Methodenartikel

Kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen als een standaard voor het valideren van de immunofluorescentietest voor het kwantificeren van Biomarker eiwitten in Routine weefselsteekproeven

DOI:

10.3791/58735

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven het gebruik van kwantitatieve immunoblotting te valideren immunofluorescentie histologie beeldanalyse wordt gekoppeld als een middel voor het kwantificeren van een proteïne van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE). Onze resultaten tonen aan dat het nut van immunofluorescentie histologie voor het vaststellen van de relatieve hoeveelheid biomerker eiwitten in routine biopsie monsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantificering van proteïnen van belang in formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van (FFPE) is belangrijk in de klinische en onderzoek toepassingen. Een optimale methode voor de kwantificering klopt, heeft een ruime lineaire dynamisch bereik en onderhoudt de structurele integriteit van het monster dat voor de identificatie van individuele celtypes. Huidige methoden zoals immunohistochemistry (IHC) en massaspectrometrie immunoblotting elk niet voldoen aan deze bepalingen als gevolg van hun categoriale aard of moeten het homogeniseren van het monster. Als een alternatieve methode, stellen wij voor het gebruik van Immunofluorescentie (IF) en beeldanalyse te bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in FFPE weefsels. Hierin aantonen we dat deze methode is eenvoudig geoptimaliseerd, een breed dynamisch bereik levert, en lineair kwantificeerbare ten opzichte van de gouden standaard van kwantitatieve immunoblotting. Bovendien, deze methode maakt het onderhoud van de structurele integriteit van het monster en zorgt voor het onderscheid van verschillende celtypes, die cruciaal zijn in diagnostische toepassingen kunnen zijn. Globaal, dit is een robuuste methodiek voor de relatieve kwantificering van eiwitten in FFPE monsters en kan gemakkelijk aangepast worden aan pak klinische of onderzoekbehoeften.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De noodzaak om te kwantificeren van eiwitten in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) biopsie weefselsteekproeven bestaat in veel klinische gebieden. Kwantificering van biomerker eiwitten in routine biopsie exemplaren wordt bijvoorbeeld gebruikt te verhelderen van prognose en behandeling van kanker patiënten1te informeren. Echter, huidige methoden zijn typisch subjectief en gebrek aan validatie.

Immunohistochemistry (IHC) wordt regelmatig gebruikt in laboratoria van de pathologie en over het algemeen hangt een primair antilichaam gericht op het doel-eiwit en een secundair antilichaam geconjugeerd met een enzymatische label zoals horseradish peroxidase2. Conventionele IHC is gevoelig, kan maken gebruik van minuut monsters en behoudt de morfologische integriteit van weefselmonsters zodoende beoordeling van eiwit expressie binnen zijn relevante histologische context mogelijk te maken. Echter, omdat het chromogenic signaal gegenereerd door IHC subtractieve, het lijdt aan een relatief smalle dynamisch bereik en biedt beperkte mogelijkheden voor multiplexing van2,3,4. Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI-MSI) behoudt morfologische integriteit. Echter deze ontwikkelende technologie wordt geassocieerd met bescheiden morfologische resolutie en vereist significante kalibratie en normalisatie, afbreuk te doen aan de haalbaarheid ervan voor klinische routinegebruik5,6,7. Alternatieve technieken te kwantificeren van eiwit in weefselsteekproeven omvatten immunoblotting8, massaspectrometrie9,10,11, en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, elke van die met een gehomogeniseerde begint lysate steekproef weefsel. Primaire weefselsteekproeven zijn heterogene in dat zij een veelheid van soorten cellen bevatten. Daarom, technieken die met zich meebrengen homogenisatie van de monsters niet toegestaan kwantificering van een proteïne in een bepaalde cel bevolking van belang zoals kankercellen.

Zoals IHC, indien van toepassing is op kleine FFPE monsters en het behoud van de integriteit van de histologische13vergunningen. Echter dankzij de additieve aard van fluorescentie signalen, als is vatbaar voor de toepassing van meerdere primaire antilichamen en fluorescerende etiketten. Dus, een proteïne van belang relatief kan worden gekwantificeerd in bepaalde cellen of cellulaire compartimenten (bijvoorbeeld kern versus cytoplasma) gedefinieerd met behulp van andere antistoffen. Fluorescentie signalen hebben ook het voordeel van een groter dynamisch bereik13,14. De superioriteit, de reproduceerbaarheid en de multiplexing potentieel van geweest als toegepast op de FFPE monsters aangetoonde13,14,15.

Hierin beschrijven we het gebruik van kwantitatieve immunoblotting met behulp van bestaande cellijnen als een gouden standaard om na te gaan van de kwantitatieve aard van als in combinatie met de computer-assisted beeldanalyse bij het bepalen van de relatieve overvloed aan een proteïne van belang in histologische secties van FFPE weefselmonsters. Wij hebben deze methode met succes in een multiplex aanpak te kwantificeren biomerker eiwitten in klinische biopsie monsters16,17,18toegepast.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goedkeuring voor het gebruik van primaire menselijk weefselmonsters was verkregen van de Gezondheidswetenschappen en de aangesloten Opleidingsziekenhuizen onderzoek Ethics Board (HSREB) aan de Queen's University.

1. opbouw van een cellijn weefsel Microarray (TMA)

  1. Oogst en wassen van de cellen.
    Opmerking: Dit protocol is getest op verschillende bestaande vereeuwigd cellijnen (bijvoorbeeld HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
    1. Voor Adherente cellen, oogsten ongeveer 1.3 x 107 cellen zodra zij ongeveer 80% confluentie bereiken. Loskoppelen van cellen met behulp van een reagens dat geschikt is voor die cellijn.
      Opmerking: Ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) is over het algemeen de voorkeur over trypsine om het risico van vernederende oppervlakte-eiwitten. Als trypsine, neutraliseren de trypsine met behulp van foetale runderserum (FBS) direct na het oogsten van de cellen.
    2. Voor schorsing cellen, oogsten ongeveer 8 x 107 cellen in log-fase van groei.
    3. De cellen geoogst/uitneembaar verzamelen door centrifugeren gedurende 5 minuten op 225 x g in een conische tube van 50 mL.
    4. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL, 1 X met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer gedurende 5 minuten op 225 x g en decanteren van de bovendrijvende substantie.
      Opmerking: 1 X PBS bestaat uit 137 mM NaCl 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 in gedistilleerd water; Breng de pH op 7.4.
  2. Bevestigen van de cellen in formaline- and -pellet hen.
    1. Suspendeer de pellet cel binnen de conische buis in 10 mL 10% neutraal gebufferde formaline (NBF).
      Opmerking: NBF kan bereid worden door verdunnen 1 mL van de stockoplossing 37% formaldehyde in 9 mL 1 X PBS.
      Let op: Wees voorzichtig met het hanteren van formaline en formaldehyde. Gebruik een zuurkast voor stappen waarbij formaline en formaldehyde.
    2. Incubeer de cellen op een rocker van 24 toeren per minuut bij kamertemperatuur 's nachts (ongeveer 17 h).
    3. Bereid een 1%-oplossing van lage smeltpunt agarose in PBS (0,01 g agarose per 1 mL PBS).
      1. Bereiden genoeg voor 500 µL van agarose oplossing per cel lijn monster.
      2. Los de agar in een 80 ° C water bad of warmte blok, onder af en toe omzwenken voor 2-5 min. Zodra ontbonden, bewaar deze oplossing in een 37 ° C water bad of warmte blok ter voorkoming van verharding.
    4. Pellet de vaste cellen uit stap 1.2.2 door centrifugeren gedurende 5 minuten op 225 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van 1 x PBS.
    5. Breng de cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en pellet door centrifugeren voor 5 min op 290 x g. Aspirate korting op alle van de bovendrijvende substantie.
  3. Gegoten cellen in agarose.
    1. Voeg ~ 500 µL van 1% agarose-oplossing (uit stap 1.2.3) aan elke buis met de cellen. Zachtjes, maar snel, Pipetteer mengsel op en neer met behulp van een P-1000 micropipet te mengen.
      Opmerking: Is afgesneden van het einde van het uiteinde van de pipet uit te breiden van het diafragma en vermijden van de vorming van luchtbellen. Houd de werkoplossing agarose in het waterbad 37 ° C ter voorkoming van verharding.
    2. Laat de agarose-cell oplossing te verharden (5-10 min) bij kamertemperatuur. Voeg 1 mL 10% NBF aan elke microcentrifuge buis waarin een monster en houden bij kamertemperatuur tot paraffine insluiten (maximaal 24 uur).
  4. Voorbereiden op de stekker van de agarose paraffine insluiten.
    1. Gecombineerd uit de NBF uit het monster.
    2. Verwijder de stekker van de cel met behulp van een scheermesje te snijden de microcentrifuge buis, de stekker in kunststof weefsel cassette plaatsen. Opslaan van cassettes in 10% NBF bij kamertemperatuur.
  5. Verwerken van de monsters overnachting ofwel handmatig of met behulp van een geautomatiseerde weefsel processor en inbedden in paraffine met behulp van standaard histologie methoden.
    Opmerking: Zie Fischer et al. 19 voor een voorbeeld-protocol.
  6. Met behulp van een gespecialiseerde "weefsel arrayer" instrument, oogst dubbele 0.6 mm kernen van de paraffine blokkeren elke cel-regel en voeg ze, in rijen, in een lege ontvangende paraffine blok te creëren een cellijn TMA.
    Opmerking: Standaard methoden moeten worden gebruikt zoals die welke beschreven in Fedor en De Marzo20.
  7. Nemen kernen van primaire monsters vertegenwoordigen 2-3 extra weefseltypes (HLA) (bijvoorbeeld tonsillen, dikke darm, testes, etc.) als positieve of negatieve controles in de TMA. Kies weefsels die geschikt voor de proteïne van belang zijn.
  8. Gebruik een microtoom te bereiden twee histologische secties, ongeveer 4-6 µm dik, voor de cellijn TMA. Monteren van de sectie op een dia histologie, drogen en deparaffinize (zoals beschreven in Fedor en De Marzo20).

2. monster met immunofluorescentie kleuring

  1. Optimaliseer de verdunning van primair antilichaam.
    Opmerking: Standaard protocollen bestaan voor de optimalisatie van IHC of als voor FFPE weefselsecties zoals in Kajimura et al. 21. een beknopt overzicht van de aanpak is hier geschetst.
    1. Maak 4-5 verdunningen van primaire antilichaam aan de proteïne van belang laten leiden door de instructies van de fabrikant.
    2. Identificatie van een type besturingselement weefsel van een dier of mens bron die uitdrukt van de proteïne van belang in morfologisch herkenbare cel populaties. Bereiden van secties van het weefsel en bevestig ze op een dia na standaard immunohistochemistry procedure zoals in Fedor en De Marzo20.
      Opmerking: Het aantal secties vereist is het aantal primaire antilichaam verdunningen plus één extra.
    3. Met behulp van een automatische of handmatige systeem voor immunohistology, testen de primair antilichaam verdunningen uit stap 2.1.1, elk op een dia uit stap 2.1.2. De toepassing van primair antilichaam van de extra dia weglaten en gebruiken als een negatieve controle.
    4. Tijdens de kleuring vlekken alle dia's met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) als een nucleaire counterstain en een fluorescently tagged secundair antilichaam. Als grotere gevoeligheid vereist is, gebruikt u een HRP (mierikswortelperoxidase)-geconjugeerd secundair antilichaam en systeem van de versterking van de tyramide gebaseerde signaal (Zie Stack et al. 13).
      Opmerking: Wanneer multiplexing primaire antilichamen, een verschillende TL label wordt gebruikt voor elk eiwit.
    5. Scannen van immunostained dia's met behulp van een passend instrument zijn geschikt voor het genereren van een digitaal beeld-bestand met behulp van excitatie en detectie golflengten worden de fluorophores die werden gebruikt.
    6. Juiste software gebruiken om te bekijken de digitale beelden en empirisch Kies het primaire antilichaam verdunning die signaalsterkte ten opzichte van de achtergrond fluorescentie optimaliseert.
      Opmerking: Indien gewenst, kan deze optimalisatie optreden met behulp van een HRP-geconjugeerde secundair antilichaam, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) en helderveld microscopie.
  2. Uitvoeren als op de cellijn TMA kleuring.
    1. Een automatische of handmatige systeem voor immunohistology gebruiken om een dia aan van de cellijn TMA met de geoptimaliseerde primair antilichaam verdunning (zoals bepaald in stap 2.1) vlek. De toepassing van primair antilichaam van de tweede dia weglaten en gebruiken als een negatieve controle.
    2. Tijdens de kleuring vlekken alle dia's met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) als een nucleaire counterstain, en met een secundair antilichaam en tyramide zoals in stap 2.1.4.
    3. Scannen van immunostained dia's met behulp van een passend instrument zijn geschikt voor het genereren van een digitaal beeld-bestand met behulp van excitatie en detectie golflengten worden de fluorophores die werden gebruikt.
    4. De softwarepakket van een beeld-analyse gebruiken voor het identificeren van de cellulaire compartiment van belang (dat wil zeggen, cytoplasma versus nucleus) en kwantificeren van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke regel van de cel.
      Opmerking: Verschillende softwarepakketten kunnen worden gebruikt voor dit doel en velen worden besproken in de Stack et al. 13.

3. kwantitatieve Immunoblotting van cellijnen

  1. Bereiden lysates van cellen.
    1. Oogst 2 miljoen cellen van elke regel van de cel, zoals beschreven in stappen 1.1.1 aan 1.1.3.
    2. Spin cellen naar beneden voor 5 min op 650 x g in een conische tube van 50 mL. Giet het supernatant.
    3. Cellen met 10 mL ijskoud PBS wassen. Resuspendeer in 1 mL ijskoud PBS en transfer naar een 1,5 mL microcentrifuge buis. Per stap 3.1.2 centrifugeren, decanteren en laat cellen op ijs.
    4. Ongeveer 200 µL van koude radioimmunoprecipitation (RIPA) lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors (10 µL van 100 X remmers per mL RIPA lysis-buffermengsel) toevoegen aan de cellen, vortex en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
      Nota: Het bedrag van lysis buffer nodig voor lysis van de effectieve varieert per cellijn en empirisch kan worden bepaald. De buffer RIPA is samengesteld uit de 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1.0 NP-40%, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS in gedestilleerd water.
    5. Om ervoor te zorgen zelfs relatief laden op de immunoblots, de totale proteïne in een 20 µL monster uit elke lysate met behulp van een geschikte methode zoals de analyse van Bradford te kwantificeren. Voeg ongeveer 40 µL van 6 X Laemmli lysis buffer naar de rest (ongeveer 180 µL) van elke cel lysate en koken bij 100 ° C in een warmte blok of water bad gedurende 5 minuten.
      Opmerking: 6 X Laemmli buffer bestaat uit 300 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (m/v) SDS, 60% glycerol, 0,6% (m/v) bromophenol blauw, 50 mM dithiothreitol (DTT) in gedestilleerd water.
    6. Het opslaan van de monsters bij-20 ° C voor maximaal twee weken.
  2. Het uitvoeren van een immunoblot van alle cellen regels om te bepalen welke cel regel heeft de overvloedigste proteïne van belang.
    Opmerking: De procedure beschreven in Mahmood, T. en Yang, PC. 22, met de volgende wijzigingen.
    1. Aliquot cel lysate (bereid in stap 3.1) met 10-50 µg eiwit (afhankelijk van de overvloed van de proteïne van belang) tot microcentrifuge buizen. Voeg 2.5 µL van 6 X Laemmli buffer en voldoende RIPA lysis-buffermengsel om het volume tot 15 µL.
    2. Een 5% stapelen en een geschikte concentratie oplossen (bijvoorbeeld10% voor eiwitten tussen 15-100 kDa) laden SDS-pagina gel met een eiwit-ladder methode en de monsters uit stap 3.2.1. Laden 1 X Laemmli buffer in lege wells. Voer de voeding op de juiste instellingen, meestal voor de 125 V, 80 min of totdat de bromophenol blauwe kleurstof de bodem van de plaat bereikt.
    3. Een semi-droge eiwit overdraagt, zoals beschreven in Wiedemann et al. 23.
      Opmerking: voor de representatieve resultaten, een membraan van het nitrocellulose (dat hoeft niet te worden gedrenkt in methanol), en koude Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) overdracht buffer werden gebruikt. BSN buffer is samengesteld uit 48 mM Tris, 39 mM glycine, 20% methanol in gedestilleerd water.
    4. Na overdracht, gebruik een scheermesje te snijden het membraan horizontaal van elkaar te scheiden van het gedeelte met de proteïne van belang van een passende interne controle eiwitten, zoals GAPDH.
    5. Ga verder met blokkeren en het antilichaam incubations met behulp van de buffer met blokkerend aanbevolen door de fabrikant van de primaire antilichamen.
      Opmerking: Optimale primair antilichaam verdunningen kunnen sterk variëren afhankelijk van eiwit overvloed en gevoeligheid. Voor de representatieve resultaten hieronder vereist het antilichaam aan de proteïne van belang een verdunning van 1:1,000 terwijl het besturingselement GAPDH een verdunning van 1:40,000 vereist. De verdunning van secundaire antilichamen gebruikt was 1:3, 000.
    6. Na het antilichaam incubations en wassen van het membraan, plaats u de membraan-strips in een doorzichtige plastic omhulsel zoals een sandwich zak.
    7. Bereiden verrukken chemiluminescentie (ECL) mengsel volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een pipet P-1000 te dekken van het membraan met het ECL mengsel, sluit u de schede en Incubeer de membraan stroken met het mengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 minuten.
    8. Plaats het omhulsel van het membraan in een digitale imaging platform. Chemoluminescentie en colorimetrische marker detectie gebruiken om vast te leggen van de verschillende posities van het membraan.
      Opmerking: Blootstelling tijden zullen variëren, afhankelijk van de hoeveelheid eiwit geladen, overvloed van doel eiwit, affiniteit van het antilichaam etc. beginnen met een automatische belichting (meestal een paar seconden), en test belichtingstijden boven en onder met stappen van een paar seconden.
    9. Empirisch, of met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, bepalen welke cellijn brengt de meest doel-eiwit.
  3. De lineaire dynamische waaier van elke primair antilichaam dat met behulp van een seriële verdunning vinden.
    1. Uitvoeren van de stappen 3.2.1-3.2.8 met behulp van een aantal seriële verdunningen van de cellijn die spreekt van de hoogste concentratie van het eiwit van de doelgroep (geïdentificeerd in stap 3.2.9).
    2. Gebruikt afbeelding analysesoftware zoals ImageJ densitometrie uitvoeren op de beelden van de blootstelling.
      1. Bijvoorbeeld ImageJ, gebruiken het gereedschap Rechthoekige selecties te selecteren van de eerste baan van de gel te kwantificeren. Ga naar analyseren | Gels | Selecteer eerste Lane. De muis gebruiken om de resulterende rechthoek naar de volgende baan. Ga naar analyseren | Gels | Selecteer volgende Lane. Herhaaldelijk de rechthoek verplaatsen naar de volgende baan en selecteer de baan voor de rest van de rijstroken.
      2. Ga naar analyseren | Gels | Plot rijstroken. Gebruik de Rechte lijn -tool om lijnen te tekenen over de basis van elke piek achtergrondgeluiden verwijderen. Het gereedschap toverstaf Selecteer elke piek, en het verzamelen van de dichtheid van elke piek, voortaan aangeduid als band intensiteit, vanuit het venster resultaten .
    3. Gebruik de uitgang maken een scatterplot van de band intensiteit ten opzichte van het bedrag van de totale proteïne geladen voor elke primair antilichaam densitometrie. Met behulp van een regel van de beste pasvorm en visuele inspectie, bepalen de locatie (intensiteit bereik) van het lineaire dynamische bereik van elke antilichaam.
    4. Kies een eiwitconcentratie die een waarde op het hogere eind van het lineaire bereik genereert als de concentratie vooruit met alle cellijnen.
      Opmerking: Aangezien deze concentratie lager dan het verzadigingsniveau in de cellijn met de grootste hoeveelheid van dit eiwit is, moet er geen gevaar van over bloot van de bands voor de andere cellijnen.
  4. Uitvoeren van een immunoblot met behulp van de eiwitconcentratie gekozen in stap 3.3.4 voor alle cellijnen en herhaalt u stappen 3.2.1-3.2.8.
    1. Densitometrie op de digitale scans zoals in stap 3.3.2 uitvoeren. Kies de beelden van de posities die signalen binnen de lineaire bereiken voor elke antilichaam die geïdentificeerd in stap 3.3.3 opleveren.
    2. Met behulp van de band intensiteit signalen van de ideale posities van 3.4.1, berekenen de verhouding van doel de intensiteit van de band van de eiwitten voor het laden van de controle-intensiteit van de band voor elke regel van de cel. Deze verhouding-waarden geven aan de relatieve abundantie van de doel-proteïne van belang.
    3. Het uitvoeren van een Pearson correlatie test (kan worden gedaan met behulp van een statistische softwarepakket) te correleren de waarden, verkregen uit beeldanalyse van de kleuring als (stap 2.2) aan die verkregen immunoblotting (stap 3.4.2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd gebruikt voor het bevestigen van het vermogen van als om te bepalen van de relatieve hoeveelheid van het anti-apoptotic eiwit Bcl-2 in cellijnen FFPE weefsel blokken verfilmd. Quantifying Bcl-2 selectief in kankercellen oncogene mechanismen kan verhelderen en nuttig kan zijn in de pathologische diagnose en voorlichtingstaak ten aanzien van klinische behandeling besluiten24. Meer in het bijzonder, Bcl-2 speelt een rol in goede lymfocyt ontwikkeling...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben een methode beschreven dat maakt gebruik van kwantitatieve immunoblotting (IB) om aan te tonen het nut van Immunofluorescentie (IF) voor het vaststellen van de relatieve overvloed van een doel-eiwitten in FFPE weefselmonsters. Huidige eiwit kwantificering methoden worden beperkt door hun categorische aard, zoals chromogenic IHC2,3, of door de noodzaak om het homogeniseren van monsters, voorkomen van onderzoek naar de monster-structuur en cel populaties...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Fredrick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs (A.M.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
697DSMZACC 42Cell line
JeKo-1ATCCCRL-3006Cell line
JurkatATCCTIB-152Cell line
RCH-ACVDSMZACC 548Cell line
Granta-519DSMZACC 342Cell line
REHDSMZACC 22Cell line
RajiATCCCCL-86Cell line
HeLaATCCCCL-2Cell line
Trypsin/EDTA solutionInvitrogenR001100Voor het losmaken van adhesieve cellen
Fetal bovine serum (FBS)Wisent Inc.81150Om trypsine te neutraliseren
Neutral Buffered FormalinProtocol245-684Voor het fixeren van celpellets
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen15517-022Voor het gieten van celpellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429Om Bcl-2 te detecteren door immunoflourescentie en immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XTRoche-Voor automatisering van immunofluorescentiekleuring
EnVision+ System- HRP gelabeld polymeer (anti-muis)Dako (Agilent)K4000Voor immunofluorescence signaal versterking
EnVision+ System- HRP gelabeld polymeer (anti-konijn)Dako (Agilent)K4002Voor immunofluorescence signaal versterking
Cyanine 5 tyramide reagensPerkin ElmerNEL745001KTVoor immunofluorescence signaal versterking
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-Om gescande dia's te bekijken
HALO image analysis softwareIndica Labs-Voor kwantificering van immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)Thermo Scientific1862209Om toe te voegen aan RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)BioShopEDT001Voor RIPA buffer
NP-40BDH Limited56009Voor RIPA buffer
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750Voor RIPA buffer
GlycerolFisherBiotechBP229Voor Laemlli buffer
BromofenolblauwBioShopBRO777Voor Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Voor Laemlli buffer
Bovine serum albumine (BSA)BioShopALB001Voor immunoblot wasbeurten
Proteïne ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Voor het draaien van eiwitgel
Filterpapier (Extra dik blot papier)Bio-Rad1703969Voor blotting overdracht
Nitrocellulose membraanBio-Rad162-0115Voor blotting overdracht
Trans-blot SD semi-dry transfer celBio-Rad1703940Voor semi-dry overdracht
Skim milk powder (Nonfat dry milk)Cell Signaling Technology9999SVoor blocking buffer
Tween 20BioShopTWN510Voor was buffer
GAPDH konijn monoklonaal antilichaamEpitomics2251-1Primair antilichaam van controle-eiwit (lot#: YE101901C)
Geit anti-muis IgG (HRP geconjugeerd) antilichaamabcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Secundair antilichaam voor immunoblot
Geit anti-konijn IgG (HRP geconjugeerd) antilichaamabcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Secundair antilichaam voor immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substratenBio-Rad1705060Voor immunoblot signaal detectie
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Voor immunoblot signaal detectie
ImageJ softwareFreeware, NIH-Voor densitometrie analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunofluorescence AssayCell Line ValidationProtein Biomarker QuantificationFFPE Tissue AnalysisImage Analysis SoftwareWestern Blot ProtocolFluorescence Intensity MeasurementLinear Dynamic RangePearson Correlation Test

Gerelateerde artikelen