Een studie van de Immunohistopathologic profileert de folaat Receptor Beta Macrophage en vasculaire immuun communicatie in gigantische cel Arteritis

Samenvatting

Het protocol illustreert het gebruik van histopathologische onderzoek en immunohistochemistry aan profiel de folaat receptor bèta macrophage en de relatie met de totale immuun cel in de temporele slagader biopsieën in gigantische cel arteritis infiltreren.

Samenvatting

Reuze cel arteritis (GCA) is een chronische immuun-gemedieerde ziekte van middelgrote tot grote formaat slagaders die oudere volwassenen treft. GCA manifesten met artritis en occlusieve symptomen van hoofdpijn, beroerte of visie van verlies. Macrofagen en lymfocyten van T-helper infiltreren de vasculaire muur en produceren van een pro-inflammatoire respons die leiden tot beschadiging van het schip en ischemie. Tot op heden is er geen GCA biomerker dat ziekte activiteit en gids therapeutische respons kan controleren.

Folaat receptor bèta (FRB) is een glycosylphosphatidylinositol eiwit dat is verankerd op celmembranen en normaal gesproken uitgedrukt in de bloedlijn MyeloMonocytaire en in de meeste myeloïde leukemie cellen zo goed zoals in de tumor en reumatoïde synoviale macrofagen, waar haar expressie correleert met de ernst van de ziekte. Het vermogen van FRB binden folaat verbindingen, foliumzuur-geconjugeerde en antifolate drugs heeft gemaakt een druggable doel in kanker en ontstekingsziekte onderzoek. Dit verslag beschrijft de methoden van het histopathologische en immunohistochemische gebruikt om te evalueren van de expressie en de verspreiding van FRB ten opzichte van GCAimmunopathology.

Formaline-vaste en paraffine-ingebedde temporele slagader Biopten van GCA en normale besturingselementen werden gekleurd met haematoxyline en eosine te herzien Weefsel histologie en Pathognomonisch omgaan. Immunohistochemistry werd gebruikt voor het detecteren van FRB CD68 en CD3 expressie. Een microscopische analyse werd uitgevoerd om te kwantificeren van het aantal positief gekleurde cellen op 10 geselecteerde hoog-power-veldsecties en hun respectieve plaatsen in de arteriële muur.

Lymphohistiocytic (LH) ontsteking gepaard met intima hyperplasie en verstoorde elastische lamina werd gezien in de GCA met geen gevonden in besturingselementen. De LH infiltreren bestond uit ongeveer 60% lymfocyten en 40% macrofagen. FRB expressie was beperkt tot macrofagen, bestaande uit 31% van de totale CD68 + macrofaag bevolking en gelokaliseerd aan de media en de adventitia. Geen FRB werd gezien in besturingselementen.

Dit protocol blijk gegeven van een afzonderlijke numerieke en ruimtelijke patroon van de macrofaag FRB ten opzichte van de vasculaire immuun communicatie in GCA.

Inleiding

Reuze cel arteritis (GCA) is een ontstekingsziekte van middelgrote tot grote slagaders, gericht op de aorta en haar bijkantoren en beïnvloeden van oudere volwassenen. Het presenteert met een milde tot ernstige ischemische complicaties, zoals hoofdpijn, kaak pijn, verlies van de visie, beroerte en weefsel gangreen. De diagnose wordt bevestigd door hoge inflammatoire merkers zoals bezinkingssnelheid (ESR) en een aparte histopathologische patroon op de temporele slagader biopsie (tabblad)¹. GCA is de meest voorkomende volwassen vasculitis, en de toegankelijkheid van de temporele slagader verkregen voor diagnose presenteert een voordeel ten opzichte van andere vasculopathies, waardoor een te bestuderen zijn pathogenese gemakkelijker. De typische bevindingen op tabblad omvatten een infiltreren van macrofagen/histiocytes en T-lymfocyten aangetroffen in alle vasculaire lagen van de tunica intima, media en adventitia met gelijktijdige vernietiging van de elastische lamina die normaal deze scheidt compartimenten². Het huidige bewijs toont aan dat de GCA impliceert een onbekende antigeen dat dendritische cellen in de vasculaire adventitia activeert, gevolgd door de indienstneming van helper (Th) T cellen, specifiek Th1 en Th17 subtypen die afscheiden van Interleukine-17 en interferon-gamma (IFG) respectievelijk. IFG dan werft en activeert de macrofagen voor de productie van cytokines en proteasen. Deze omvatten pro-inflammatoire cytokines; met inbegrip van IL-12, die samengebouwd activeert Th1 cellen waardoor een positieve feedback loop; Tumornecrosefactor en Interleukine-6, met als gevolg van artritis en koortsen en metalloproteinasen die schade de elastische lamina. Glucocorticoïden (GC), die de standaard chronische therapie vormen, bepalen gedeeltelijk de cytokine trajecten door verzachtende de Th17/IL-17 maar niet de Th1/IFG-arm van de immuunrespons^3,4. Helaas, stopzetting van GC resulteert in ziekte herval. Als een alternatieve modaliteit, methotrexaat heeft geweest voorzien voor GCA behandeling, maar de gewenste klinische eindpunten waren niet consequent bereikt hoewel gevoeliger biomarkers niet voor therapeutische toezicht^{5,6 gebruikt hebben} . In 2017, werd de Interleukine 6 blocker, tocilizumab, goedgekeurd voor de behandeling van de GCA zoals effectief blijkt ziektebestrijding en steroïde sparend effecten^7,8.

Tot op heden zijn er geen goede biomarkers voor GCA. Dientengevolge, kan het moeilijk zijn om te controleren van de activiteit van de ziekte en titreer doses van beschikbare drugs voorkoming van negatieve effecten te verminderen van de last van de kosten voor de samenleving. Het is dus absoluut noodzakelijk om te zoeken naar een biomarker van de kandidaat-lidstaten dat correlaten met ziekte-activiteit, nieuwe inzichten over de pathogenese en therapeutische besluiten steun verstrekken.

De disregulatie van macrofaag activering is een cruciale factor in de pathogenese van de GCA. Dus, een effectieve middelen voor de behandeling van de GCA kan worden de selectieve doelgerichtheid van geactiveerde macrofagen. De folaat receptor beta (FRB) is een glycosyl-phosphatidylinositol glycoproteïne die is verankerd op de celmembraan uitgedrukt in normale MyeloMonocytaire cellen, myeloïde leukemie cellen en macrofagen geactiveerd. De ligand, foliumzuur, is een essentieel vitamine in zijn gereduceerde vorm, waarmee cellulaire DNA synthese, methylation en reparatie⁹. FRB expressie wordt in auto-immune ziekte en tijdens carcinogenese geïnduceerd. Haar expressie is beperkt tot het oppervlak van de monocyten of pro-inflammatoire M1 macrofagen bij reumatoïde artritis, of anti-inflammatoire M2 macrofagen in solide orgel en myeloïde maligniteiten^{10,11,12 , 13}. Naast zijn potentiële rol als een biomarker van geactiveerde macrofagen, de FRB selectieve drug vervoer door middel van een multi stap proces dat met de receptor binden aan foliumzuur, antifolates of folaat-geconjugeerde drugs bij de cel begint kunt inschakelen oppervlakte, gevolgd door internalisering, de introductie en de uiteindelijke levering van gewenste drug aan de interne cel machines^12,14,15,16. In tegenstelling tot FRB uitgedrukt in kankercellen en macrofagen geactiveerd, uitgedrukt in normale hematopoietische cellen FRB is niet in staat om te folates, waardoor ervoor wordt gezorgd dat FRB/folaat-gemedieerde drug delivery beperkt tot FRB-positieve inflammatoire of kankercellen is binden.

In onze eerdere studie, we laten zien voor de eerste keer dat FRB wordt uitgedrukt in GCA macrofagen en haar expressie gecorreleerd met CD68 + en endothelin receptor bèta macrofagen, die tot de GCA pathogenese^{17 bijdragen}. In dit verslag, beschrijven we de histopathologische immunohistochemische methoden gebruikt voor het beoordelen van de FRB macrophage en de totale lymfocyt geanalyseerd en macrofaag telt om inzicht in de de FRB positie in het GCA vasculaire landschap.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven zijn door de Penn State institutionele Review Board goedgekeurd.

1. histopathologisch voorbereiding en verwerking na het verkrijgen van de temporele slagader biopsie

Opmerking: De temporele slagader biopsie (TAB) wordt uitgevoerd onder plaatselijke verdoving en steriele omstandigheden door een gecertificeerde chirurg. Na het chirurgisch verkrijgen een arteriële sectie van 3 cm aan de meer aangedane zijde, het model is vastgesteld in formaline onmiddellijk gedurende 24 uur, verdeeld in 3 tot 4 mm secties, en ingebed in paraffine, zorgvuldig aandacht te besteden aan de juiste uitlijning van weefsel in het blok dat wordt vervolgens opgeslagen op kamertemperatuur. Model selectie wordt uitgevoerd na het verifiëren van de medische dossiers. De diagnose is gebaseerd op de American College of Reumatologie 1990 criteria die vereist dat onderwerpen voldoen aan 3 van de 5 domeinen: leeftijd > 50 jaar nieuwe hoofdpijn, temporele slagader tederheid, een bezinkingssnelheid van > 50 mm/uur door Westergren methode en een abnormale TAB. Voor de veiligheid, beschermende handschoenen moeten worden gedragen te allen tijde bij de behandeling van de monsters, chemicaliën en antilichamen.

1. Snijd van de ingesloten blokken, 4-5 µm dik secties gebruikend microtome. en vlek met haematoxyline en eosine (H & E). Gebruik een sectie van de controle van geselecteerde normale weefsel voor kwaliteitsborging.
2. Float gesneden secties op een warm waterbad verwarmd tot 40 ° C rimpels te verwijderen en ophalen met een gecoate microscopische glasplaatje.  Plaats het glas dia's op een warme plaat in een oven van 60 ° C gedurende 60 minuten drogen en hechting van de sectie naar de dia te vergemakkelijken.
3. Plaats het glas dia's op een warme plaat in een oven van 60 ° C gedurende 60 minuten drogen en hechting van de sectie naar de dia te vergemakkelijken.
4. 3 secties op Microscoop-dia's koppelen.
5. Dia's in een verticale rack en droge overnachting bij 37 ° C gedurende 24 uur plaats.
6. Plaatsen van dia's in een container en bewaren bij 4 ° C.

2. immunohistochemische voorbereiding, Wasuitsmeltovens, antigeen ophalen en kleuring^15,18,19,20

1. Dia's in een rack dia laden. Het rek door gerechten als volgt uitgevoerd: tweemaal in 100% xyleen gedurende 5 minuten met 10 seconden van zachte agitatie elke 30 seconden, eenmaal in 100% ethanol met 10 seconden agitatie, eenmaal in de 90% ethanol met 10 seconden agitatie, eenmaal in 70% ethanol met 10 seconden agitatie , en tweemaal in dubbel gedestilleerd H2O met 10 seconden agitatie.
   Opmerking: Behandeling van xyleen en aceton moet gebeuren in geventileerde afzuigkappen inademing en respiratoire toxiciteit te voorkomen.
2. Ophalen van het antigeen door de overdracht van het rek in een glazen fles met 200 mL 10 mmol/L, pH 6.0 citraat buffer voorverwarmde tot 95 ° C. Instellen van de timer voor 30 minuten in het waterbad, dan koel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten dan spoelen met stromend water gedurende 5 minuten.
3. Endogene peroxidase activiteit verwijderen door het broeden in 200 mL waterstofperoxide 3% gedurende 10 minuten. Wassen dia's 3 keer in 200 µL van Tris-gebufferde zoutoplossing (TBSS).
4. De dia's te verwijderen uit het rek en schar elkaar om voorzichtig af te vegen van overtollige buffer. Voor vlekken, voeg 200 µL van de volgende primaire antilichamen, cover slips op dia's toevoegen en Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer:
   Anti-FRB antilichaam verdund 1:800
   Monoclonal muis anti-menselijke CD68, 1:200 verdunning
   Polyclonal konijn anti-CD3 1:100 verdunning
   Opmerking: Formaline-vaste paraffine-ingebedde secties van placenta waren ook verwerkt zoals beschreven in stappen 2.1 2.9 en bebroede met anti-FRB18 en gebruikt als positieve controle. Kleuring resultaten werden verkregen door het vinden van de optimale antilichaam concentratie en werd uitgevoerd door het titrating van het antilichaam in dubbele verdunningen (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
5. Verwijder de cover slip na incubatie en negeren. Spoelen van de dia's 3 keer voor elke 2 minuten met TBSS, afvoer en veeg overtollige buffer.
6. Voeg 200 µL van secundair antilichaam oplossing met biotinyleerd Anti-Rabbit/muis secundair antilichaam om te reageren met unconjugated primair antilichaam gebonden aan weefsel antigeen. Coverslips plaats op de dia's en incubeer in een vochtige kamer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
7. Verwijder de cover slip na incubatie en negeren. Spoelen van de dia's 3 keer voor elke 2 minuten met TBS, afvoer en veeg overtollige buffer.
8. Voeg 200 µL van diaminobenzidine (DAB) + substraat buffer (imidazol HCl)-chromogeen systeem en incubeer gedurende 10 minuten bij het visualiseren kleuring patroon. Wassen met TBSS dan in stromend kraantjeswater voor 10 minuten.
9. Counterstain met haematoxyline gedurende 3 minuten.
10. Monteer de dia's door 70 µL van montage medium toe te passen op het oppervlak van de dia. Langzaam tip het dekglaasje aan op de montage-medium en voorkomen dat er bubbels als u het vastklikt verlaagt. Wacht 24 uur om te drogen.

3. histopathologische en analyse van Immunohistochemical (IHC)

De H & E en IHC gekleurd secties van de GCA positieve en normale onderwerpen met behulp van een lichte microscoop onderzocht.

1. Voor de H & E gekleurd secties:
   1. Beoordelen van de vasculaire architectuur en identificeren van endotheliale cellen in de tunica intima, zachte spiercellen in de tunica media, en de fibroblasten en vasa vasorum in de tunica adventitia^21,22.
   2. Omgaan met functies van de GCA, waaronder lymfocyt en macrofaag/histiocyte infiltratie, cellulaire hyperplasie en interne elastische lamina afbraak.
   3. Analyseer de lymphohistiocytic infiltreren door het identificeren en kwantificeren van het aantal macrofagen ten opzichte van de lymfocyten. Beoordelen in welke mate van verstoring van de interne elastische lamina en hyperplastische veranderingen in resident cellen en vergelijk met besturingselementen.
2. Voor de IHC gekleurd secties:
   1. Onderzoeken van de kleuring patroon van FRB, neemt nota van de expressie van een bepaald type of soorten cellen en de spreiding in de vasculaire lagen en haar relatie tot de totale immuun infiltreren, de totale macrofaag-marker, anti-CD68 en de pan lymfocyt marker anti-CD3.
   2. Kwantificeren van de expressie van FRB CD68 en CD3 cellen door het tellen van de positief gekleurde cellen op 10 meerdere willekeurig geselecteerde hoogvermogen velden (hpf) en opnemen van de middelen.
      Opmerking: Identificatie van deze normale en pathologische cellen en structuren werden uitgevoerd door een gecertificeerde cardiovasculaire patholoog (JM) en reumatoloog (SAO) en de resultaten werden geregistreerd voor alle gevallen.
   3. Representatieve opnamen met behulp van een digitale camera.
      Opmerking: Na deze stappen, kan resterende aliquots worden opgeslagen bij-80 ° C.

Resultaten

Histopathologische bevindingen

De H & E vlekken in normale exemplaren aangetoonde normale arteriële anatomie met endotheliale cellen in de tunica intima, zachte spiercellen in de tunica media, en een heterogeen collageen-matrix die fibroblasten en feeder vaartuigen omvatten genoemd Wasa vasorum in de tunica adventitia. Er is geen inflammatoire infiltreren geïdentificeerd. GCA positieve temporele slagaders aanget...

Discussie

GCA is de meest voorkomende vasculitis bij volwassenen, en haar pathologische hallmark is een voorbeeld van een krachtige combinatie van T-helper-lymfocyten en macrofagen die kunnen ook worden gevonden in andere granulomateuze ziekten of vasculopathies zoals sarcoïdose geactiveerd en Granulomatous polyangiitis^2,3. GCA, de temporele slagader biedt een goede vertegenwoordiging van een middelgrote tot grote formaat slagader en de TA biopsie geeft een omvangrijke ste...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microtoom	Reichert-Jung
Gladde en mat microscoopglaasjes en dekglasjes	Fisher Scientific
Verticaal rek	Fisher Scientific
Lichtmicroscoop	Olympus BX60  microscoop
XYleen
Aceton in gedestilleerd water			concentraties 100%, 90%, 70%
Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% waterstofperoxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB)	Sigma Fast Tablet set
Chemisch Permount  montagemedium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylinen	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholische Stockoplossing	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM citroenzuurmonohydraat (pH 6,0)
Polyklonaal konijn anti-folaatreceptor bèta	Manohar Ratnam		geoptimaliseerd op 1:800
Monoklonaal muis anti-menselijk CD68	Dako	M071801	geoptimaliseerd op 1:200
Polyklonaal konijn anti-CD3	Agilent Dako	A0452	geoptimaliseerd op 1:100
Polymeer geit anti- konijn/muis secundair antilichaam	Dako
Placentaweefsel			voor FRB positieve controle