Extractie en analyse van Taiwanese groene Propolis

Samenvatting

Presenteren we een protocol voor het gebruik van ethanol als oplosmiddel te halen en karakteriseren van Taiwanese groene propolis dat antibacteriële activiteit vertoont.

Samenvatting

Taiwanese groene propolis is rijk aan prenylated flavonoïden en exposeert een breed scala van biologische activiteit, zoals anti-oxidant, antibacteriële, en antikanker ones. De biologische actieve stoffen van Taiwanese groene propolis zijn propolins, namelijk C, D, F en G. De concentratie van propolins in Taiwanese groene propolis is afhankelijk van het seizoen en de geografische locatie. Dus, is het essentieel om een standaard en herhaalbare methode voor het bepalen van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis. Hier presenteren we een protocol dat wordt gebruikt op basis van ethanol extractie, hoge-prestatie vloeistofchromatografie en een analyse van de antibacteriële activiteit te karakteriseren Taiwanese groene propolis kwaliteit. Deze methode geeft aan dat 95% en 99,5% ethanol extracties de maximale droge stof oogsten van Taiwanese groene propolis bereiken, waardoor de opbrengst van de hoogste concentraties van propolins die antibacteriële eigenschappen hebben. Volgens deze bevindingen, wordt dit protocol beschouwd als betrouwbare en herhaalbare voor het bepalen van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis.

Inleiding

Propolis is een natuurlijke harsachtige mengsel geproduceerd door de bee soorten Apis mellifera. Propolis is wijd verbeid gebruikt sinds de oudheid in folk geneesmiddelen. Een studie heeft onlangs gemeld dat propolis is gunstig voor het voorkomen van microbiële infecties en ontstekingen¹. Talrijke studies hebben aangetoond dat de belangrijkste bioactieve stoffen in propolis flavonoïden, fenolische esters van, prenylated p-coumaric zuren en diterpenic zuren^2,3. Tot op heden, zijn 10 prenylated flavanone derivaten van Taiwanese groene propolis geïdentificeerd door middel van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)^4,,^5,,^6,7. De meest voorkomende daaronder zijn propolins C, D, F en G^5,7. De aanzienlijke biologische effecten van Taiwanese groene propolis zijn gecorreleerd met het hoge gehalte aan propolins⁸.

De concentraties van bioactieve stoffen in propolis variëren sterk afhankelijk van het seizoen en de geografische locatie waar de propolis is verkregen. Europese propolis bevat voornamelijk de flavonoïde aglyconen en phenolic zuren⁹. De grote bioactieve stoffen in propolis uit Brazilië zijn prenylated p-coumaric van zuren, zoals artepillin C¹⁰. Een studie aangetoond dat het seizoen een kritische factor is voor de vaststelling van de inhoud van de totale propolin in Taiwanese groene propolis¹¹. De inhoud van de propolin in Taiwanese groene propolis is het hoogst in de zomer (mei - juli) en laagste in winter¹¹. De antibacteriële eigendom van propolis heeft zijn algemeen beschouwd als een indicator van biologische activiteit. In het algemeen, de monsters van propolis verzameld uit verschillende regio's zijn tentoongesteld een vergelijkbare antibacteriële woning; bijvoorbeeld, het is in het algemeen effectief tegen bijna alle gram-positieve bacteriën en vertoont een beperkte antibacteriële werking tegen gram-negatieve bacteriën^10,12,13. Synergetische interactie tussen de flavonoïden in propolis werden gedemonstreerd hebben een antibacteriële werking¹⁴. Taiwanese groene propolis werd ook gemeld te hebben een antimicrobiële werking tegen gram-positieve bacteriën¹⁵. Bovendien wordt in een studie ook gebleken dat een antimicrobiële werking van de interacties tussen propolins in Taiwanese groene propolis⁸.

De karakterisering van de bioactieve stoffen in propolis is moeilijk, omdat de chemische samenstelling kan variëren naar gelang de bron van oorsprong. Het is daarom noodzakelijk een haalbaar en herhaalbare methode voor het bepalen van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis vast te stellen. Echter is geen standaardprocedure opgezet voor de Taiwanese groene propolis extractie en de daaropvolgende functionaalanalyse. Verschillende methoden afwisselend organische en anorganische oplosmiddelen zijn voorgesteld voor propolis extractie^{16,17,18,19,20}. Omdat propolis een lipofiele mengsel is, hebben studies aangetoond dat biologische extractie beter dan de anorganische extractie^{8,18,19 is}. De concentratie van de totale propolin in Taiwanese groene propolis en de antibacteriële eigenschappen zijn belangrijke indicatoren van de kwaliteit van de Taiwanese groene propolis. Dus, is het doel van deze studie te presenteren van een protocol voor het gebruik van ethanol als oplosmiddel te halen en karakteriseren van de antibacteriële eigenschappen van Taiwanese groene propolis.

Protocol

1. bereiding van Ethanol-geëxtraheerde verbindingen

1. Weeg 10 g van bevroren Taiwanese groene propolis, die werd bijeengezocht uit bijenkorven in Taiwan van mei tot juli, en met behulp van de molen kruid vermalen. Bevestigen dat hele stukken van Taiwanese groene propolis grond tot een fijn poeder zonder eventuele grote deeltjes.
2. Voeg 100 mL van verschillende concentraties van ethanol (60%, 70%, 80%, 95% en 99,5%) en water te scheiden van de kolven en meng elke concentratie met 10 g van grond propolis.
3. Incubeer bij 25 ° C staan en schud de kolf van 250 toeren per minuut gedurende 48 uur.
4. Filter de extracten van ethanol door filterpapier met een poriegrootte 25 μm.
5. Reconstrueren de filtraten naar hun oorspronkelijke volume (100 mL) met 95% ethanol met behulp van een maatkolf.
6. Winkel die de ethanol bij-20 ° C. haalt
   Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. bereiding van extracten van Ethanol voor HPLC

1. Concentreren 10 mL ethanol extracten door vacuüm verdamping bij 40 ° C gedurende 15 minuten.
2. Bak de droge stof bij 45 ° C gedurende 24 uur.
3. Het reconstrueren van de droge stof met 10 mL 95% ethanol.
4. Filter 1 mL ethanol wordt geëxtraheerd met behulp van een steriele injectiespuit filter met een poriegrootte van 0,45 µm.
5. Refilter de extracten van de ethanol met behulp van een steriele injectiespuit filter met een poriegrootte 0,22 µm. Het filtraat wordt verzameld en direct kan worden geanalyseerd met behulp van HPLC.

3. analyse van de inhoud van de Propolin met behulp van HPLC

1. Oprichting van standaard bochten van propolins
   1. 1 L van de mobiele fase van methanol: water-oplossing van 88.8:11.2 (v/v) voor te bereiden.
   2. Maak seriële verdunningen van propolin standaard (C, D, F en G) concentraties (15.625 mg/mL, 31.25 mg/mL, 62,5 mg/mL, en 125 mg/mL, respectievelijk) met behulp van de mobiele fase oplossing als oplosmiddel.
   3. Injecteren 20 µL van propolin standaard concentraties in de omgekeerde-fasekolom, sequentieel uit de lage concentratie aan de hoge concentratie.
   4. De HPLC-kolom instellen op 30 ° C en de stroomsnelheid naar 1 mL/min.
   5. De golflengte van de UV-detector ingesteld op 280 nm en de tijd van de recorder aan 20 min.
   6. Analyseren van de normen ten minste 3 x.
   7. De reactie van de meting (y-as) worden uitgezet tegen de concentratie (x-as) met berekening werkblad software, en het maken van een standaard curve met de vergelijking en het R-kwadraat waarde.
2. Analyse van ethanol extract s
   1. Injecteren 20 µL van de ethanol extracten stap 2.5 in de omgekeerde-fasekolom is verkregen.
   2. De HPLC-kolom instellen op 30 ° C en de stroomsnelheid naar 1 mL/min.
   3. De golflengte van de UV-detector ingesteld op 280 nm en de tijd van de recorder aan 20 min.
   4. Analyseren van de normen ten minste 3 x.
   5. Bereken de concentratie van propolin in het ethanolextract, met behulp van de vergelijking voor de kromme van het standaard stap 3.1.7 die gebruikmaakt van de piekoppervlakte voor elke propolin verkregen.

4. minimale remmende concentratie en Minimum bactericide concentratie analyse

Opmerking: De microdilution-methode wordt gebruikt ter beoordeling van de antibacteriële werkzaamheid van ethanol-geëxtraheerde propolins uit Taiwanese groene propolis.

1. Voorbereiding van de testorganismen
   1. Ontdooi de bacteriestammen, Staphylococcus aureus en Escherichia coli, en vervolgens cultuur hen in al soja Bouillon en nutriënten Bouillon, respectievelijk bij 37 ° C gedurende 24 uur.
   2. Passage van de S. aureus met al soja Bouillon en E. coli met behulp van nutriënten bouillon voor twee generaties en, vervolgens, kolonie-vormende eenheden berekenen door het tellen van afzonderlijke kolonies op een agarplaat.
2. Voorbereiding van ethanol extracten voor antibacteriële activiteit testen
   1. Het concentreren van de ethanol extracten verkregen stap 1.5 door vacuüm verdamping bij 40 ° C gedurende 15 minuten.
   2. Reconstrueren van de droge stof met dimethylsulfoxide (DMSO) en aanpassen van de concentratie van het extract tot 12,8 mg/mL.
   3. Maken van een seriële verdunning (concentraties: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 en 640 µg/mL) van ethanol wordt geëxtraheerd met behulp van de Bouillon.
3. Minimale remmende concentratie proeven
   1. Voeg 10 µL van verdunde ethanol fragmenten, variërend van 0.156 tot 640.0 µg/mL in een 96-wells-plaat.
   2. Met Bouillon, stel het volume in op 100 µL, en onderhouden van 5% DMSO in alle de verdunningen.
   3. Inoculeer 100 µL van bacteriecultuur (1 x 10⁶/mL) in de 96-wells-plaat.
   4. Cultuur entmateriaal met verschillende concentraties van ethanol extraheert bij 37 ° C gedurende 48 uur.
   5. Analyseren van de bacteriële groei volgens turbiditeit en met behulp van optische dichtheid (microplate-lezer) op 590 nm tot het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC).
4. Minimum bactericide concentratie proeven
   1. Inoculeer 10 µL van vloeibare cultuur van elk putje van de MIC-test die geen groei op een agarplaat tentoongesteld.
   2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
   3. Bepaal de bactericide activiteit door het identificeren van de laagste concentratie die bleek geen zichtbare bacteriële groei. De concentratie die volledig celgroei elimineert wordt beschouwd als de minimale bacteriële concentratie (MBC).

Resultaten

Positieve representatieve gegevens voor de winning van ethanol zijn opgenomen in tabel 1. De opbrengst van de droge stof van Taiwanese groene propolis werd positief geassocieerd met de concentratie van ethanol. De 95% en 99,5% ethanol extracten had de hoogste droge stof opleveren van Taiwanese groene propolis. De opbrengst van de laagste droge stof van Taiwanese groene propolis is opgetreden wanneer water werd gebruikt als de extractievloeistof. Deze resultaten wijzen ero...

Discussie

Een studie gemeld dat maceratie, met behulp van verschillende concentraties van ethanol, kan worden gebruikt voor Braziliaanse propolis extractie¹⁷; het proces was echter tijdrovend¹⁷. Het duurde ten minste 10 dagen de bioactieve stoffen, zoals fenolische inhoud, om uit te halen Braziliaanse propolis¹⁷. Als alternatief, ethanol extractie in combinatie met verwarming op 37 ° C, 50 ° C en 70 ° C gedurende 30 minuten heeft voorgesteld voor het extrahere...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman nr. 4 filterpapier	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
omkeerfase RP-18 kolom	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptische sojabroodbouillon	Sigma-Aldrich	22092
voedingsbouillon	Sigma-Aldrich	70122
dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
kruidenmolen	Waring	WSG60K
microplaatlezer	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC-systeem	Agilent	1200 Series
vacuümevaporatie	BÜCHI	Rotavapor R-215