Oprichting van Colon Anastomosis in muizen

Samenvatting

Anastomotic lek of defect na de operatie is een belangrijke oorzaak van postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. Onze chirurgie voor het maken van een Colon wapendrager is een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het bestuderen van de genezing mechanismen van anastomoses.

Samenvatting

Intestinale anastomoses worden meestal uitgevoerd in zowel opkomende als electieve operaties. Toch, anastomotic lekken een zeer gevreesde complicaties van Colon chirurgie en kunnen optreden bij maximaal 26% van de chirurgische anastomoses, met sterfte wordt tot 39% voor patiënten met dergelijke een lek. Momenteel, blijft er een schaarste aan gegevens detaillering van de cellulaire mechanismen van anastomotic genezing. Uitwerking van preventieve strategieën en behandelmodaliteiten voor anastomotic lek kan aanzienlijk worden Potentiation door een beter begrip van passende anastomotic genezing.

Een lymfkliertest model is ideaal als vorige studies hebben aangetoond dat de lymfkliertest wapendrager het meest klinisch vergelijkbaar met het menselijke geval ten opzichte van andere diermodellen is. Wij bieden een gemakkelijk reproduceerbaar lymfkliertest model van Colon anastomosis in muizen die voor verdere illustratie van anastomotic genezing toestaat.

Inleiding

Een zeer gevreesde complicatie van chirurgische wapendrager van de darm is anastomotic afbraak- of lek. Anastomotic lek, die veroorzaakt morsen van de intraluminale inhoud in de buikholte, is levensbedreigend en kan snel leiden tot intra-abdominale sepsis; schok tarieven variëren van 0,3% naar 5,5% na kleine darm anastomoses, en stijgen tot tussen 0,5% en 26% voor Colon anastomoses^1,2. Sterftecijfers na lekken kunnen oplopen tot 39% door het snelle begin van sepsis en snelle progressie ter dood na intraabdominal besmetting³. Preventieve strategieën en behandelmodaliteiten zijn momenteel gebaseerd op pathofysiologie die niet volledig begrepen.

Momenteel is anastomotic genezing vaak vergeleken met de grotere schaal bestudeerde cutane wondgenezing, die blijkt te zijn een relatief arme facsimile. Healing treedt op in een reeks van overlappende fasen, te beginnen met de eerste vertraging fase. Tijdens de dagen 0-4 na oprichting van de intestinale anastomose, wordt de lag-fase gedefinieerd door een acute ontstekingsreactie die de wond van cellulaire puin wist. Vervolgens dagen 3-4, fibroblastic proliferatie en productie van collageen is typerend voor de fibrophasia fase. Ten slotte, na dag 10, een langdurige periode van het remodelleren van collageen staat bekend als de rijping fase. Het is belangrijk om er rekening mee dat anastomotic sterkte vrij laag is en hangt af van de extrinsieke steun van chirurgisch geplaatste nietjes of hechtdraad tot collageen gedeponeerd^{4 is}. Begrip van de rol en timing elke laag van de wand van de darm speelt in anastomotic wondgenezing en de betrokkenheid bij inflammatoire-gemedieerde celtypes zoals macrofagen, evenals informatief surrogaat markeringen om te voorspellen anastomotic mislukking of succes kon sterk verminderen morbiditeit, mortaliteit en na dikke darm operaties⁵uitgaven voor gezondheidszorg.

De lymfkliertest model is aangetoond in eerdere studies het nuttig in het nabootsen van menselijke wapendrager⁶. Terwijl er populaire, bewezen en goed bestudeerde voorbeelden van het lymfkliertest Colon anastomotic model, met name de methode beschreven door Komen et al. zijn ⁷, deze modellen gunst ileocecal of oplopende colocolonic anastomotic technieken⁸. Eerdere studies van menselijke patiënten hebben aangetoond dat significant verschil in lek tarieven tussen ileocecal, colocolonic en colorectal anastomoses, gewezen op de noodzaak voor verdere experimentele modellen op verschillende anatomische locatie. Extra, volksmond gebruikte methoden zijn gericht op het ontwikkelen van een model waardoor opzettelijk een anastomotic lek in plaats van verheldering van de cellulaire mechanismen nodig voor normale anastomotic wond genezing⁹. Rat modellen zijn in het verleden geprobeerd maar hebben tarieven van anastomotic dehiscentie en/of tekenen van lek (dat wil zeggen, de vorming van abces) beduidend lager dan mensen en muizen^6,7. Bovendien zijn meer genetisch gemodificeerde experimentele lijnen beschikbaar in muizen dan ratten. Dit maakt het model rat minder bruikbaar voor een anastomotic model. Varkens en honden-modellen hebben bovendien minder klinisch onderzoek dan de lymfkliertest model^6,7.

Stellen wij voor een veilige, technisch eenvoudig en gemakkelijk en snel reproduceerbare procedure voor de oprichting van Colon anastomoses in een lymfkliertest model dat verder onderzoek naar het mechanisme van onderrapportage van anastomotic wond helende^{10 dient te vergemakkelijken} .

Protocol

Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center institutionele dierenverzorgers en gebruiken Comité (IACUC) en voldoet aan alle institutionele ethische richtsnoeren met betrekking tot het gebruik van dieren voor onderzoek. Bovendien werden alle experimenten verricht overeenkomstig de institutionele, staats- en federale regelgeving met betrekking tot experimentele dierlijke onderzoek.

Opmerking: Voor dit protocol gebruikten we vrouwelijke en mannelijke congenisch in-gefokte C57BL6/J muizen op de leeftijd van 12 tot en met 72 weken. Alle muizen gebruikt voor deze procedure werden gehouden bij onze niet-barrière-faciliteit voor ten minste een week voorafgaand aan de operatie aan te passen aan de lokale bioom. Dieren mochten te voeden op tijd van operatie en gebruikten we mondeling mechanische darm voorbereiding noch rectale blozen vóór ingreep.

1) totstandbrenging van Anastomoses

1. Autoclaaf de chirurgische instrumenten, de zoute irrigatie oplossing warm en grondig schoon alle operatieve oppervlakken met 70% ethanol.
2. Om te induceren anesthesie, plaatst u de muisaanwijzer in een inductie-vak dat is verbonden met een vaporizer. Leveren 2-3% Isofluraan op 1-2 L/min, totdat het muizen zijn verdoofd.
3. Plaats het dier op een opwarming van de aarde apparaat, zoals een verwarming pad, om te voorkomen hypothermie.
4. Subcutaan injecteren een tijd dosis van 0,1 mg/kg buprenorfine (3 µg voor een muis van 30 g) voor postoperatieve analgesie en een eenmalige dosis van 10 mg/kg voor enrofloxacin voor preoperatieve antibiotische profylaxe.
   Opmerking: Hoewel pre- en postoperatieve antibiotica niet vereist voor deze bewerking zijn, institutionele richtsnoeren en het dier zorg en gebruik van de Commissie op onze instelling aanbevolen het gebruik ervan op onze faciliteit.
5. Plaats de verdoving neus kegel rond de snuit van de muis. Gedurende de operatie, zorgvuldig volgen de luchtwegen van het dier en de verdoving stroomsnelheid naar wens aanpassen. Het handhaven van een respiratoire tempo 30-40 ademhalingen per minuut.
6. Gebruik een haartrimmer gevolgd door een ontharende agent te verwijderen van het haar van het huidoppervlak van de gehele van de buik. Verwijder grondig de ontharende agent met gaas bevochtigd met water of 70% ethanol. Grondig droog het dier.
7. Voorafgaand aan de buik prepping, tape van de muis ledematen aan de verwarming pad of operatieve oppervlak aan het einde van elk been om te verhinderen dat de muis verschuiven tijdens de operatie. Ontsmetten van de buik met chloorhexidine. Omvatten het hele geschoren gebied, alsmede de haren op de randen van de geschoren gebied. Plaats een steriele draperen over de muis (figuur 1A).
   1. Snijd een kleine ovale of rechthoekige venster in het draperen de klaargestoomd buik bloot te stellen vóór het draperen.
      Opmerking: Het venster moet blootstellen de hele buik van de muis maar betrekking hebben op de ledematen, de staart, de kop en de thorax. We snijden een 4 x 3 cm² venster voor onze activiteiten (figuur 1B).
   2. Maak een kleine gleuf langs het gordijn middellijn, vanaf de onderrand naar de eivormige of rechthoekig venster, toegang te verlenen tot het rectum tijdens de procedure (Figuur 1 c).
8. Maak een huid incisie. Start langs de middellijn van de onderbuik en incise van de huid met een schaar verticaal aan de xiphoid. Incise alleen de huid en Vermijd het snijden van de spieren van de buikwand (figuur 2A).
9. Begrijpen van de middellijn van de buikwand met een tang en til uit de buurt van de buik inhoud. Zorg niet te verwonden intraabdominal structuren, de lengte van de middellijn abdominale fascia verticaal incise met een scherpe schaar. Uitbreiden van de lengte van de huid incisie (figuur 2B).
10. Wanneer de darmen worden blootgesteld, zoek de blindedarm en de kleine darm en draaien van de linkerpagina ingewanden mediaal om de aflopende en de sigmoid colon bloot te stellen. De botte sondepunt met smeerolie gelei jas en vooraf zorgvuldig de sonde in de endeldarm, om te helpen bij de identificatie van de aflopende/sigmoid colon (Figuur 3).
    Opmerking: In tegenstelling tot mensen, de blindedarm van de muis over het algemeen komt voor in de linker bovenste kwadrant van het abdomen. Wees voorzichtig niet te perforate de darm wand met de sonde in deze stap. Als de wand van de darm wordt geperforeerd, beëindiging van de procedure en euthanaseren van de muis.
    1. Vermijd het grijpen van de blindedarm met een getande of scherpe Tang. In plaats daarvan gebruik van de atraumatische pincet, katoen omver te werpen applicator of zachte vinger manipulatie te draaien van de ingewanden.
    2. Gebruik opgewarmd steriele zoutoplossing om ervoor te zorgen dat de blootgestelde darm vochtig gedurende de hele procedure wordt gehouden.
    3. De dikke darm aan de linkerkant schouderstreek zal worden en aan het retroperitoneum via het mesenterium. Na identificatie, trekken de botte sonde gedeeltelijk ter vergemakkelijking van de colotomy.
11. Uitvoeren van dwarse colotomy van de sigmoid colon.
    1. Pak de sigmoid colon superieur aan de inlaat van de bekken zachtjes met een atraumatische Tang (figuur 4A).
    2. Met behulp van scherpe micro-schaar, maak een snede over de sigmoid colon loodrecht op de richting van de dikke darm en uitbreiding in 80-90% van de breedte van de dikke darm. Dit zal helpen voorkomen dat intrekking van één uiteinde van de dikke darm uit het chirurgische gebied en het vergemakkelijken van de reparatie (figuur 4B).
    3. Als een mesenterische bloedvat gewond in de loop van de viscerale rotatie of colotomy geraakt is, zachtjes houdt druk voor maximaal 2 min met gaas of een katoen-tipped applicator. Als het bloeden aanhoudt na dit tijdstip, plaats een cijfer-van-8 8-0 monofilament hechtdraad rond het punt van bloeden.
       Opmerking: Als de darm tekenen van necrose of letsel na dit toont, beëindigen van de procedure en de muis met behulp van een humane wijze goedgekeurd door uw Commissie institutionele dierlijke gebruik euthanaseren.
12. Repareer het sigmoid colotomy.
    1. Plaats een Castroviejo naald stuurprogramma met 5-6 eenvoudige onderbroken 8-0 nonabsorbable polypropyleen steken om te herstellen van de colostomie. Plaats hechtingen 1 mm naast elkaar met 0,5 mm bites.
       1. Zorg om te voorkomen dat de rollen van de randen van de darm in de reparatie door het nemen van iets meer sereus vlies dan mucosa met elke steek. Laat de staarten 5 mm lang. Zorg niet per ongeluk de omliggende darm vangst in de hechtdraad (figuur 4C).
          Opmerking: Het is handig om te beginnen wordt op het in de buurt van de mesenterische rand van de colotomy, het opslaan van het anti-mesenteric-meest gedeelte van de colotomy voor het laatst.
       2. Zoals het herstel vordert, vooraf de trans-anale blunt-tipped dissectie sonde te omvatten van de reparatie, voordat de definitieve hechtingen worden geplaatst. Dit zal helpen voorkomen dat te smal is een reparatie en tarieven van anastomotic strictuur verlagen.
13. Met behulp van een 10 mL spuit gevuld met verwarmde saline, bevloeiing van de buik meermaals. Indien het oppervlak onder de muis doorweekt wordt, drogen van de muis of verplaats de muis naar een droog oppervlak om te voorkomen hypothermie.
    1. Gebruik een steriel gaas geplaatst over de snede om te genieten van overtollige irrigatie.
    2. Op de laatste irrigatie, vul de buik met een steriele zoutoplossing. Zorgvuldig verder een condoom met 18 G-angiocatheter in het rectum en opblazen met 0,5-1 cm³ van lucht. Dit zal eventuele lekken in de anastomose aantonen dan kan worden gerepareerd met een ander onderbroken polypropyleen Sutuur (geologie) met behulp van de steriele sonde te omvatten van de wapendrager.
    3. Het leeglopen van de dikke darm met behulp van de angiocatheter voordat zij zijn afgehaald.
14. Zorg ervoor dat er geen actieve bloeden. Als er, zachte druk rechtstreeks op het punt van bloeden voor 1-2 min. plaats hemostatische hechtdraad, zoals hierboven beschreven als bloeden blijft uitoefenen.
15. Voorzichtig terug de medialized ingewanden in de normale anatomische stand (figuur 5A).
16. Sluit de abdominale incisie (figuur 5B).
    1. Plaats een lopende hechtdraad langs de gespierde laag van de buikwand vanaf de bovenkant van de incisie en afwerking op de inferieure aspect van de incisie met 4-0 absorbeerbare gevlochten hechtingen. Installeer een gelijkspel en knippen van de hechtdraad verlaten 5 mm staarten.
       Opmerking: Darm in de buikwand sluiting niet per ongeluk te nemen.
    2. Herhaal met 4-0 monofilament hechtdraad te sluiten van de huid (figuur 5C).
17. Zorg ervoor dat het gehele dier is warm en droog, ter voorkoming van postoperatieve onderkoeling.
18. Zorgvuldig toezicht houden op het dier als het herstelt van anesthesie. Beheren van 0,1 mg/kg buprenorfine elke 72 h voor 2-3 dagen na de ingreep voor pijnbestrijding.  Tijdens de herstelperiode, moeten muizen zorgvuldig worden onderzocht dagelijks op tekenen van abces of peritoneale sepsis.  Observatie van de post-operatieve pijn en ongemak moet omvatten: beperking van verkeer met inbegrip van hunching houding, gebrek aan eten of drinken, niet goed verzorgen, buitensporige ontsteking rond de wond, gebrek aan normale genezing op de plaats van de incisie, soort of niet normaal nesten.  Een dier aan te tonen een van deze problemen moet onmiddellijk worden euthanized door CO₂ verstikking voor een minimum van 10 min, gevolgd door bilaterale Thoracotomie.
19. Meng 0,1 mg/mL enrofloxacin met drinkwater van de muis voor 7 dagen na de operatie ter voorkoming van intra-abdominale infectie of sepsis als gevolg van de fecale verontreiniging die zijn gekoppeld aan de bewerking.

2) oogsten Anastomotic weefsel

1. Euthanaseren net voor middendoor anastomotic weefsel, de muis met behulp van een humane wijze goedgekeurd door de Commissie institutionele dierlijke gebruik.
   Opmerking: Op basis van institutioneel beleid, euthanaseren we onze dieren door ze te plaatsen in een zaal van de kooldioxide met 100% kooldioxide gas infusie op 2 L/min gedurende 5 minuten vóór het uitvoeren van bilaterale Thoracotomie.
2. Het steriliseren van de buik met chloorhexidine gevolgd door 70% ethanol.
3. Opnieuw incise de oorspronkelijke incisie middellijn met een scherpe schaar. Beginnen bij de lagere pool van de vorige incisie en breiden deze gesneden superiorly de xiphoid (figuur 6A).
4. Met behulp van schaar, sneed in de gespierde laag, en na het invoeren van de peritoneale ruimte, breiden de snede aan de bovenkant en de onderkant van de incisie. Zorg om te voorkomen dat de darm verwonden bij het invoeren van de buik of verstoren van de anastomose, omdat er mogelijk darm vastgehouden aan de incisie of anastomotic site.
5. Zorgvuldig een linker mediale viscerale rotatie bloot van de gerepareerde sigmoid colon (figuur 6B) uitgevoerd. Waarschijnlijk zal er Verklevingen van de darm naar de darm rond de reparatie. Zachtjes en bot ontleden deze verklevingen uit de buurt van de plaats van reparatie. Neem grote zorg niet te verstoren de anastomose.
   1. Geef de reparatie-site door het lokaliseren van de staarten van de polypropyleen hechtdraad gebruikt voor de reparatie. Met behulp van schaar en 1 cm proximaal aan de reparatie beginnen, transect dwars door de dalende dikke darm. Herhaal deze stap 1 cm distale op site van anastomose.
6. Verwijder de sigmoïdale segment door scherp ontrafeling van de dikke darm van de bijgevoegde mesenterium langs de achterste rand van de dikke darm met een fijne schaar (Figuur 7).
7. Identificeren de mesenterische rand van het model van de dubbele punt en het gebruik van fijne schaar te snijden langs de lengte van de mesenterische grens in een longitudinale mode. Hiermee maakt u een vierkant of rechthoekig deel van de dikke darm van de cilindrische specimen dat eerder verwijderd (Figuur 8).
8. Gebruik een markering-pen af te bakenen de anti-mesenterische grens van de dikke darm voorafgaand aan verwijdering van het segment van de dikke darm. Na het verwijderen, maken een longitudinale knippen langs de lengte van de dikke darm tegenover de markering. Repareren, insluiten en snijd monster weefsel desgewenst voor histologie en/of immunokleuring.

Resultaten

7 dagen na de operatie, moet de anastomose goed genezen worden. De wapendrager geoogst kan worden op de tijdstippen vóór en na zeven dagen beter de stadia van anastomotic genezing illustreren. In Figuur 9, de histologische analyse blijkt een fibrotische (collageen gevisualiseerd door trichrome kleuring) reactie gemedieerd door gladde spieren alpha-actine positieve myofibroblasts. We hebben echter gevonden dat resultaten uit histologische analyses tussen muize...

Discussie

Er zijn verschillende belangrijke stappen voor het welslagen van en minimaliseren van de morbiditeit/sterfte die zijn gekoppeld aan deze procedure. Eerst zorgvuldige behandeling van intestinale weefsel te waarborgen en verzorgen tractie om verwonding te verhinderen wanneer de ingewanden om bloot van de dikke darm te draaien. Onnodige spanning op de darm of mesenterium kan schade de darm of therapieën en oorzaak necrose van de darm uit de buurt van de site van anastomose. Daarnaast, moeten scherpe pincet of pincet met tan...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL6/J muizen	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand absorberende onderleggers, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined steriele veld, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Snij een rechthoekig gat
Isothesia isofluraan	Henry Schein	50033
Fisherbrand steriele katoenen gaaskompres, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petroleum ooglijm, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair ontharingscreme	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorfine  0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulinesyringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI chirurgische handschoenen	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps met tanden	Roboz	RS-5150
Fijne schaar- scherp	Fine Science Tools	14060-09
Rechte gekartelde pincet	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo naalddriver	Fine Science Tools	12565-14
0,9% natriumchloride-irrigatie	Baxter	BHL2F7121	Voor gebruik warm maken tot 37 °C
10 ml-sering	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbeerbare gevlochten hechtdraad, 18", PS-2 naald	Henry Schein	6546037
Blauwe monofilament naad 24” BV-1 naald	Henry Schein	8305H	Komt meestal dubbel gearmd. Snijd de naad op het halve punt om twee bruikbare draden te genereren.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Recht, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline steriele smeergel	Medline	MDS032273H