Methodenartikel

Visualiseren cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

DOI:

10.3791/58739

⸱

12 januari 2019

 ,  ,  , 
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gibberelline perceptie Sensor 1 (GPS1) is de eerste Förster resonance energie overdracht gebaseerde biosensor voor het meten van de cellulaire niveaus van Gibberelline fytohormonen met een hoge Spatio resolutie. Dit protocol rapporteert over de methode om te visualiseren en te kwantificeren van cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de genetisch gecodeerde nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls en wortel tips.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De phytohormone Gibberelline (GA) is een kleine, mobiele signalering molecule die een sleutelrol in de kieming van het zaad, cellulaire rek en ontwikkelingsstoornissen overgangen in planten speelt. Gibberelline perceptie Sensor 1 (GPS1) is de eerste Förster resonance energy transfer (FRET)-gebaseerd biosensor die zorgt voor de opvolging van cellulaire GA niveaus in vivo. Door het meten van een fluorescentie emissie ratio van nucleaire gelokaliseerd-GPS1 (nlsGPS1), is Spatio toewijzing van endogeen en exogenously meegeleverde GA verlopen in verschillende weefseltypes (HLA) haalbaar op een cellulair niveau. Dit protocol zal beschrijven hoe het beeld van de verhoudingen van de emissie van de nlsGPS1 in drie voorbeeld experimenten: steady-state, voor-en-na exogene Gibberelline A4 (GA4) behandelingen, en in een tijd-loop van de behandeling. We bieden ook methoden voor het analyseren van nlsGPS1 emissie ratio's met behulp van Fiji zowel een commerciële driedimensionale (3-D) opname-software voor visualisatie en analyse en uitleggen van de beperkingen en waarschijnlijk valkuilen van het gebruik van nlsGPS1 te kwantificeren Gibberelline niveaus.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plantaardige hormonen spelen een fundamentele rol in de plantengroei en ontwikkeling. Deze kleine, mobiele signalering moleculen worden meestal geregeld op verschillende niveaus manifesteert, zoals biosynthese, katabolisme en korte - en lange afstand vervoer1,,2,,3,4. Het begrip van hormoon signaalroutes en downstream transcriptionele reacties heeft aangescherpt door de jaren heen. Echter, als u wilt koppelen de diverse cellulaire reacties van het hormoon signaalroutes met de regelgevende inputs leiden hormoon distributies, vereisen wij een Spatio kwantificering van hormoonspiegels op een cellulaire schaal. FRET gebaseerde biosensoren die fytohormonen detecteren kunnen kunnen verder wetenschappers kunnen kwantificeren hormoonniveaus op een cellulair niveau. FRET gebaseerde biosensoren bestaan uit een FRET paar (donor en acceptor fluorescente proteïnen) gekoppeld aan een zintuiglijke domein die een specifieke ligand bindt of reageert op een biologische prikkel. Voor klein molecuul biosensoren triggert ligand bindende een conformationele verandering van het zintuiglijke domein dat tot een verandering van afstand en/of richting tussen de twee fluorescente proteïnen van de FRET paar leidt. Een analyse van de ratiometric van een FRET biosensor wordt bereikt door spannende van de donor en het meten van de emissie fluorescentie verhouding tussen acceptor over donor5,6. Ligand bindend is aantoonbaar als een verandering in deze emissie verhouding7.

Een biosensor FRET gebaseerde ontwikkelden we onlangs voor de plantenhormoon GA. GAs zijn een klasse van hormonen die kiemkracht van zaad, cellulaire rek en de ontwikkelings overgang van de vegetatieve naar bloeiende fasen bevorderen kan. De nlsGPS1 biosensor is nucleaire gelokaliseerd en biedt Spatio inzichten in de dynamiek van de GA in diverse plantaardige weefsels. In Arabidopsis cellen, GA bindt aan oplosbare receptoren, Gibberelline-ongevoelig dwerg (GID), en het complex induceert de afbraak van DELLA eiwitten die fungeren als negatieve regelgevers voor GA signalering van2. Het domein GA zintuiglijke van nlsGPS1 bestaat uit de Arabidopsis GA-receptor (AtGID1C), gekoppeld aan een 74-amino acid afkappen van een DELLA eiwit (AtGAI) en een paar van de FRET uit verbeterde dimerisatie varianten van Cerulean als de donor fluorescent proteïne en Aphrodite (een codon-gediversifieerd Venus) als de acceptor fluorescent proteïne8. De nlsGPS1 biosensor is een hoog-affiniteit sensor voor het bioactieve GA4 (Kd = 24 nM voor GA4) en het kan worden gebruikt in verschillende weefselsoorten kaart te kwantificeren GA verlopen. Om te voorkomen dat de verkeerde interpretatie van de in vivo Arabidopsis GA-niveaus, hebben wij ook een variant van nlsGPS1 ontwikkeld (nlsGPS1-NR) te gebruiken als een negatieve controle. De nlsGPS1-NR-eiwit draagt mutaties in de zak van de GA-bindende die verstoren de binding van GA en mutaties in de DELLA proteïne die de interactie met GID receptor eiwitten7,9 verstoren. Emissie verhouding patronen of wijzigingen waargenomen in zowel nlsGPS1 als nlsGPS1-NR lijnen kunnen artefacten die niet direct gerelateerd aan GA-bindende gebeurtenissen worden beschouwd. Het is ook belangrijk op te merken dat nlsGPS1 binding aan GA4 niet snel omkeerbaar is, en daarom, cellulaire nlsGPS1 emissie ratio's moeten worden geïnterpreteerd als het vertegenwoordigen van de hoogste concentratie recente GA in een bepaalde kern in plaats van de real-time steady-state niveaus. Een analyse van dalende GA niveaus kan dientengevolge niet met nlsGPS1.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een nlsGPS1 biosensor in cellen van de model plant Arabidopsis, met behulp van de confocal imaging-gebaseerde benaderingen in een hoge resolutie. Het protocol bevat informatie over imaging plantenwortels en hypocotyls over tijdsverloop zowel op steady-state. De nlsGPS1-sensor kan potentieel worden gebruikt in verschillende weefseltypes (HLA)-, maar ook over plantensoorten, kaart te kwantificeren GA distributies.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding

  1. ½ Murashige en Skoog agar pH 5.7 met geen sacharose (1 L) voor te bereiden.
    1. Los 2.2 g van Murashige en Skoog (MS) Basaal medium in 950 mL ultrazuiver water. Breng de pH op 5.7 met 5 M KOH.
    2. Vul de oplossing in tot een eindvolume van 1 L met ultrazuiver water. Verdeel het in twee 500 mL flessen, elk met 1% plant agar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
  2. Bereiden ¼ MS vloeistof met een pH van 5.7 met geen sacharose (1 L).
    1. 1.1 g van MS in 950 mL ultrazuiver water los. Breng de pH op 5.7 met 5 M KOH. Vul de oplossing in tot een eindvolume van 1 L met ultrazuiver water. Verdeel het in twee flessen van 500 mL. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
  3. GA4voor te bereiden.
    1. Los de GA4 in ethanol 70% om een eindconcentratie van 100 mM GA4 voorraad.
    2. Ter voorbereiding van werkoplossing, Verdun de GA4 voorraad aan 0.1 – 1 µM in ¼ MS vloeibare pH 5.7.

2. de plantengroei

  1. De zaden van Arabidopsis steriliseren.
    1. Werken met behulp van een chemische capuchon. Aliquot zaden (ongeveer 200 zaden) in 2 mL microcentrifuge buizen. Een markering met chloor-bestendige inkt gebruiken en plaats de buizen met open deksels binnen de sterilisatie vaartuig (een grote doos die kan worden verzegeld).
    2. Plaats een bekerglas van 250 mL met 50 mL ultrazuiver water en 50 mL van natriumhypochloriet-oplossing binnen de sterilisatie vaartuig.
    3. Voeg 3 mL zuiver geconcentreerd zoutzuur (HCl) in het bekerglas. Onmiddellijk zegel van het vaartuig en sta toe sterilisatie door chloorgas voor 6-16 h.
    4. Na het schip ontzegeling, sluit de deksels van alle de microcentrifuge buisjes in het rek zaad. Gesteriliseerde zaden kunnen droog worden opgeslagen tot het moment van plating.
  2. Zaaien ongeveer 20 gesteriliseerde Arabidopsis op ½ MS agar vierkante platen. Zegel van de platen met poreuze chirurgische tape en wikkel ze met aluminiumfolie. Incubeer hen bij 4 ° C voor 1-3 dagen voor de stratificatie.
  3. Draag voor een wortel imaging, de platen naar de zaal van de groei in een verticale positie voor 3 dagen met de volgende voorwaarden voor groei: lange-dag voorwaarden (LD, 16 h van licht/8 h van dark); 120 µmol⋅m-2s-1 licht intensiteit; temperatuur van 22 ° C (tijdens de lichte cyclus) of 18 ° C (in het donker cyclus), 65% relatieve vochtigheid (RH).
  4. Voor donker-gegroeid hypocotyl: de platen overbrengen in de kamer van de groei voor een lichte puls van 1-4 h te synchroniseren de kiemkracht. Wikkel de platen met aluminiumfolie en plaats ze in de zaal van de groei in een verticale positie voor 3 dagen.

3. de monstervoorbereiding

  1. Steady-state metingen (figuur 1A)
    1. Voeg op een schone microscoopglaasje, 50 µL van ¼ MS vloeistof (voortaan aangeduid als mock oplossing). Zachtjes overbrengen zaailingen uiting van nlsGPS1 van de plaat naar de dia.
    2. Neem een schone dekglaasje aan en een daling van vacuüm vet vlek op elke hoek van het dekglaasje aan. Voorzichtig plaatst het dekglaasje aan boven de zaailingen en voeg voorzichtig extra mock oplossing om eventuele luchtbellen te verwijderen.
  2. GA4 behandeling: chemische uitwisseling experiment (figuur 1B).
    1. Gebruik een 20 mL spuit gevuld met vacuüm vet (verbonden aan een Pipetteer tip) om een rechthoek te tekenen vóór het begin van de behandeling van de4 GA (lengte: 3,5 cm, hoogte: 2,5 cm) met een uniforme laag vacuüm vet op een schone glasplaatje (figuur 1B). Als u wilt toestaan voor een fijne lijn van vacuüm vet, moet het uiteinde van de pipet worden gesneden om te hebben een opening van 1 mm in diameter.
    2. Voeg toe 50 µL van mock oplossing aan het glasplaatje. Met schone pincet, kies de zaailingen van de nlsGPS1 en leg ze zachtjes op de mock oplossing. Voorkom schade en overdracht van de zaailingen door het ondersteunen van de onderkant van de zaadlobben zonder grijpen de zaailing met de pincet.
    3. Neem een schone dekglaasje aan en een daling van vacuüm vet vlek op elke hoek van het dekglaasje aan. Plaats met de pincet het dekglaasje aan in het midden van de rechthoek vacuüm vet. Nu is het dekglaasje aan verzegeld op de twee zijden die overeenkomt met de lange zijden van de rechthoek vacuüm vet.
    4. Voeg voorzichtig extra mock oplossing voor het vullen van het reservoir en alle luchtbellen binnen het reservoir verwijderen zonder verstoring van de seedling(s) binnen.
    5. Het verwerven van de beelden voor de GA4 behandeling met behulp van een confocal microscoop. Volg de instructies zoals beschreven in sectie 4 van dit protocol.
    6. Voor de behandeling van de4 GA, het microscoopglaasje uit de confocal fase te verwijderen. Stel de timer in voor 20 min.
    7. Na het starten van de timer, de bufferoplossing uit te wisselen met ¼ MS vloeistof met 1 µM GA4. Voeg de GA4 oplossing (ongeveer 50 µL) vanaf de linkerkant van het dekglaasje aan en verwijder de vorige (mock) oplossing vanaf de rechterkant. Houden aan het uitwisselen van de oplossing voor het vervangen van de mock oplossing volledig, die ongeveer 10 min (figuur 1B duurt).
    8. Plaats het glasplaatje terug op het podium van de Microscoop. Een ander 10 min wachten alvorens het na-GA beeld te verkrijgen.
  3. Het instellen van een tijdsverloop voor het weefsel van belang
    Opmerking: Het weefsel van belang zou kunnen zijn, bijvoorbeeld hypocotyls of wortels. Wij voeren regelmatig tijdsverloop voor imaging-nlsGPS1 biosensor met behulp van een commerciële perfusie-systeem (Figuur 1 c, Zie Tabel van materialen) of een RootChip7,10,11.
    1. Voeg 200 µL van mock oplossing naar het midden van het kanaal van de perfusie van de kleverige-dia (Zie Tabel van materialen). Zachtjes Kies nlsGPS1 zaailingen en leg ze op de mock oplossing in de kleverige-dia.
    2. Met behulp van Tang, voorzichtig plaatsen van het glas dekglaasje aan en zachtjes met de achterkant van de verlostang, druk op de buitenste randen van het dekglaasje aan zodat het vormt een sterke band met de kleverige stof aan de periferie van de kleverige-dia.
    3. Met behulp van twee elleboog Luer sluit connectoren (met een binnendiameter [ID] van 0.8 mm) en de Siliconen slang (met een ID van 0.8 mm), de sticky-dia aan een 20 mL spuit en een outlet container verzamelen de uitstroom-oplossing. Gebruik de Luer lock connector (met een ID van 0.8 mm) de spuit verbinden met de Siliconen slang.
    4. Druk voorzichtig op de injectiespuit met de mock oplossing handmatig te laat genoeg oplossing passeren de kamer zodat er geen luchtbellen links in de kamer. Plaatst en houdt de spuit op de programmeerbare-spuitpomp.
    5. Stel de pomp geldende parameters specifieke op de spuit gebruikt (dwz., diameter en volume) samen met het debiet volgens de handleiding die bij de pomp geleverd.
      Opmerking: In dit protocol, een debiet van 1-3 mL/h werd gebruikt, en dit kan worden gewijzigd volgens de experimentele eisen. Het tijdsverloop starten door het starten van de pomp.
    6. Voor GA4 behandeling tijdens een tijdsverloop (Figuur 1 c), stoppen de perfusie door onderbreken van de pomp en de spuit met een nieuwe één met ¼ MS vloeistof aangevuld met GA4wijzigen. Doorgaan met confocal beeldvorming zoals aangegeven in de volgende sectie.

4. microscopie

Opmerking: Wij voeren confocale laser microscopie.

  1. Verwerven van beelden met behulp van een confocal microscoop uitgerust met lasers voor het uitvoeren van de FRET imaging.
    Opmerking: Voor nlsGPS1, zijn varianten van cyaan fluorescente proteïne (GVB) en gele fluorescerende proteïne (YFP) beeld. In dit protocol worden commerciële microscopen (Zie Tabel van materialen, zoals Microscoop 1 en 2 vermeld) met 10 x of 20 x droge 0.70 harmonische samengestelde APO PLAN doelstellingen gebruikt.
  2. Voor Microscoop 1, gebruik 448 nm en 514 nm golflengte lasers te prikkelen GVB en YFP, respectievelijk. Sequentiële scans te verwerven. Detectoren (bijvoorbeeld HyD SMD) voor het opsporen van 460-500 nm voor GVB (donor emissie) en 525-560 nm voor YFP (FRET emissie) na de excitatie van GVB instellen Gebruik een tweede reeks en laat een detector te detecteren 525-560 nm voor YFP (YFP-emissie) na de excitatie van de YFP.
    Opmerking: De fluorescentie van deze YFP wordt gebruikt als een controle-expressie, alsmede in het segmenteren van kernen, voor het genereren van oppervlakken met behulp van een commerciële opname van 3D-visualisatie- en analysesoftware.
  3. Voor Microscoop 2, gebruik 440 nm en 514 nm golflengte laserlijnen die prikkelen GVB en YFP, respectievelijk. Verwerven van twee sporen. Instellen voor track 1, detectoren (bijv.., ChS) te detecteren 464-500 nm voor GVB (donor emissie) en 526 – 562 nm voor YFP (FRET emissie) na de excitatie van GVB. Voor spoor 2, instellen van een detector te detecteren 526 – 562 nm voor YFP (YFP-emissie) na de excitatie van de YFP.
    Opmerking: De fluorescentie van deze YFP wordt gebruikt als een controle-expressie, alsmede in de kernen, segmenteren voor het genereren van oppervlakken in de 3D-visualisatie en analyse software.
  4. Verwerven van beelden met behulp van een indeling van 512 x 512 pixels en een resolutie van 12 bits.
  5. De winst moet worden aangepast aan een empirisch bepaald waarde dat voorziet in een goed signaal terwijl niet verzadigen van pixels. De winst mag niet worden gewijzigd tussen het GVB en FRET aflevering over het experiment. Stel het gaatje op 1 luchtige eenheid (AU). Plaats de IBIDI sticky-dia in het stadium van de confocal microscoop, en ga verder met beeldvorming zoals eerder komt te staan.
  6. In de Microscoop 1 software, terwijl in een actieve live scannen, gebruik maken van gloed over/onder gevestigd op de bovenste links van het scherm om de onderbelichting en de verzadiging van de regio van belang te bepalen. Gebruiken in de Microscoop 2 software, Bereik Indicator bevindt zich aan de onderzijde van het scherm om de onderbelichting en de verzadiging van de regio van belang te bepalen. Voor elke kwantitatieve beeldanalyse, moet er geen pixel verzadiging.
  7. De z-stacks met een stap grootte van 1 μm instellen De stap-grootte kan worden voor een verhoogde z-resolutie verlaagd of verhoogd voor een hogere snelheid van verwerving of te verhogen van het aantal posities/monsters die image kan worden gemaakt. Voor de geautomatiseerde tijdsverloop, de tijd samen met de z-stacks (xyzt modus vanuit het tabblad overname modus) om te verwerven van de beelden op de ingestelde tijdsintervallen te instellen.

5. image analyse met behulp van Fiji

Opmerking: Met ImageJ (Fiji) is het mogelijk om imaging gegevens verwerken en produceren van tweedimensionale (2D) afbeeldingen van de verhouding tussen de nlsGPS1 emissie in Arabidopsis zaailingen. Zie voor voorbeelden van afbeeldingen, figuur 2A, 2 C, 2E, 2 Gen 3A. In ImageJ is het mogelijk om te vinden van elke opdracht van dit protocol, met behulp van de zoekfunctie. Druk op de SPATIEBALK en L op het toetsenbord van de computer. Een nieuw venster zal openen; Typ de gewenste opdracht in het zoekveld.

  1. Sleep het bestand (of .lif of .lsm-bestanden) in Fiji (afbeelding J) en open de afbeeldingen als hyper-stack.
  2. Vanuit het hoofdmenu, selecteer beeld > Stack > Z project en selecteer som segmenten te vangen alle pixels in plaats van alleen de helderste pixels zoals Max projectie.
  3. Vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Subtract achtergrond en stel de rolstraal van de bal op 50 pixels. Unselect eventueel nog andere opties en verwerken van alle drie de beelden. Deze stap verwijdert achtergrond met behulp van de "rollende bal" algoritme.
    Opmerking: 50 pixels werd empirisch bepaald kernen opnemen als voorgrond.
  4. Vanuit het hoofdmenu, selecteer afbeelding > kleur > Kanalen splitsen. Drie nieuwe vensters geopend: C1-som (GVB kanaal); C2-som (FRET kanaal), en C3-som (YFP kanaal).
  5. Selecteer de C3-som -venster en, vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Filters > Gaussian Blur en toepassen van een Gaussian Blur 1 ter vermindering van de ruis in de afbeelding.
  6. Vanuit het hoofdmenu, selecteer afbeelding > aanpassen > Helderheid/Contrast en selecteer auto.
  7. Vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > versterken het Contrasten de ingestelde verzadigde = 0,35.
  8. Vanuit het hoofdmenu, selecteer beeld > Type > 8-bits en de stapels omzetten in een 8-bits afbeelding.
  9. Vanuit het hoofdmenu, selecteer afbeelding > aanpassen > Auto-Local drempel. Selecteer in de Auto-Local drempel, de volgende parameters: Phansalkar methode, straal = 15, parameter 1 = 0, parameter 2 = 0en wit stack. In deze stap worden YFP stapels gebruikt om een binair masker.
  10. Selecteer de C2-som -venster en, vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Filters > Gaussian Blur en toepassen van een Gaussian Blur van 1.
  11. Selecteer het C1-som -venster en, vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Filters > Gaussian Blur en toepassen van een Gaussian Blur van 1.
  12. Als u wilt maken van de emissie verhouding stapel van de twee kanalen, vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Afbeelding Calculator. In het nieuwe venster dat verschijnt, selecteer C2-som als afbeelding 1, selecteer verdelen als operator en selecteer C1 som als afbeelding 2.
  13. Zorg ervoor dat u een nieuw venster maken en de 32-bits indeling. Een nieuw venster verschijnt benoemde Resultaat van C2-som.
  14. Vanuit het hoofdmenu, selecteer beeld > Opzoektabel > LUT 16_colors.
  15. Vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Afbeelding Calculator. In het nieuwe venster dat verschijnt, selecteer Resultaat van C2-som als afbeelding 1, selecteer vermenigvuldigen als operator en selecteer C3-som als afbeelding 2. In deze stap, wordt de binaire masker van YFP vermenigvuldigd met de YFP/CFP-stack te tonen alleen pixels in het besturingskanaal YFP aanwezig.
  16. Vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > wiskunde > verdelen en de waarde tot en met 255. In het nieuwe venster dat opent, selecteert u Ja voor het analyseren van alle afbeeldingen in de stack. Een nieuwe afbeelding verschijnt benoemde Resultaat van resultaat van C2-som.
  17. Vanuit het hoofdmenu, selecteer afbeelding > aanpassen > Helderheid/Contrast en selecteer Auto.
  18. Vanuit het hoofdmenu, selecteer proces > Contrast verbeterenen selecteer Type verzadigd = 0,35.
  19. Vanuit het hoofdmenu, selecteer afbeelding > aanpassen > Helderheid/Contrasten ingestelde minimale en maximale waarden vast te leggen van de GA-distributie. Optionele stap: vanuit het hoofdmenu, selecteer analyseren > Tools > Kalibratie en Toon LUT - kalibratiebalk, en het Resultaat van resultaat van C2-som opslaan als een TIFF-bestand.
  20. Om waarden van de emissie te verkrijgen ratio's, vanuit het hoofdmenu, selecteer analyseren > meting instellen en selecteer gemiddelde grijze waarde en standaarddeviatie.
  21. Selecteer de shape rechthoek op de werkbalk en tekenen van een regio van belang (ROI). Vanuit het hoofdmenu, selecteer analyseren > maatregel. Een nieuw venster zal het verslag van de gemiddelde waarde van de geselecteerde ROI.
  22. Kopieer en plak de verkregen waarden in spreadsheetprogramma (bijvoorbeeld Excel of OriginPro) en maak een histogram voor een voor-en-na-behandeling van het GA-4 experimenteren of een lijndiagram voor een tijdsverloop experimenteren.

6. de beeldanalyse met behulp van 3D-visualisatie en analysesoftware

Opmerking: Het voordeel van het gebruik van de geselecteerde software (Zie Tabel of Materials) is het segment van objecten (bijvoorbeeld kernen) en het maken van 3D-beelden van een confocal z-stack. Zie figuur 2B, 2D, 2F, 2 Hen 3Bvoor voorbeelden van afbeeldingen.

  1. Open de software en het bestand (of .lif of .lsm-bestanden) importeren.
  2. Segment kernen op basis van de controle YFP uitstoot kanaal met behulp van de wizard oppervlakken. De gesegmenteerde objecten worden hierna aangeduid als "oppervlakken". Deze segmentatie stap maakt de analyse van alle voxels in een kern als één object terwijl het elimineren van de achtergrond van voxels buiten de kern.
  3. In de oppervlakken wizardinstelt de achtergrond aftrekken (lokaal contrast) 3 µm en de drempelmethode naar standaard. Maskeren de GVB emissie (donor excitatie donor emissie [DxDm]) en de FRET emissie (donor excitatie acceptor emissie [DxAm]) kanalen op basis van de oppervlakken die zijn gemaakt met behulp van de YFP emissies (acceptor excitatie acceptor emissie [examen]) kanaal.
  4. De uitbreiding XT bedoel intensiteit verhouding gebruiken voor het berekenen van een verhouding van donor excitatie acceptor emissie gedeeld door donor excitatie donor emissie (DxAm/DxDm) tussen de intensiteitswaarden van de gemiddelde van de afzonderlijke vlakken in de twee kanalen.
    Opmerking: Deze uitbreiding is online beschikbaar voor download.
  5. Selecteer kleur codering met statistieken, die wordt weergegeven als een pictogram van de wiel kleur om de kleur van de individuele oppervlakken met de verhouding van de emissie nlsGPS1. Selecteer de intensiteit verhouding bedoel als statistieken type.
  6. De ratio's van de afzonderlijke waarden uit de tabel, die is gevonden onder het pictogram van de Statistieken te exporteren.
  7. Kopieer en plak de waarden in een werkblad en maak een histogram voor voor-en-na GA4 behandeling experimenten of een lineaire grafiek voor tijd cursus experimenten.

7. statistische analyse

Opmerking: Zie figuur 3D voor een beeswarm en vak plot van nlsGPS1 emissie ratio's.

  1. Open de software en de verhouding van de emissie van de oppervlakken van de kernen als Y kolommen plakken.
  2. Selecteer de kolommen van belang en selecteer Statistieken > Statistieken beschrijving > normaliteit testen om te weten of de monsters zijn normaal verdeeld. Voer de test van de normaliteit en een nieuw venster zal openen en verslag uitbrengen over de resultaten.
  3. Als de monsters zijn normaal verdeeld, gebruikt u de t-test als statistische toets. Selecteer Statistieken > Hypothesis testing > Two-Sample t-test op rijen en run de t-test.
  4. Indien de monsters niet normaal worden gedistribueerd, selecteer Statistieken > Statistieken Hypothesis testing > twee gepaarde steekproeven testen voor variantie om te weten of het verschil tussen de monsters niet significant verschillend.
  5. Als het verschil niet significant verschillend is, gebruikt u de Mann-Whitney U testen als statistische toets. Selecteer Statistieken > Niet-parametrische testen > Mann-Whitney testen en uitvoeren van de test.
  6. Als de afwijking beduidend verschillend is, gebruikt u de Kruskal-Wallis ANOVA testen als statistische toets. Selecteer Statistieken > Niet-parametrische testen > Kruskal-Wallis ANOVA testen en uitvoeren van de test.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van nlsGPS1, is het mogelijk om te meten van cellulaire GA4 niveaus in weefsels vatbaar voor fluorescentie imaging, met inbegrip van wortel tips en donker-gegroeid hypocotyls (Figuur 2). In de hoofdmap van Arabidopsis is het verloop van nlsGPS1 emissie verhouding kenmerkend voor lage GA in de zones meristemtisch en divisie en hoge niveaus van de GA in de late rek zone (figuur 2A en 2B). In tegenstelling, werd een emissie verhouding verloop niet waargenomen in nlsGPS1-NR wortels, wat suggereert dat de endogene GA gradiënt niet een artefact (figuur 2C en 2D is). Een nlsGPS1 verloop voor de verhouding van de emissie ontstond ook in donker-gegroeid hypocotyls, met lage niveaus in de zaadlobben en het apicale haak en hoge niveaus in de snel elongating basale regio van de hypocotyl (figuur 2E en 2F). In tegenstelling, werd een emissie verhouding verloop niet waargenomen in de nlsGPS1-NR-hypocotyls (Figuur 2 g en 2 H). In zowel Arabidopsis wortels en hypocotyl donker gekweekte cellen, endogene GA accumulatie gecorreleerd met cellulaire rek tarief.

Bovendien exogenously meegeleverde GA4 hoopt zich bij voorkeur in de zone van de rek in vergelijking met de zone van de divisie van de wortel van Arabidopsis (Figuur 3), die aangeeft dat nlsGPS1 kan worden gebruikt voor de studie van endogene en exogene GA patroon van de muziek.

Tijdens de tijd cursus experimenten, nlsGPS1 zaailingen werden geplaatst in sticky-dia kamers en geperfundeerd met ¼ MS vloeistof, gevolgd door een behandeling met 0.1 µM GA4 voor 30 min. De video toont een snellere opeenstapeling van exogene GA4 in de hoofdzone voor de rek in vergelijking met de zone van de divisie (Video 1).

figure-results-1
Figuur 1: voorbereiding van de confocal imaging Sample. Deze panelen tonen een schematische voorstelling van de bereiding van de monsters voor (A) een steady-state-experiment, (B) vóór en na de exogene GA4 behandelingen, en voor het gebruik van (C) een behandeling tijd cursus experiment Sticky-slides (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: Het GA verloop in Arabidopsis wortels en donker geteelde hypocotyls. Twee-dimensionale beelden van de nlsGPS1 (A) en (C) nlsGPS1-NR wortels zijn geanalyseerd met behulp van ImageJ software, en drie-dimensionale beelden van nlsGPS1 (B) en (D) nlsGPS1-NR zijn geanalyseerd met behulp van een commerciële driedimensionale de software van de analyse van de afbeelding. Zowel analyse toonde een endogene GA4 kleurovergang in Arabidopsis wortels. Twee-dimensionale beelden van (E) nlsGPS1 en (G) nlsGPS1-NR donker geteelde hypocotyl werden geanalyseerd met behulp van ImageJ software, en drie-dimensionale beelden (F) nlsGPS1 en (H) nlsGPS1-NR werden geanalyseerd met behulp van de de software van de analyse van de commerciële drie-dimensionaal beeld. Zowel analyse toonde een endogene GA4 kleurovergang in donker geteelde hypocotyls. De LUT bar wordt de valse verkleuring van nlsGPS1 emissie ratio's weergegeven. YFP afbeeldingen worden gemeld als expressie besturingselementen. Hypocotyl beelden werden verkregen met behulp van twee podium posities. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: het exogene GA verloop in wortels. De eerste twee panelen show (A) twee-dimensionale en (B) driedimensionale beelden van een nlsGPS1 wortel vóór en 20 min na de behandeling van exogene GA4 (1 µM). YFP afbeeldingen worden gemeld als expressie besturingselementen. De laatste twee panelen Toon (C) het gemiddelde en standaarddeviatie en (D) beeswarm en vak plot van nlsGPS1 emissie ratio's voor kernen van de rek zone (de regio die is gedefinieerd met een wit frame). In de zone van de rek, was de verhouding van de emissie nlsGPS1 aanzienlijk hoger na GA4 behandeling (Mann-Whitney U test, *** P-waarde < 0.0001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Video 1: perfusie experiment van nlsGPS1 root met behulp van kleverige-dia. Deze video toont driedimensionale beelden van nlsGPS1 geperfundeerd met ¼ MS vloeistof en behandeld met 0.1 µM GA4 voor 30 min. In het tijdsverloop, imaging elke 10 min. voor 3 h met de volgende tussenpozen werd overgenomen: 30 min van mock oplossing (frame t = 1, t = 2, t = 3), 30 min van GA4 behandeling (frame t = 4, t = 5, t = 6), 2 h van mock dus lutie (frame t = 7 tot t = 18) oplossing. Voorafgaand aan de aankoop, was het monster geperfundeerd met mock oplossing voor 2 h. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De FRET gebaseerde GA biosensor nlsGPS1 biedt een kwantitatieve methode om te melden en meten GA hormoon verlopen in meercellige planten. FRET gebaseerde biosensoren kunnen kwantificeren dynamiek met een verbeterde Spatio resolutie over directe detectie door Spectrometrie van de massa en een indirecte meting door transcriptionele verslaggevers of signalering eiwit-afbraak-gebaseerde methoden12, 13. Hoge resolutie cellulaire imaging in verschillende weefseltypes (HLA)-kan zinvolle inzichten in GA biologie en vonk nieuwe hypothesen over de verordening en de functie van GA ophopingen in een meercellig context opleveren. Bijvoorbeeld, zou volgen van veranderingen in de nlsGPS1 biosensor in specifieke GA biosynthetic, katabole, en vervoer mutanten, alsmede tijdens spatiotemporally geïnduceerde verstoringen, zeer informatief om te testen specifiek hoe GA verlopen zijn gevestigd in de wortel en adres wortel cel reacties op GA verlopen. De sensor kan worden gebruikt in andere soorten model en gewas voor het testen van de instandhouding van de mechanismen waarmee de GA-gemedieerde controle van kiemkracht van zaad, cellulaire rek en bloei.

De kritische stappen in de FRET gebaseerde beeldvorming van de nlsGPS1 biosensor zijn dat 1) de pixels moeten niet worden verzadigd tijdens de kwantitatieve analyse van de FRET, 2) de imaging parameters zoals "detector gain" moeten constant voor de emissie van de donor (DxDm) worden gehouden en acceptor emissie (DxAm) overnames, 3) controle nlsGPS1-NR lijnen moeten worden gebruikt voor het uitsluiten van artefacten, en 4) monsters moeten worden voorbereid om drift en focal-verandering problemen te minimaliseren. Bovendien, zijn de milieuomstandigheden waarin monsters worden geteeld belangrijk om te controleren aangezien GA niveaus gevoelig aan omgevingsfactoren als licht duur en lichtintensiteit14,15,16 zijn ,17. Een belangrijke beperking van dit soort analyse is dat een hoge signaal-/ ruisverhouding vereist voor imaging als gevolg van de toename van de ruis die inherent zijn aan ratiometric imaging is. Dus nlsGPS1 imaging niet nuttig zal zijn voor weefsels en organen die niet vatbaar voor ratiometric fluorescentie microscopie met behulp van cyaan en gele fluorescerende eiwitten — bijvoorbeeld, diepere weefsels waar fluorescente proteïnen slecht worden gedetecteerd. Aan de andere kant, zijn ratiometric uitlezingen vaak voorkeur over intensiometric uitlezingen, omdat een interne controle is het nuttig om uitsluiten artefacten die voortvloeien uit wijzigingen in biosensor expressie, stabiliteit, helderheid of detecteerbaarheid in een bepaalde cel, weefsel , of aandoening. Bijvoorbeeld, FRET biosensor imaging en beeld analyses zijn ook gebruikt voor het bestuderen van een verscheidenheid van liganden in een verscheidenheid van weefsels5,6,18,19,20,. De imaging experimenten en analyses van de afbeelding hier gemeld kunnen worden gewijzigd om aan te passen van nieuwe beeldvormende methoden, zoals lichte blad microscopie, die nieuwe inzichten in, bijvoorbeeld, dieper wortel-weefselsoorten kan opleveren.

De eerste generatie nlsGPS1 biosensor is een hoog-affiniteit sensor waarmee een high-resolution kaart van GA verlopen die kunnen ook rapporteren over de intracellulaire stijgingen van de GA na exogene GA behandelingen. Een van de huidige beperkingen van nlsGPS1 is dat de sensor niet snel reversibel en, zo niet op stationaire GA niveaus maar waarschijnlijk, op de recente GA maximumconcentratie in de oplossing van belang meldt. Het tarief van de exacte omzet voor de sensor is ook niet bekend is en dit, in combinatie met lage omkeerbaarheid, verzet zich tegen detectie van endogene GA importactiviteiten dat kan gebeuren binnen een enkele minuten tot een paar uur in sommige weefseltypes (HLA-). Het is ook belangrijk op te merken dat nlsGPS1 heeft een hoge affiniteit voor GA4 (Kd = 24 nM) in vergelijking met andere vormen van GA (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) wanneer imaging andere bioactieve GAs 7. toekomstige generaties van GA biosensoren kunnen worden ontworpen te verhogen van omkeerbaarheid met behoud van de hoge affiniteit of om verschillende specificiteit voor de verschillende voorloper, bioactieve, of de omzettingsproducten GAs tentoon te stellen. 

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk heeft ontvangen financiering van de Europese Onderzoeksraad (EOR) in het kader van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma (subsidie overeenkomst n ° 759282).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis zadenNASCN2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis zadenNASCN2107735
Gibberelline A4 (GA4)SigmaG7276oplossen in EtH 70%, en bewaar bij -20 °C
Natriumhypochloriet oplossing (bleekmiddel)Fisher S/5040HSRA 064
Hydrogenchloride HClSigma31434
Micropore tape3M1530-1
ibidi sticky-slideIbidi81128Luer 0.1 voor wortelbeeldvorming
ibidi sticky-slideIbidi80168Luer 0.2 voor hypocotyl beeldvorming
glasdeksel voor sticky slidesIbidi10812
Elbow Luer ConnectorsIbidi10802
siliconen slangIbidi108401
Luer Lock ConnectorIbidi10826
programmeerbare spuitpompWorld Precision InstrumentsAL-1000
VacuumvetSigma18405
Murashige en Skoog Basal SaltsDuchefaM0221
Agar plant, 1 kgMelfordP1001
Microscoopglaasje met afgesleten randen, 76 mm x 26 mm, 1,0 mm tot 1,2 mm dikFisher Scientific12383118
Dekglas No.1 1/2 glas 22 mm x 22 mmFisher Scientific12363138
Luer-slip Spuit 20 mLFisher Scientific10785126
3M Micropor Chirurgisch PapiertapeFisher Scientific12787597
Kaliumhydroxide, 500 gSigma Aldrich221473-500G-D
Absolute EthanolFisher Scientific10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteelScientific Laboratory SuppliesINS4340
Schaar, 125 mm, roestvrij staalFisher Scientific12338099
Fitting reducer 0.5 naar 1.6Ibidi10829
Leica SP8Confocale lasermicroscoop 1
Zeiss LSM 780Confocale lasermicroscoop 2
ImarisBitplane3D visualisatie- en analysesoftware
Fijibeeldanalysesoftware
OriginProOrigin LabStatistische analysesoftware

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103(2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073(2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290(2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gibberellin BiosensorFRET ImagingnlsGPS1 ExpressionConfocal MicroscopyRatiometric AnalysisGA4 TreatmentArabidopsis Seedlings3D Image AnalysisFluorescence RatioPlant Hormone Imaging

Gerelateerde artikelen