp van recombinatie strategieën is niet gemakkelijk schaalbare; deze strategieën doen niet lenen zich goed voor de ondervraging van meerdere genen in parallel. Na de ontdekking van RNA interferentie methoden om endogene mRNAs knock-down met Klein Mengend RNA (siRNA) of shRNA, vele groepen gestart met behulp van RNA interferentie technieken te onderzoeken van de rol van specifieke genen in AML. Aangezien zowel menselijke als lymfkliertest AML cellen zijn notoir moeilijk te transfect met behulp van traditionele lipide gebaseerde transfectie methoden, bestudeert de meeste werknemers lentivirally of retrovirally-gecodeerde shRNA voor het bestuderen van de genfunctie in AML cellen. De recente ontdekking van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) en de bijbehorende Cas nucleasen (CRISPR-Cas9) heeft een revolutie teweeggebracht in gentargeting technologieën^1,2,3. Met behulp van CRISPR-Cas9, specifieke genen of genomic regio's kunnen worden verwijderd, bewerkt of gelabeld met efficiëntie en gemak. CRISPR-Cas9-gebaseerde gen-bewerken is nu in opkomst als de methode van keuze voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties in diverse celtypen te wijten aan de eenvoud, doeltreffendheid en brede toepasbaarheid van deze techniek. CRISPR Cas9-gebaseerde methoden zijn ook steeds de methode van keuze in AML, niet alleen voor afzonderlijke genen ondervragen, maar ook als een manier om zich te richten op meerdere genen in gekleed of gegroepeerde genetische schermen gericht onderzoekt verschillende genen parallel als potentieel AML-dependencies^4,5,6.

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige concurrerende groei assay voor het meten van de impact van gen-verstoringen op de groei van AML cellen, gebaseerd op stabiele CRISPR-Cas9-gemedieerde gene bewerken gevolgd door high-throughput stroom cytometry. Deze methode is eenvoudig, efficiënt en schaalbaar tot middellange-doorvoer experimenten om de rol van meerdere genen parallel in AML cellen te onderzoeken.

Protocol

1. genereren AML cel lijn klonen met hoge uitdrukking van stabiele en actieve Cas9

1. Productie van Cas9 lentivirus
   1. Dag 0: Plaat 4 x 10⁶ 293T cellen in 10 mL DMEM met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline en L-glutamine in een 10 cm weefselkweek schotel in een biosafety Level 2 (BSL2) gecertificeerd cel cultuur kap. Plaats de schotel in een 37 ° C incubator.
   2. Dag 1: De vergulde 293T cellen moet 70 – 80% heuvels op dag 1. Het uitvoeren van de transfectie met behulp van het volgende protocol in de middag.
   3. Warm de transfectie medium, cultuurmedia en transfectiereagens tot kamertemperatuur. Ontdooi de vereiste plasmiden voor Transfectie.
   4. Mix 9 µg psPAX2, 0.9 µg van pMD2.G en 9 µg lolploeg-Cas9 plasmiden met 500 µL van transfectie medium in een tube van 5 mL.
   5. Voeg 1,7 mL van transfectie medium een 14 ml ronde onderkant buis. Voeg 57 µL van transfectiereagens direct in het medium van de transfectie in de buis om te voorkomen dat de wand van de buis aan te raken.
   6. Zachtjes de hele plasmide mix Voeg tot oplossing van de reagens van de transfectie en meng door zachtjes te tikken op de buis aan de kant. Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 minuten inwerken. Ondertussen, verandert het medium van de geplaatste 293T plaat.
   7. De transfectie mix ontkleuring toevoegen aan de plaat en zachtjes rock de plaat zijwaarts voor het efficiënt mengen. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator.
   8. Dag 2: Gecombineerd het supernatant van de transfectie plaat voorzichtig zodat de cellen niet worden verstoord of van de plaat verdreven. Verwijder het supernatant. Voeg 10 mL van vers 10% DMEM medium door te schuiven naar beneden voorzichtig van de zijden van de plaat om te voorkomen dat loskomt van de cellen.
   9. Dag 3: Verzamelen het virus supernatans van de transfectie plaat langzaam bevattende voor het tekenen in een steriele injectiespuit van 10 cm. Na het verzamelen van de bovendrijvende vloeistof in de spuit, een steriele 0,45 µM filter koppelen aan de spuit en de spuit en de filter op een vers, steriele 15 mL polypropyleen conische buis houdt. Zachtjes duik de spuit om te filteren van het virus met bovendrijvende vloeistof door het 0,45 µM filter in de polypropyleen conische buis 15 mL.
   10. Het virale geconditioneerde medium opslaan in porties van 2 mL in 2 mL cryovials bij-80 ° C.
2. Transductie van AML cellijnen
   1. Dag -1: Verdun 1 mg/mL recombinante menselijke fibronectine fragment voorraad tot 10 µg/mL met steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Jas een niet-Weefselkweek behandeld 6 goed plaat met 2 mL van de werkoplossing voor recombinante menselijke fibronectine fragment van 10 µg/mL in een BSL2 goedgekeurd kap voor de cultuur van de cel. Wikkel de plaat in zelfklevende wrap om verlies te vermijden op de verdamping en winkel bij kamertemperatuur 's nachts.
   2. Dag 0: Ontdooien het virale supernatant met Cas9. De recombinante menselijke fibronectine fragment oplossing volledig van de beklede plaat vlak voor spinfection gecombineerd. Voeg 2 mL virale geconditioneerde medium met Cas9 aan de plaat en draai het bij 1300 x g gedurende 90 min bij 35 ° C. Dit helpt de virale deeltjes hechten aan de spinfected goed.
   3. Ondertussen rekenen de cellen die moeten worden getransduceerde en spin down 2 x 10⁶ cellen in een polypropyleen conische tube van 15 mL. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver vers voedingsbodems.
   4. Na spinfection, alle van de virale bovendrijvende vloeistof verwijderen uit de spinfected goed en gooi deze weg. Retrovirale deeltjes uit het supernatant zijn gekoppeld aan de onderkant van de spinfected goed. Daartoe moet u goed, de 2 x 10⁶ cellen geresuspendeerde in 2 mL zuiver medium uit de stap hierboven toevoegen.
   5. Draai de plaat weer bij 1300 x g kort (1-2 min) toereikend is om de cellen te settelen onderaan. Plaats de plaat terug in de incubator en laat 's nachts voor signaaltransductie met de spinfected virale deeltjes aangesloten op de put.
   6. Dag 1: Afhankelijk van de celdichtheid; toevoegen meer medium aan de getransduceerde cellen te vermijden van begroeiing.
   7. Dag 2: Aangezien de plasmide lolploeg-Cas9 een Blasticidin weerstand marker heeft, voeg Blasticidin bij een dosis van 10 µg/mL getransduceerde en untransduced (control) MOLM13 of muis MLL-AF9 leukemie cellen voor de selectie van Cas9 cellen uiten.
      Opmerking: Blasticidin selectie van de Cas9-getransduceerde MOLM13 of MLL-AF9 leukemie cellen wordt als voltooid beschouwd wanneer alle untransduced controle cellen zijn afgeschaft. Voor cellijnen dan MOLM13 en MLL-AF9 leukemie, moet een dosis-responscurve worden uitgevoerd vóór dit experiment, zodat een optimale dosis kan worden ingezet. Titratie van het supernatans dat virale kan ook worden uitgevoerd in geval van laag-transductie tarieven.
3. Clone selectie van hoge-Cas9 waarin cellen.
   Opmerking: We hebben gemerkt dat in sommige AML cellijnen, kloon selectie niet noodzakelijk zitten macht: de bulk Cas9-Blasticidin geselecteerd bevolking reeds heeft hoogrenderende genoom-bewerken. In dit geval is het mogelijk om stap 1.3 overslaan en verdergaan met stap 1.4 te beoordelen van Cas9 expressie in de bulk Cas9-blasticidin AML cellen door het westelijke bevlekken. Het zou nog steeds belangrijk om bewerken van gene doeltreffendheid in die cellen (stap 1.5) van de bulk Cas9-AML alvorens tot het testen van de concurrentie te beoordelen. We vermoeden dat de selectie van klonen van één hoge-Cas9 de variabiliteit genoom-bewerken, die vooral van belang vermindert is bij het testen van een aantal verschillende één gids RNAs (sgRNAs).
   1. Een soort van de Cas9-Blasticidin gekozen MOLM13 en MLL-AF9 leukemie cellen voortaan genaamd MOLM13-Cas9 en MLL-AF9-Cas9 cellen, die respectievelijk met behulp van een FACS sorter opgenomen in een BSL2 goedgekeurd kap eencellige uitvoeren Sorteren kan worden uitgevoerd in 5-10 ronde onder niet-Weefselkweek behandeld 96 goed platen.
   2. Eenmaal enkele MOLM13-Cas9 en MLL-AF9-Cas9 klonen zijn gepickt en individueel genoemd, 10 – 20 klonen met 10 µg/mL Blasticidin in voedingsbodems voor de handhaving van Cas9 expressie uit te breiden.
4. Expressie controleren van stabiele Cas9 proteïne door immunoblotting.
   1. Maken van nucleaire extracten van alle klonen van de Blasticidin geselecteerd van MOLM13 en MLL-AF9 leukemie met behulp van nucleaire extractie Kit volgens protocol van de fabrikant. Controleer Cas9 eiwit expressie met behulp van Dizzee Rascal M2 antilichaam sinds de Cas9 in het plasmide lolploeg-Cas9 is gekoppeld aan een N-terminal vlag epitoop.
   2. Laden 50 µg totaal eiwit uit elk nucleaire uittreksel op 10% Bis-Tris gel en draaien van de gel op 120 V tot hogere banden zijn goed gescheiden.
   3. Het blokkeren van het membraan met 5%-oplossing van de melk in de buffer TBST gedurende 1 uur.
   4. Incubeer het membraan met 1:1,000 verdunning van Dizzee Rascal M2 antilichaam aan een eindconcentratie van 1 µg/mL bij 4 ° C's nachts.
   5. Volgende dag, het membraan met buffer TBST wassen en incubeer met HRP geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam bij een verdunning 1:5,000 (eindconcentratie van 0.16 µg/mL) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   6. Het membraan grondig met TBST wassen en de vlek met behulp van ECL substraat te ontwikkelen.
   7. Kies 3-4 klonen met de hoogste eiwituitdrukking van Cas9 zoals gezien door het westelijke bevlekken voor verdere functionele analyse (Figuur 1).
5. Zorgen voor hoge Cas9 activiteit in geselecteerde klonen
   1. Lentivirale supernatant van een sgRNA coderen vector bereid met sgRNAs gericht op de mens of muis AAVS1 veilige-haven locus zoals beschreven in stap 1.1.
   2. Transduce van de top MOLM13 Cas9-uiten of MLL-AF9 leukemie klonen met het anti-AAVS1 sgRNA-lentivirale-supernatant met behulp van de hierboven beschreven methode van spinfection. Selecteer met 2,5 µg Mo/mL Puromycin voor 4 dagen.
   3. Zuiveren genomic DNA van de MOLM13-Cas9 of MLL-AF9-Cas9 leukemie klonen na Puromycin selectie samen met de respectieve wild-type besturingselementen met de kit voor Genomic DNA-extractie volgens instructies van de fabrikant. Gebruik 50 ng van DNA als een sjabloon voor het uitvoeren van een PCR met de AAVS1_test_primers met 2 x master mix van Taq Polymerase en het programma van de PCR vermeld in tabel 1.
   4. Uitvoeren van het PCR-product op een 2% agarose gel en gel-zuiveren van de 268 basenpaar band met een gel-kit voor extractie volgens protocol van de fabrikant. Sanger volgorde de gel gezuiverd PCR product met behulp van de AAVS1_target-frag_F-primer.
   5. Beoordelen bewerken efficiëntie door de vergelijking van de AAVS1 bewerkt en wildtype sequenties met behulp van online web-gebaseerde tools (Figuur 2).

2. klonen en transductie van sgRNAs in cellen van de AML-Cas9

1. Medium-doorvoer klonen van sgRNAs
   1. Het ontwerp van 4 – 6 sgRNAs voor het gen van belang met behulp van een web-based CRISPR ontwerpsoftware. Er zijn een aantal tools voor het ontwerpen van CRISPR online beschikbaar, zoals http://crispr.mit.edu/ die sgRNA sequenties genereren op basis van een DNA-sequentie van input.
      1. Vul een juiste gegevens in de velden met een sterretje. Klik op het genoom van de doelgroep voor sgRNA ontwerp. De doel-volgorde plakken in het vak volgorde en klik op de verzendknop .
   2. Voor het klonen in de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA expressie plasmide, prepend de nucleotiden "CACC" aan de zin oligo en "AAAC" om de omgekeerde aangevuld antisense oligo alvorens te bestellen. Bestelling vooraf gemengd gevoel en anti-gevoel oligos in een 96-wells-plaat geëtiketteerd Oligo-Mix van een oligonucleotide synthese bedrijf.
      Opmerking: Hebben wij gebruik van de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmide, die de beperkingsplaats BbsI voor het klonen van de sgRNA heeft. In het geval dat andere sgRNA expressie plasmiden worden gebruikt, moeten de overhangen gebruikt voor de sgRNA oligonucleotides dienovereenkomstig worden gewijzigd.
   3. Neem een aparte U 96-Wells bodemplaat geëtiketteerd Gloeien plaat. Maken van een master mix van 1 µL T4 PNK, 1 µL van 10 x T4 DNA afbinding buffer en 6 µL water per reactie gloeien.
   4. 8 µL van de master mix toevoegen aan elk putje van de onthardende plaat. Voeg 1 µL van elke 100 µM, betekenis en antisense oligo (of 2 µL van gemengd gevoel-anti-sense oligos) aan de master mix. Pipetteer 2 tot 3 keer voorzichtig te mengen goed, draai de plaat kort om het mixen op de bodem van putten.
   5. Gebruik de volgende onthardende programma op de machine van een PCR: 30 minuten bij 37 ° C, 2 min 30 s bij 95 ° C gevolgd door langzame afkoeling tot 22 ° C naar rato van 0,1 ° C/s. Na het gloeien, neem een vers 96-wells-plaat geëtiketteerd Verdund OligoMix. In deze plaat, Verdun de gefosforyleerd en ontharde oligos uit de bovenstaande reactie met water (1:200) met behulp van een meerkanaalspipet.
   6. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - Digest 5 µg vector van de W met 1,5 µL van het restrictie-enzym BbsI (10.000 eenheden/mL) met behulp van een geschikte buffer bij 37 ° C gedurende 2 uur aan het linearize voor afbinding later.
   7. Neem een vers 96 goed plaat geëtiketteerd Afbinding plaat en toevoegen van 20 ng van de BbsI verteerd pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vector aan één putje per gewenste sgRNA afbinding. Daartoe, voeg 2 µL van gefosforyleerd, ontharde oligos van de plaat Verdund OligoMix .
   8. Voeg 1 µL van 10 x T4 ligase buffer en 1 µL van het T4 DNA Ligase-enzym. Pipetteer met een meerkanaalspipet en Incubeer de afbinding mix bij kamertemperatuur gedurende 2 uur zachtjes.
      Opmerking: Afbinding mixen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor de transformatie stap later.
   9. Ondertussen, dooi 90 µL van chemisch bevoegde E. coli cellen op ijs 10 minuten vóór het einde van de afbinding stap.
   10. Maak met een meerkanaalspipet 10 µL aliquots van de bevoegde cellen in elk putje van een afzonderlijke 96 goed plaat.
   11. Voeg het mengsel Afbinding van stap 2.1.8 in het putje met de bevoegde cellen, pipet op en neer zachtjes en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   12. Pipetteer 5 µL van de bacteriën-DNA mix rechtstreeks uit de bovenstaande reactie in een 6 goed plaat met LB-agar with 100 µg/mL ampicilline. Herhaal dit voor elk van de reacties van de transformatie.
   13. Elke reactie van de transformatie in een afzonderlijk etiket goed van een 6-well plaat plaat. Voeg ongeveer 5 – 8 glazen kralen aan elk goed en schud de gehele 6-well-plaat 8-10 keer in een cirkelvormige beweging.
   14. Kies 1 – 2 enkele kolonies van elk putje met een steriele 20 µL pipette uiteinde en strijk het in een zorgvuldig gelabelde spot op een steriele 10 cm petrischaal met LB agar en 100 mg/mL ampicilline. Na de strepen in de LB-plaat, uitwerpen gewoon de tip gebruikt voor kloon strepen in 3 mL LB-ampicilline met medium in een 14 mL ronde onderkant buis gemarkeerd met het bijbehorende nummer van de bacteriële kloon.
   15. Stuur de bacteriële plaat direct voor Sanger sequencing met de menselijke U6 promotor voorwaartse primer.
   16. Na de bevestiging van de opeenvolging van gekloonde sgRNAs, zuiveren het DNA uit de overeenkomstige 14 mL-buis met behulp van een mini prep kit volgens de instructies van de fabrikant.
   17. De concentratie en de kwaliteit van elk van de mini-preps meten met een spectrofotometer. Elke mini prep tot een concentratie van 15 ng/µL en Pipetteer in een 96 goed plaat geëtiketteerd sgRNA klonen plaatte normaliseren.
       Opmerking: Deze plaat kan worden opgeslagen bij-20 ° C of gebruikt direct voor virus voorbereiding.
2. Virale productie van sgRNA constructies en transductie
   1. Voor de productie van sgRNA lentivirale deeltjes in de 96-Wells-indeling, volg de "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput virale productie (96 goed)" protocol van de genetische Perturbation Platform (GPP web Portal) van het Instituut van de brede (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/Protocols).
   2. Breng 200 µL van virale supernatans steriele buizen en bevriezen bij-80 ° C onmiddellijk.
   3. Dag -1: Jas een platte Non-weefsel cultuur behandeld 96 goed bodemplaat met 100 µL van recombinante menselijke fibronectine fragment bij een concentratie van 10 µg/mL in een BSL2 kap voor de cultuur van de cel. Wikkel de plaat gebruiken om zelfklevende wrap laten overnachten bij Bank te voorkomen dat het verlies van de verdamping.
   4. Dag 0: Verwijder de recombinante menselijke fibronectine fragment uit elk putje. Het virale supernatant van elke sgRNA op kamertemperatuur ontdooien. 50 µL van virale supernatans uit elke buis toevoegen aan elk gecoat goed van de transductie plaat. Draai de plaat van de signaaltransductie bij 1300 x g gedurende 90 min bij 35 ° C.
   5. Tegen het einde van spinfection, MOLM13-Cas9 (kloon B3) cellen uit de kolf cultuur te tellen. 10.000 cellen per putje in 100 µL volume worden gebruikt. De cellen voor alle de signaaltransductie putjes, dood volume rekening houdend met tellen.
   6. Na de spinfection van 90 min, het supernatant van alle putjes met behulp van een meerkanaalspipet aangepast aan 50 µL langzaam door het kantelen van de plaat te verwijderen. Voeg 100 µL van de cultuur van MOLM13-Cas9 kloon B3 cellen aan elke goed langzaam glijdend van uit de velg.
   7. Draai de plaat bij 1300 x g gedurende 2 min bij 35 ° C te laten de cellen regelen op de bodem. De plaat overbrengen in de 37 ° C weefselkweek rang incubator.
   8. Dag 1: Voeg 100 µL van verse middellange tot elke goed met sgRNA getransduceerde Cas9-MOLM13 of Cas9-MLL-AF9 leukemie cellen zodanig dat de definitieve Mediuminhoud 200 µL.

3. concurrerende groei Assay

1. Dag 3: 72 h (dag 3) post signaaltransductie, controleren van het percentage van sgRNA BFP positieve cellen in elk putje bevattende stroom cytometry (FACS). Een cel levensvatbaarheid kleurstof gebruiken om te markeren en dode cellen uitsluiten van de analyse.
2. Blijven plating opnieuw een deel van de cellen in de nieuwe putten met verse medium na elke FACS analyse te voorkomen overmatige groei tijdens de test.
3. Herhaal de FACS analyse elke 2-3 dagen om te controleren van het relatieve aandeel van BFP positief (BFP + ve) cellen ten opzichte van de BFP negatieve (BFP-ve) tegenhangers (Figuur 3). Het percentage positieve cellen van de BFP voor elk punt van de tijd (met behulp van de FlowJo of soortgelijke FACS analysesoftware) analyseren.
   1. Sleep Fcs bestanden voor elk monster naar de FlowJo software. Tweevoudig tikken voort ieder een voorbeeldbestand en een dot vlek van voorwaartse spreiding (FSC) vs. kant (SSC) spreidingsdiagrammen met gegevenspunten verbonden FSC op X-as en WS op Y-as uitgezet. Poort van alle cellen.
   2. Tweevoudig tikken voort naar de gated cellen en plot ze op levensvatbaarheid vlek (op de Y-as) vs. FSC hoogte (H) of gebied (A) stip vlek. Poort de levensvatbaarheid vlek negatieve (live) cellen.
   3. Tweevoudig tikken voort gated levende cellen en plot BFP (op Y-as) vs. FSC (A) op X-as. Poort BFP + ve-cellen. Alle deze poorten van toepassing op alle monsters door het geselecteerde monster naar Alle monsters onder tabblad groep te slepen.
   4. Klik op Tabel Editor om een tabel van de analyse van alle monsters. Sleep van BFP + ve graaf van één monster naar de tabel en klik op de knop weergave in de Tabel Editor een batch-rapport van alle monsters maken met een tabel weergeven van het percentage van de BFP + ve -cellen. Sla de tabel als een xls.
4. Berekenen van de evenredige toename of afname % BFP positieve cellen binnen de bevolking van de levende cel na verloop van tijd en vergelijken deze verhouding aan de verhouding van BFP positieve cellen in de sgRNAs van de controle (zoals luciferase, vervormd of sgRNA van GFP).
5. Uitzetten van de verhouding van BFP positieve cellen voor de verschillende sgRNAs, met inbegrip van de gene(s) van belang, alsook de controles met behulp van dag 3 als de basislijn.

Resultaten

In onze studie transduced we eerst de MOLM13 menselijke AML cellijn die draagt de translocatie MLL-AF9 met hoge-titer virus codering van de Cas9-blasticidin lentivirale plasmide. In onze handen beschreven bulk ongesorteerde MOLM13-Cas9 cellen ging niet hoog niveau Cas9 expressie weergeven door het westelijke bevlekken en ook presteerde niet goed wanneer vehiculumcontrolegroep efficiënte gene bewerken-met behulp van de methode eerder⁷. Dus overgegaan we tot het stel...

Discussie

In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een concurrerende groei op basis van CRISPR-Cas9-assay voor het onderzoek naar de rol van kandidaat-genen in AML cellijnen stroom cytometry, waarbij in menselijk/RattenUitrustingen AML cellen (Figuur 5). Het doel van de test is het identificeren van het effect van verwijdering van het gen op onderhoud van AML celproliferatie meer dan twee tot drie weken op de schaal van een middellange-doorvoer. Sommige kritis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
FLAG-M2 Antibody	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Imaging System	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrifuge	Thermo Scientific
Blasticidin	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Red	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)	SAFC	12303C
single gRNA vector	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectin	Takara	T100B
Flow cytometer	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 DNA ligation buffer	NEBioLabs	B0202S
T4 DNA Ligase enzyme	NEBioLabs	M0202S
Ampicillin	Fisher scientific	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Broth	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant Murine M-CSF	Peprotech	315-02
Stable competent cells	NEBiolabs	C3040I
10 cm Tissue Culture dishes	Fisher Scientific	353003
Cell lysis solution	Qiagen	158906
Protein precipitation solution	Qiagen	158910
DNA hydration solution	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495949A
15 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495970C