Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Summary

In dit protocol beschrijven we de complete workflow voor snelle isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijk bloed en karakterisering van specifieke markers door fluorescentie-gebaseerde analyse van het nanoparticle-tracking. De gepresenteerde resultaten geven een hoge graad van reproduceerbaarheid en kunnen worden aangepast aan de cel cultuur supernatant.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EVs), met inbegrip van exosomes, zijn gespecialiseerde membraanachtig nano-sized blaasjes gevonden in lichaamssappen die constitutively worden vrijgegeven uit vele celtypes en spelen een sleutelrol bij de regulering van cel-cel communicatie en een breed scala aan biologische processen. Veel verschillende methoden voor de karakterisering van het EVW zijn beschreven. Meeste van deze methoden hebben echter het nadeel dat de voorbereiding en de karakterisering van de monsters zeer tijdrovend zijn, of het is uiterst moeilijk te analyseren van specifieke markers van belang vanwege hun kleine omvang en als gevolg van het ontbreken van discrete populaties. Terwijl methoden voor analyse van het EVW zijn de afgelopen tien jaar aanzienlijk verbeterd, is er nog geen gestandaardiseerde methode voor karakterisering van één EVs. Hier tonen we een semi-geautomatiseerde methode voor karakterisering van één EVs door fluorescentie-gebaseerde analyse van het nanoparticle-tracking. Het protocol dat wordt gepresenteerd richt zich het gemeenschappelijk probleem van vele onderzoekers in dit veld en de volledige workflow voorziet in snelle Isolatievan EVs en karakterisering met PKH67, een algemene celmembraan linker, alsook met de specifieke oppervlakte markers dergelijke Als CD63, CD9, vimentin en lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (LAMP-1). De gepresenteerde resultaten blijkt een hoge mate van reproduceerbaarheid, zoals bevestigd door andere methoden, zoals het westelijke bevlekken. In de uitgevoerde experimenten, wij uitsluitend EVs geïsoleerd van menselijk serummonsters gebruikt, maar deze methode is ook geschikt voor plasma of andere lichaamsvloeistoffen en kan worden aangepast voor de karakterisering van het EVW van cel cultuur supernatant. Ongeacht de toekomstige vooruitgang van het onderzoek over EV biologie biedt het protocol dat hier wordt gepresenteerd een snelle en betrouwbare methode voor snelle karakterisering van één EVs met specifieke markers.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EVs), met inbegrip van exosomes, zijn gespecialiseerde membraanachtig nano-sized blaasjes (20-150 nm) met bepaalde combinaties van lipiden, hechting en intercellulaire signalering molecules, evenals andere functionele cytosolische componenten zoals microRNA (miRNA) en mRNA en spelen een sleutelrol bij de regulering van cel-cel communicatie^1,2. EVW worden vrijgegeven in hun omgeving van vele verschillende soorten cellen, bijvoorbeeld endotheliale cellen, immune cellen en tumorcellen, en kunnen worden opgespoord in lichaamsvloeistoffen, zoals sperma serum, urine, moedermelk, speeksel of cerebrospinale vloeistof^{3, 4}. vergroting nummers van studies wijzen op de bijdrage van de diversiteit van het EVW als mogelijke biomarkers voor vroegtijdige diagnose van verschillende ziekten en/of voorspelling van^5,6van de progressie van de ziekte. Exosomes worden vaak beschreven door de aanwezigheid van moleculen die ze zijn specifiek gekoppeld, ongeacht het celtype dat zij afkomstig zijn van⁷. Bijvoorbeeld exosomes bevatten verschillende tetraspanins (CD9, CD63, CD81), major histocompatibility complex klasse ik (MHC ik) moleculen, verschillende transmembraan eiwitten, typische cytosolische eiwitten (tubuline en actine), moleculen die betrokken zijn bij multivesicular lichaam () MVB) biogenese (TSG101 en alix), heat shock-eiwitten (HSP 70 en HSP 90) en eiwitten die deel van uitmaken signaal transductie (eiwit kinases)⁸.

Veel verschillende methoden zijn beschreven voor de karakterisatie van EVs⁹. De meest voorkomende en meest voorkomende methoden voor analyse van de EV zijn stroom cytometry¹⁰, scanning elektronen microscopie (SEM) en Transmissie Electronenmicroscopie (TEM)¹¹. Het gevaar en gebruikte methode voor de Biochemische karakterisering van EV inhoud is Western blotting^12,,¹³. Terwijl SEM en TEM voor de detectie van het EVW in de grootte van het hele spectrum voldoende, is de zeer beperkte identificatie van specifieke oppervlakte-eiwitten een bijzonder nadeel van deze methoden. In tegenstelling, stroom cytometry is een krachtig hulpmiddel voor de identificatie van specifieke EV oppervlakte markers, maar de drempel van deze methode beperkt de EVs analyse met een groter zijn dan 500 nm. Vandaar, analyse van geïsoleerde EVs met opsporing van specifieke oppervlakte markers is momenteel niet toegankelijk zijn via een van deze drie gevestigde methoden. We beschreven eerder een andere zeer gevoelige methode voor visualisatie en analyse van het EVW, nanoparticle-tracking analyse (NTA),¹⁴. Kortom, deze methode combineert twee verschillende fysische principes. Deeltjes strooi eerst licht wanneer ze worden bestraald met een laserstraal, en het tweede principe, bekend als de Brownse beweging, impliceert dat de verspreiding van verschillende deeltjes in een vloeibare suspensie omgekeerd evenredig is met hun grootte is. De semi-automatische bureaublad nanoparticle analyse-instrument voor vloeibare monsters bestaat van de particle volgen analyzer met een software-gebaseerde analyse, waar digitale beelden van het verstrooide licht van één deeltjes zijn opgenomen. De deeltjes en de beweging van de deeltjes worden gedetecteerd door een Microscoop verstrooiing laser met een videocamera. De laserstraal is verticaal georiënteerd hoewel de optische as horizontaal en geconcentreerd in het kanaal van de cel gevuld met het monster. De gegevens van de percelen van verspreide lichte plekken en hun snelheid van de beweging kunnen de bepaling van de totale deeltje graaf en grootte distributie. Na bestraling van de laser, de deeltjes verspreiden het licht, dat is opgenomen door een digitale videocamera via de Microscoop¹⁴. De vooruitgang aan onze voormalige methode is het inbrengen van een 500 nm lange golf-pass (LWP) licht-donkerscheiding filter tussen de laser (golflengte van 488 nm) en het kanaal van de cel, waardoor de directe analyse van fluorescentie-geëtiketteerden deeltjes (Figuur 1). Onze protocol adressen de gemeenschappelijke vraag van vele onderzoekers op dit gebied voor een snelle karakterisering van één EVs, bijvoorbeeld volgens hun ouderlijke oorsprong. In dit protocol beschrijven we de complete workflow voor snelle isolatie van het EVW uit menselijk bloed en snelle karakterisering van specifieke markers door fluorescentie-gebaseerde analyse van het bijhouden van nanodeeltjes. EVW kunnen worden gedetecteerd door de kleuring met PKH67, een algemene celmembraan linker, alsook met de specifieke exosomal markeringen, bijvoorbeeld CD63, CD9 en vimentin. Ons protocol is ook geschikt voor EDTA en citrated plasma, evenals andere lichaamsvloeistoffen en cel cultuur supernatant.

Protocol

De institutionele ethische Raad van bestuur van de Universiteit van Düsseldorf heeft ingestemd met de experimenten in dit werk gepresenteerd (referentienummer: 3381).

1. EV los van menselijk bloed

1. EVs isoleren met exosome neerslag oplossing.
   1. Verzamelen van 2 mL van menselijk bloed in buizen (SST) serum-scheiden via Venapunctie en Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) totdat coagulatie is voltooid.
   2. Centrifugeer het SST bij 1700 x g gedurende 10 minuten op RT cellen scheiden van serum en breng een reactiebuis 1,5 mL 1 mL van het serum. Centrifugeer het platelet-rich plasma (PRP) bij 3000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C tot verwijderen van bloedplaatjes en 100 μl van de bloedplaatjes-armen plasma (PPP) overbrengen naar een nieuwe reactiebuis van 1,5 mL.
   3. Voeg 25 µL van exosome neerslag oplossing (4 delen PPP, 1 deel exosome neerslag oplossing) en vortex grondig. Incubeer het monster gedurende 30 minuten op het ijs. De buis rechtop houden en niet draaien of meng de buis tijdens de incubatieperiode.
   4. Centrifugeer het monster bij 1.500 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C tot de EVs pellet. Na centrifugeren verschijnen de EVs als een beige of wit pellet aan de onderkant van het schip. De bovendrijvende substantie gecombineerd en Centrifugeer het monster bij 1.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
   5. Verwijder alle sporen van vocht en resuspendeer de pellet in 100 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door vaak pipetteren omhoog en omlaag. Bewaar de opschorting van de EV-80 ° c wanneer analyse niet onmiddellijk wordt uitgevoerd.
      Opmerking: Wanneer isoleren EVs uit plasma, fibrinogeen en fibrine kunnen belemmeren efficiënt herstel en resuspensie is zwaarder en kost meer tijd.
2. EVs isoleren met ultracentrifugatie.
   1. Neem de vooraf gekoelde rotor (TLA-55 vaste-hoek) uit de koelkast en koel neer de ultracentrifuge vóór gebruik.
   2. 1,25 mL voor PPP (bereid in stap 1.1) overbrengen in een tube ultracentrifugatie geschikt 1,5 mL met dop en Centrifugeer het monster bij 110.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 ° C. Zorg ervoor dat de lading van de rotor is evenwichtig voordat u begint.
   3. De bovendrijvende vloeistof decanteren en plaats buis ondersteboven op een papieren handdoek voor 2 min. resuspendeer de pellet in 500 μL van PBS en Centrifugeer het monster bij 110.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 ° C.
   4. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 μl van PBS.
      Opmerking: Gebruik alleen de rotoren en accessoires zijn ontworpen voor de ultracentrifuge dat in gebruik is. Het testen van de buizen in de rotor met behulp van water, omdat de sterkte van de buizen tussen veel variëren kan.

2. kleuring van de monsters

1. Vlekken van monsters met PKH67.
   1. Voorbereiden van de kleurstofoplossing door toevoeging van 1 μL van de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing aan 50 μl van verdunningsmiddel C (meegeleverd in de kit) in een 1,5 mL reactiebuis en meng grondig.
   2. 10 μL van de kleurstofoplossing overbrengen 20 μL van de opschorting van de EV (bereid in stap 1.1) om de reactiebuis, meng en incubeer gedurende 5 min op RT in het donker.
   3. Verdun 50 μl van de gekleurde EV ophanging met 2,5 mL gedistilleerd water in een reactie tube van 15 mL, meng en gebruiken deze definitieve opschorting voor meting van de deeltjes.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het gebruik van water als oplosmiddel voor de EV schorsing, omdat andere verdunningsmiddelen (bijvoorbeeld PBS) kunnen afbreuk doen aan de meting. Met behulp van opgeslagen EV-schorsing, ontdooien van de monsters op ijs en meng zorgvuldig voordat kleuring.
2. Vlek monsters met specifieke antilichamen.
   1. Verdun 10-20 μL van de opschorting van de EV (bereid in stap 1.1) met 50 μl van gedistilleerd water in een 1,5 mL reactiebuis en meng grondig.
   2. 2,5-5 μl van het specifieke antilichaam (tabel 1) toevoegen aan de reactiebuis, meng en incubeer gedurende 30 min op RT in het donker.
   3. 50 μl van de gekleurde EV schorsing overbrengen in 2.5-10 mL gedestilleerd water (tabel 1) in een reactie tube van 15 mL, meng en gebruiken deze definitieve opschorting voor meting van de deeltjes.
      Opmerking: In bepaalde omstandigheden moet de concentratie van het gebruikte antilichaam worden aangepast (tabel 1).

3. de verwerking van de monsters

Opmerking: De fundamenten van deze methode werden uitgebreid beschreven eerder en onder het protocol is gericht op de specifieke stappen die nodig zijn voor de analyse van de fluorescentie-geëtiketteerden EVs¹⁴.

1. De procedure opstarten uitvoeren.
   1. Duw de fluorescentie filter in de optische weglengte van de Microscoop en een camera. Start het programma en volg de instructies op het scherm voor geautomatiseerde uitvoering.
   2. Selecteer de juiste celaantal (Z158_C1149_Fluor) op het tabblad 'Cel controleren' (cel definitie) voor fluorescentie-meting. Selecteer de positie van de referentie voor de optica om ervoor te zorgen dat de laser en Microscoop zijn in een gemeenschappelijke focus (laser en Microscoop verplaatsen naar deze positie automatisch).
   3. Het kanaal van de cel met een spuit gevuld met 10 mL gedestilleerd water spoelen. Ervoor zorgen dat de meting cel vrij van luchtbellen en doen niet injecteren luchtbellen in het systeem.
   4. Maak een suspensie van de kalibratie met uniforme 200 nm en kleinbedrijf fluorescentie-gelabelde polystyreen deeltjes die carboxylaat groepen op hun oppervlak hebben. Verdun 10 μL van de deeltjes met 990 μL gedistilleerd water. Dan Verdun 10 μL van de oplossing van dit deeltje in een tube van 15 mL met 10 mL gedestilleerd water te verkrijgen van de vereiste concentratie.
   5. Injecteren van 2.5 mL van de oplossing van verdunde deeltje in het kanaal van de cel en klik op "Optimaliseren focus" aanpassen van de camera.
2. Meten van het monster.
   1. Spoel de cel kanaal meerdere keren met een spuit gevuld met 10 mL gedestilleerd water vóór elke meting van het monster. Injecteren de gebeitst EV schorsing (bereid in stap 2) in het kanaal van de cel.
   2. Stel de volgende parameters van de belangrijkste camera in het tabblad 'Cel controleren' in de software als nodig (tabel 2). Gebruik de referentie positie of de positie van 0.41193 om het aanpassen van de parameters.
      1. Voor gevoeligheid, de optimale gevoeligheidsbereik te vinden door te klikken op de knop "Aantal deeltjes vs. gevoeligheid" weer te geven van een curve gemeten deeltjes per scherm voor verschillende gevoeligheidsniveaus.
         Opmerking:
      2. Aanpassen voor de sluitertijd, de periode waarmee de camera licht te geven voor een bepaald interval.
      3. Na overname parameters, kies een minimale helderheid van 20, een minimale grootte van 20 nm, en een maximale grootte van 500 nm voor meting.
   3. Opmerking het aantal gedetecteerde deeltjes geteld in het gezichtsveld van het display. De verstrooiing bar moet worden in het groen naar oranje bereik (50-300 deeltjes). Als de verstrooiing bar rood is, de scatter zal smelten individuele deeltjes en ze worden geteld als één enkel deeltje, waardoor onjuiste resultaten. In een dergelijk geval, verder verdunnen het monster om te vermijden dat overlapping van de deeltjes of verlagen van de gevoeligheid.
   4. Klik op "Check deeltje drift bij 0 V" in het tabblad 'Cel controleren' voordat u begint de meting. Als de drift hoger dan 5 μm/s is, wacht totdat het monster niet meer stroomt om verder te gaan van de meting.
      Opmerking: Als de drift te hoog aan het begin van de meting is de herhaalde metingen kunnen verschillen en sophisticate van de resultaten. Als gevolg van de onderliggende beginselen van de NTA, kan een relevante drift gevolgen hebben in de vastberaden deeltjesgrootte, zoals berekend door de software.
   5. Klik op "Uitvoeren Video acquisitie" in de "Measurement" tab. Selecteer het aantal experimenten (3-5) en de tijdvertraging ertussen (0 min).
   6. Het aantal definiëren (individuele subvolume-) posities (11) en het aantal cycli (meting) (10) bij elke meting positie, waar de deeltjes moeten worden geanalyseerd
   7. Selecteer een map, maak een nieuwe bestandsnaam en klik op "OK" om de meting.

4. interpretatie van de resultaten

1. De resultaten en de parameters bekijken op het tabblad "Analyse" na de meting. De volgende parameters te controleren na de analyse voor het reinigen van het mobiele kanaal: gemiddeld aantal deeltjes per positie, totaal aantal getraceerde deeltjes en deeltje concentratie, de breedte van de verdeling van de deeltjes (x10, x50 en x90-waarden), waarde van gemiddelde en standaarddeviatie. Herhaal de meting van het monster indien nodig.
   Opmerking: De resultaten worden ook opgeslagen als een PDF- of .txt-bestand.
2. Klik op het tabblad "Analyse" om de grafiek berekend na de meting, waarin de verdeling van de gedetecteerde deeltjes door grootte weer te geven. Klik op "Display" in het tabblad "Analyse" en gebruik de pictogrammen aanpassen en de grafiek wijzigen voor specifieke vereisten.

5. bevestiging via EV detectie door het westelijke bevlekken

1. Los van de pellet van de EV (bereid in stap 1) in de lysis en extractie buffer RIPA, Pipetteer grondig en incubeer op ijs voor 30 min. Centrifuge het monster bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C om te verduidelijken de lysate en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.
2. Meet de totale proteïne door een Lowry eiwit assay kit. Verdun 1 μL van de geïsoleerde ophanging van de EV met 49 μL van de buffer RIPA en 5 μl in triplicates te gebruiken voor analyse. Verdun de vering van de EV met 2 laden x Laemmli buffer aan een definitieve concentratie van 2 µg/l en warmte gedurende 10 minuten bij 95 ° C.
3. Belasting 20 μg eiwit per putje. Scheiden en overdracht van de eiwitten door polyacrylamide gelelektroforese en tank bevlekken volgens standaardprotocollen.
4. Blokkeren van het membraan (0,2 micrometer Polyvinylideenfluoride difluoride) met boviene melkpoeder (5%) voor 1 h bij RT en Incubeer het membraan met specifieke primaire antilichamen (CD9, CD63 en vimentin) 's nachts bij 4 ° C.
   Opmerking: De primaire antilichamen worden gebruikt bij een verdunning 1:1,000.
5. Het membraan met TBST wassen 3 x 5 min en Incubeer het membraan met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam (1:20, 000 in TBST) gedurende 60 minuten op RT.
6. Het membraan met TBST wassen 3 x 5 min en de eiwitten opgespoord door Chemoluminescentie met een hoge gevoeligheid substraat oplossing op een imaging systeem.
   Opmerking: Omdat CD63 antigeen uitgebreid is en variabel geglycosyleerde, de moleculaire gewicht kan variëren, en banden tussen 40-65 kDa kunnen verschijnen.

Results

EVW werden geïsoleerd van volbloed en gekenmerkt door nanoparticle analyse met fluorescerende reagentia bijhouden. De optimale gevoeligheid voor het meten van onbevlekt deeltjes was vastgesteld op bereik op 70% tijdens onze experimenten. De fluorescerende kralen gebruikt voor aanpassing en kalibreren van de meting bleek dat een optimale instelling op een gevoeligheid van 85% (figuur 2A). Tussen een gevoeligheid van 70% en 90%, het aantal gedetecteerde deeltjes snel gestegen, terwijl het verder verhogen van de gevoeligheid kan leiden tot een verslechtering van de korrelgrootteverdeling waar het aantal deeltjes is opnieuw vallen. De instellingen van de camera een scherp beeld (figuur 2B) weergegeven en herhaalde metingen bleek lage standaard deviatie (figuur 2C). Voor zover, werd het protocol voor de verwerking van de monsters van het EVW aangepast, zodat alle metingen kunnen worden uitgevoerd met dezelfde instellingen (tabel 2). De breedte van de verdeling wordt bepaald door drie waarden op de x-as, de x10, x50 en x90. De x50, of de gemiddelde deeltjesgrootte is de diameter waartegen de helft van de bevolking onder deze waarde ligt. Ook geven de x10 en x90 de diameter waarop 10% en 90% van de gedetecteerde deeltjes onder de gerapporteerde grootte zijn. Kleuring met PKH67 cel linker kit, met inbegrip van een fluorescerende cel linker waarin een groen fluorescente kleurstof met lange alifatische staarten in lipide-regio's van de celmembraan, blijk gegeven van een sterke correlatie tussen de gevoeligheid en het aantal deeltjes gemeten (figuur 3A). PKH67 wordt vaak gebruikt voor de controle van de proliferatie, maar ook nuttig voor het toezicht op exosome of liposomen opname zo goed als voor in vivo cel mensenhandel is gebleken. Als gevolg van de niet-specifieke etikettering van PKH67, kan een grote verscheidenheid van het EVW worden gelabeld en gedetecteerd. Was de verdeling van de deeltjes in een bereik tussen 266 nm (x10) en 1946 nm (x90) met een piek op 857 nm (x50) en met een lage standaard deviatie tussen de metingen (28.1 nm). LAMP-1, ook wel bekend als lysosoom-geassocieerde membraan glycoproteïne 1, en CD107a bevinden zich voornamelijk over lysosomale membranen. Na kleuring met een Alexa Fluor 488 aangeduid als specifieke antilichaam tegen LAMP-1, de verdeling van de deeltjes varieert van 220 nm (x10) tot 1145 nm (x90) met een piek op 541 nm (x50) en een standaarddeviatie van 11,7 nm (figuur 3B). Voor de karakterisering van het EVW, we gebruikt Alexa Fluor 488 label antistoffen tegen de gemeenschappelijke exosomal markeringen en onze bevindingen bevestigd door het westelijke bevlekken. Na kleuring met Alexa Fluor 488-geëtiketteerden CD9-antilichaam, de verdeling van de deeltjes varieert van 251 nm (x10) tot 1139 nm (x90) met een piek op 548 nm en een tweede kleine piek op ongeveer 25 nm (figuur 4A). Kleuring met Alexa Fluor 488 label CD63 (figuur 4B) en vimentin (figuur 4C) leverde vergelijkbare resultaten. Western blotting analyse gemotiveerd onze positief voor antilichamen gebruikt hier. Herhaalde metingen bleek reproduceerbare resultaten voor alle antilichamen gebruikt in dit verslag. Als besturingselementen gekleurd we vesikel-gratis water met respectieve antilichamen (figuur 5A), waar de PKH67 en LAMP1 antilichamen vrijwel geen EV tot een gevoeligheid bijna 100% gevonden. Met behulp van het voorbeeld van vimentin, steeg hoge gevoeligheid het aantal nieuwe artefacten, zelfs wanneer het monster hoofdzakelijk vrij van deeltjes is. Als de meting wordt gestart wanneer de drift nog te hoog is (> 5 µm/s), de afzonderlijke herhalingen duidelijk afwijken onderling (figuur 5B). Aangezien vertegenwoordigd met drie verschillende antilichamen, is het cruciaal dat de drift zo minimaal mogelijk vóór het begin van de meting. Volgens onze ervaring, met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) als fluorescerende resultaten in metingen die niet nauwkeurig en reproduceerbaar omdat FITC is gevoelig voor snelle foto bleken (figuur 5C). Daarom raden we uitsluitend Alexa Fluor 488 label antilichamen voor de karakterisering van de EV. In dit protocol werden EVs geïsoleerd door een oplossing van polymeer gebaseerde exosome precipitatie met polyethyleenglycol. Om ervoor te zorgen dat onze resultaten niet worden vervalst door de isolatie van de toegepaste methode, gekenmerkt we EVs na isolatie met ultracentrifugatie. Aangezien vertegenwoordigd met PKH67 en twee verschillende antilichamen (CD63 en LAMP-1), zijn de resultaten van onze toegepaste isolatie met exosome neerslag oplossing (figuur 6A) vergelijkbaar met de EVs geïsoleerd via ultracentrifugatie (figuur 6B ). Helaas vanwege het slechte rendement van het EVW na ultracentrifugatie, de eerste reeks van serum voor isolatie moet worden duidelijk hoger in vergelijking met isolatie met exosome neerslag oplossing.

Figuur 1: schematische opzet van het bijhouden van de analyse nanoparticle. De Microscoop/video as en laser straal zijn oriëntatief orthogonaal met elkaar, oversteken bij de cel kanaal dwarsdoorsnede. Een fluorescentie-filter wordt geplaatst tussen het kanaal van de cel en de Microscoop. Lichtverstrooiing door de deeltjes wordt weergegeven in het venster "live-view" van de software. Na de overname, worden de resultaten weergegeven als een grootte distributie kromme coördinatensysteem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: kalibratie met fluorescentie label kralen. (A) het aantal deeltjes van de curve vs. de gevoeligheid wordt weergegeven de deeltjes in een positie op een gegeven moment in de tijd tijdens een scan van de automatische gevoeligheid. (B) visualisatie van deeltjes op het scherm van de live weergave. (C) deeltje grootte distributie na herhaalde metingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: vertegenwoordiger resultaten na kleuring met PKH67 en LAMP-1. Aantal deeltjes vs. gevoeligheid bocht (1), visualisatie van deeltjes op de live weergave scherm (2), en deeltjes grootteverdeling (3) na kleuring met PKH67 (A) en (B) LAMP-1. Een soortgelijke grootteverdeling van de deeltjes wordt waargenomen, terwijl wijzigingen in de gevoeligheid instellen van lood tot een soortgelijke, maar nog niet volledig identiek verandering van gevonden deeltjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: vertegenwoordiger resultaten na kleuring met Alexa Fluor 488 label CD9, CD63 en vimentin. Aantal deeltjes vs. gevoeligheid bocht (1), visualisatie van deeltjes op de live weergave scherm (2), korrelgrootteverdeling (3) en representatieve Western blots van twee verschillende EV suspensies (4) voor CD9 (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, B), en vimentin (54 kDa, C). Laat exemplaar van deeltje signalen langs de toenemende gevoeligheid (x-as) correlaten met lagere intensiteit van het signaal in de westelijke analyse, bevestigen de lagere bedrag van de respectieve deeltje oppervlakte markering (b.v., vimentin vs. van de vlek CD63). Opmerking de bijna identieke curven van representatieve metingen voor alle geanalyseerde markeerders geven hoge reproduceerbaarheid (3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: vertegenwoordiger resultaten voor gebruikte besturingselementen en mogelijke fouten bronnen. (A) Vesikel-gratis water gekleurd met PKH67 (1), LAMP-1 (2) en vimentin (3) als besturingselementen. (B) vertegenwoordiger deeltje grootte distributies na kleuring met LAMP-1 (1), CD63 (2), en CD9 (3), en metingen uitgevoerd wanneer opschorting drift nog te hoog is. (C) het aantal deeltjes van de curve vs. de gevoeligheid (1) en korrelgrootteverdeling (2) na kleuring met FITC-gelabelde CD63 antilichaam. Een duidelijke bleken effect wordt waargenomen na elke meting, resulterend in geleidelijk lagere deeltje nummers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: vergelijking van verschillende isolatie methoden voor EVs. Deeltjesgrootteverdeling van het EVW geïsoleerd met exosome neerslag oplossing (A) en (B) ultracentrifugatie na kleuring met PKH67 (1), LAMP-1 (2) en CD63 (3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

	LAMP-1	CD9	CD63	Vimentin
Antilichaam (µL)	5	2,5-5	2,5-5	5
EV schorsing (µL)	10	20	10	10
H2O (µL) voor de kleuring	50	50	50	50
Eindvolume (mL)	5-10	2,5-5	5	10

Tabel 1: Lijst van gebruikte antilichamen en verdunningsreeks van monsters.

Overname parameters
Gevoeligheid (%)	85
Sluitertijd	70
Min. helderheid	20
Max. Grootte (nm)	500
Min. grootte (nm)	20
Polariteit	Negatieve
Spanning	Uitschakelen
Deeltje drift bij 0 V (µm/s)	< 5
Posities	11
Cycli	10
Meerdere overnames	3-5
Vertraging (min)	0

Tabel 2: Overname parameters voor nanoparticle analyse bijhouden.

Discussion

We tonen een gedetailleerd protocol voor isolatie van EVs van volbloed en snelle karakterisering van specifieke oppervlakte markers met fluorescentie gebaseerde nanodeeltjes bijhouden van analyse. In de uitgevoerde experimenten, wij uitsluitend gebruikt EVs geïsoleerd uit het serummonsters, maar deze methode is ook geschikt voor ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en citrated plasma en kan ook worden uitgebreid tot andere lichaamsvloeistoffen zoals moedermelk, urine, speeksel, cerebrospinaal vocht en sperma. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de karakterisering van het EVW van cel cultuur supernatant. In dit protocol, de EV-schorsing werd geproduceerd van 100 μl van de serum met behulp van een exosome neerslag reagens, waarin een merkgebonden polymeer dat exosomes en EVs zachtjes te precipiteren volgens een corpusculaire grootte variërend van 30 nm tot 200 nm, waarbij 10-20 μL van het EVW zijn voor karakterisering van elk oppervlak markering benoemd. Helaas, de isolatie stap is onvermijdelijk, omdat de hoge hoeveelheid eiwitten in serummonsters (bijvoorbeeld albumine- en globuline) interfereert met het antilichaam kleuring procedure en in een hoog niveau van achtergrond en verfijnde bevindingen resulteert. Bovendien, gebaseerd op de biologische beschikbaarheid van de exosomes in de monsters, het bedrag van de werknemer EV schorsing, alsmede de verdunning vóór de verwerking moet worden aangepast voor andere grondstoffen. Om te vergelijken meerdere monsters, een gestandaardiseerde aanpak voor de verdunning van de monsters, alsook de consistente overname parameters (gevoeligheid, sluitertijd, etc.) is noodzakelijk. Een ander belangrijk punt is dat de metingen niet worden gestart, totdat de drift lage (in onze handen, < 5 μm/s is). Als de drift te hoog was, herhaalde metingen van de steekproef leverde hoge standaarddeviatie onderling, maar met een lage drift, de resulterende gegevens waren zeer consistente en een hoog niveau van reproduceerbaarheid bevestigd. Het is belangrijk dat de geselecteerde antilichamen een passende fluorescerende hebben. Antilichamen moeten worden vervoegd met Alexa Fluor 488, omdat FITC een hoge mate van foto-bleken heeft. Eventueel zal stabieler fluophores zeker leiden tot verhoogde assay stabiliteit in de toekomst. Normaal gesproken veel onderzoekers PBS gebruiken als een oplosmiddel voor EVs. Voor dit protocol is het cruciaal te gebruiken gedestilleerd water als een oplosmiddel voor de EV schorsingen. Wanneer de EVs zijn gelabeld met de fluorescerende kleurstoffen, de hoge osmolaliteit en ion concentratie van andere verdunningsmiddelen, zoals PBS, kan interfereren met de meting en leiden tot resultaten gewijzigd.

Terwijl methoden voor analyse van het EVW zijn de afgelopen tien jaar aanzienlijk verbeterd, is er nog geen gestandaardiseerde methode voor isolatie en karakterisatie van EVs. Het grote nadeel van stroom cytometry, waar EVs zijn vaak afhankelijk van kralen zodat een groter oppervlak, is dat veel EVs dok te zorgen voor een sterke en opspoorbaar signaal¹⁰oppervlak. SEM en TEM hebben het nadeel dat de bereiding van de monsters tijdrovend is en EVs kunnen alleen worden onderscheiden door hun grootte en morfologie¹¹. Tot op heden, het gevaar en de gebruikte methode voor kwalitatieve (dat wil zeggen, biochemische) is EV karakterisering westelijke bevlekken, waar eiwitten kunnen worden geanalyseerd met specifieke antilichamen^12,13. De nadelen van al deze methoden liggen echter in het onvermogen om te analyseren enkele EVs voor specifieke oppervlakte markers. Bovendien, de lange doorlooptijden en lange wassen/isolatie procedures gebruikt door veel van de huidige protocollen betrekken arbeidsintensief werk, waardoor ze niet geschikt voor veel monsters worden verwerkt en karakterisering van één EVs. Ons protocol voorziet in een complete workflow snel isolatie en karakterisatie van één EVs met specifieke oppervlakte markeringen zoals CD63, CD9, vimentin en CD107a, en kan worden uitgebreid voor een breed spectrum van andere oppervlakte markers om te bepalen van de oorsprong van vrijgegeven EVs. Vanwege een permanente technische vooruitgang van de NTA-apparaat bevestigd we onze bevindingen in samenwerking met de fabrikant met de nieuwste analyzer. Ongeacht de toekomstige vooruitgang van het onderzoek over EV biologie, met name wat betreft exosomes, zal het protocol dat wordt gepresenteerd hier een snelle en betrouwbare methode voor karakterisering van één EVs voorzien van specifieke markers. Omdat de samenvoeging van het EVW tijdens het isolement en de kleuring procedure is tot nu toe onvermijdelijke, moet toekomstig onderzoek richten op de ontwikkeling van methoden om te voorkomen van EV aggregatie en een nauwkeurige grootte bepaling van TL-geëtiketteerden EVs.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Serum-separation tube	BD	366882	BD Vacutainer
Ampuwa water	Fresenius Kabi	10060
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Sigma	56064C
Falcon tube, 15 mL	Greiner Bio One	188271
Falcon tube, 50 mL	Greiner Bio One	227270
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Speciality tubes for ultra centrifugation
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL	Beckman Coulter	357448
Polybeads Microspheres 0.2 µm	Polysciences, Inc.	7304	Alignment Solution
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm	Polysciences, Inc.	09834-10	Alignment Solution
Syringe, 2 mL	Braun	4606027V
Syringe, 10 mL	Braun	4606728V
Exoquick	SBI	EXOQ20A-1	EV precipitation solution
Laemmli Sample Buffer (2x)	BioRad	1610737
DC Protein Assay Kit II	BioRad	5000112	Lowry prtein assay
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH67GL-1KT	For general membrane labelling
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody	BioLegend	328609	Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1)
Human CD9-Alexa Fluor 488	R&D Systems	FAB1880G
Anti-CD9 Antibody	SBI	EXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	MA5-18149
FITC anti-human CD63 Antibody	BioLegend	353005
CD63. Antibody, polyclonal	SantaCruz	Sc-15363
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody	BioLegend	677809
Anti-Vimentin Antibody	SBI	EXOAB-VMTN-1
Goat anti mouse IgG + IgM	Jackson Immuno	315-035-048
Goat anti rabbit IgG	Dianova	111-035-003
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher	34094
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
Chemiluminescence Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600