Dit werk beschrijft het klonen van een Ustilago maydis Trojaans paard stam voor de in-situ levering van secreted maïseiwitten in drie verschillende types van maïs weefsels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Geïnspireerd door Homer´s Trojan paard mythe, we ontworpen de maïs pathogen Ustilago maydis secreted eiwitten om in te leveren de maïs apoplast toelaat in vivo fenotypische analyse. Deze methode niet afhankelijk is van maïs transformatie maar exploiteert microbiële genetica en secretoire mogelijkheden van ziekteverwekkers. Hierin staat het inspectie van in vivo geleverd secreted eiwitten met een hoge Spatio resolutie op verschillende soorten infectie sites en weefsels. De strategie van het paard van Troje kan worden gebruikt om de Transient aanvulling op maïs verlies-van-functie fenotypen, functioneel karakteriseren eiwit domeinen, af-target eiwit effecten te analyseren, of om te studeren van onside eiwit overdosering, waardoor het een krachtig hulpmiddel voor eiwit studies in het systeem van maïs gewas. Dit werk bevat een precieze protocol over het maken van een paard van Troje stam gevolgd door gestandaardiseerde infectie protocollen bij deze methode toepassen op drie verschillende maïs weefseltypes (HLA).
Inleiding
De biotrophic pathogen Ustilago maydis is de verwekker van de maïs smut ziekte1. Het infecteert alle luchtfoto delen van maïs resulterend in grote tumoren die melanized, zwarte sporen bevatten. Op mondiaal niveau, wordt U. maydis geraamd op een jaarlijks verlies van ongeveer 2% van de opbrengst van maïs, veroorzaken terwijl tumoren worden gewaardeerd als een gastronomische delicatesse in Mexico. Infectie van de plant wordt geïnitieerd door een appressorium die scheidt van de celwand lysing enzymen te dringen de eerste laag van maïs epidermale cellen. Van een primaire infectie site, U. maydis groeit intracellulair en intercellularly, invasie van één tot twee cel lagen elke dag1,2. Succesvolle infectie resultaten in hypertrofie van de plant dat in zichtbaar tumoren op vijf dagen verandert post infectie1,3,4. Tijdens alle stadia van de infectie invaginate schimmeldraden van de schimmel de plant cytoplasma membraan zonder ieder rechtstreeks contact naar de host cytoplasma1,2. De strakke apoplasmic ruimte tussen de infecteren schimmeldraden en de plant plasmamembraan wordt beschouwd als de host/pathogen interactieve site, genaamd de biotrophic interactie zone. Om te overwinnen van het aangeboren immuunsysteem van de plant, scheidt U. maydis een array van effector eiwitten in de biotrophic interactie zone1. Sommige effectoren worden overgenomen door plantencellen, terwijl anderen in de biotrophic interactie zone5,6,7,8 blijven. Één die apoplastisch effector is UmPit2, die samenwerkt met die apoplastisch maïs proteasen het vrijkomen van de signalering peptide ZmZIP1 van ZmPROZIP door die apoplastisch protease activiteit9,10te voorkomen.
In de afgelopen decennia, U. maydis werd niet alleen een model voor schimmel genetica in plant-pathogen interactions, maar ook een waardevol hulpmiddel in de biotechnologie als gevolg van een goed begrepen life cycle, genetische bereikbaarheid en heterologe uitdrukking van uitgescheiden eiwitten11,12,13. Signalen voor de secretie van zowel conventionele en onconventionele eiwit zijn vastgesteld waarmee de posttranslationele modificaties14. Onlangs, U. maydis was werkzaam als een paard van Troje hulpmiddel om te studeren klein, maïseiwitten in situ15uitgescheiden. Het paard van Troje aanpak werd met succes gebruikt voor het analyseren van de functie van de kleine, secreted eiwit ZmMAC1 dat is betrokken bij helmknop ontwikkeling. ZmMAC1 induceert de periclinal verdeling van pluripotente cellen en cel lot specificatie van de nieuw gevormde cellen15. Op dezelfde wijze, werd de biologische functie van de maïs schade-geassocieerde peptide ZmZIP1 geopenbaard. U. maydis afscheidende de maïs die zmzip1 resulteerde in verminderde tumor vorming10. Dus, het paard van Troje aanpak vormt een waardevolle alternatieve route naar eiwit in situ studies met hoge Spatio resolutie dat noch doet vereisen generatie van stabiele maïs transformatie lijnen noch weefsel infiltratie met geïnfecteerd uitgedrukt en de zuivere eiwitten. In het bijzonder, maakt het paard van Troje-strategie de secretie van een heteroloog eiwit in de maïs apoplast en directe vergelijking van besmette versus niet-besmette plantencellen binnen de dezelfde weefsel.
Dit protocol illustreert de belangrijke stappen voor het genereren van een soort paard van Troje U. maydis om een proteïne van belang bestuderen. Verder bevat precieze informatie over infectie procedures van drie verschillende maïs weefseltypes (HLA) (volwassen bladeren, kwastjes en oren) met U. maydis, dat is een voorwaarde voor het bestuderen van de spatio infectie progressie en eiwit-functie in deze onderzoeken weefsels. Geen bijkomende specificaties zijn bepaald op maïs gene versterking en microscopische beeldvormende technieken, aangezien deze stappen doelgroepen gerichte en instrument-afhankelijk zijn. Dus, dit protocol is bedoeld voor ervaren gebruikers van standaard moleculaire biologietechnieken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bouw een U. maydis paard van Troje
Opmerking: Zie Figuur 1.
- Het versterken van een gen van belang van maïs cDNA met behulp van gen-specifieke primers en een corrigeren polymerase van DNA. Kloon van het primaire product van PCR en transformeren van de constructie in E. coli instructies van de leverancier van de plasmide. Controleer of het juiste gen van belang opeenvolging van Sanger sequencing prior te gebruiken voor de volgende klonen stappen.
Opmerking: PCR specificaties dienen te worden geoptimaliseerd door primer reeks specifieke kenmerken en optimale polymerase van DNA reactie omstandigheden. - Inleidingen tot de maïs gen van belang te versterken zonder de volgorde codering een signaal peptide (SP) te ontwerpen.
- Uitbreiden van het 5´-einde van de omgekeerde primer met het motief van de RSIATA en een Ncoik snijden site (tabel 1).
- Versterken de maïs gen van belang met een corrigeren polymerase van DNA, met behulp van de PCR-construct gegenereerd in 1.1 als de PCR-sjabloon.
- Dubbel-digest het PCR product en de U. maydis transformatie plasmide, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, met Xbaik en Nco I. zuiveren het verteerd PCR product en de plasmide.
- Afbinden het verteerd PCR-product naar de p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha sjabloon met behulp van T4 DNA ligase volgens de instructies van de manufacturer´s. De afbinding product transformeren in E. coli en controleer of het juiste gen van belang volgorde door Sanger sequencing.
- De p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgen van belang-mCherry-Ha met het beperkingsenzym SspLinearize ik en transformatie DNA in het solopathogenic U. maydis stam SG20016. Isoleren van U. maydis transformants door carboxin te selecteren en bevestig geïsoleerde transformants door Southern blot analyse16.
Opmerking: Voor elk eiwit van belang, ten minste drie onafhankelijke U. maydis transformants moeten worden geïsoleerd en geanalyseerd om te schatten van eventuele fenotype effecten van willekeurige achtergrond mutaties.
2. kweekmedia
- YEPSlight vloeibare middellange16bereiden: 1,0% (m/v) gistextract, 0,4% (m/v) Bacto-pepton, en 0,4% (m/v) sacharose. Los van alle componenten in ddH2O en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.
- Aardappel-dextrose-agar (PD-agar)20bereiden: 3,9% (m/v) aardappel dextrose agar en 1,0% (m/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Meng alle onderdelen direct in de fles voor de autoclaaf en voeg ddH2O plus een magnetische roer bar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.
- Bereiden van PD-houtskool agar20: 3,9% (m/v) aardappel dextrose agar, 1% (m/v) houtskool en 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Meng alle onderdelen direct in de fles voor de autoclaaf en voeg ddH2O plus een magnetische roer bar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.
3. plant infectie
- Analyses van maïs celdeling uit te voeren in antwoord op een Trojaans paard geleverd eiwit (bijvoorbeeld microscopie gebaseerde cel tellen) vooraf. U. maydis -geïnduceerde maïs celproliferatie en latere tumor vorming begint rond 4-5 dagen post infectie. Kwantitatieve ziekte evaluaties zijn afhankelijk van weefsel en van 6 tot 14 dagen bericht infectie moeten worden uitgevoerd.
Opmerking: Verschillende maïs cultivars tonen verschillende niveaus van gevoeligheid voor U. maydis infectie. Maïs cvs. W23, A188, Gaspe flint, vroege gouden Bantam of Va35 Toon gevoeligheid naar deze pathogenen en zijn dus geschikt cultivars voor paard van Troje studies. - Bereiding van het entmateriaal U. maydis
- Omvatten de voorlopercellen stam SG200 als een negatieve controle in alle Trojaans paard experimenten om te kunnen inschatten van bijwerkingen op de infectie door de transgene stam. Hier, gebruik een U. maydis stam uiting geven aan een niet-afgescheiden versie van de proteïne van belang als een negatieve controle. Om redenen in verband met uitvoerbaarheid (bijvoorbeeld grotere vertoningen), kan de voorvader stam evenwel de gemakkelijker keuze van controle.
- Voordat u het experiment start, schatten welke bedragen van infectie cultuur nodig zijn. Houd in gedachten dat besmetting van elke plant 1 tot 1,5 mL van U. maydis schorsing vereist afhankelijk van de maïs weefseltype.
Opmerking: Ongeveer 1 mL van een overnachting cultuur is voldoende voor verdunning een OD600 van 0,2 in 20 mL van YEPSlicht medium, en 25 mL van een cultuur van U. maydis met een OD-600 voor 0.8-1.0 volstaan voor infectie van 13-16 planten. - Kras U. maydis van een PD-agar plaat met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, enten in 5 mL YEPSlicht voedingsbodem en laat de cultuur groeien bij 28 ° C met constante schudden bij 200 t/min voor 16 h.
- Voorafgaand aan de infectie, onderzoeken de U. maydis inoculatie cultuur door standaard de lichte microscopie van voor de juiste groei en bacteriële besmetting bij 400 X vergroting.
Opmerking: In een geschikte cultuur is alleen de sigaar-vormige schimmel zichtbaar (Figuur 2). - Meng 900 µL van verse YEPSlicht met 100 µL van de overnachting cultuur en meten van de OD600 YEPSlicht medium als een leeg in de analyse van de spectrofotometer gebruiken.
- Verdun de overnachting cultuur met verse YEPSlicht medium op een OD600 van 0,2 en laat de cultuur groeien bij 28 ° C met constante schudden bij 200 t/min, totdat het bereiken van de mid log groeifase door een OD aangegeven600 nm voor 0.8-1.0.
Opmerking: U. maydis cellen dupliceren elke 2 h onder deze omstandigheden, dus de gewenste OD600 wordt bereikt na 4-5 uur van de teelt. - Oogst van de cellen bij OD600 van 0.8-1.0 door spinnen bij 3000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Wassen van de cel pellet één keer met ddH2O. Voor dit doel, voeg cultuur volumedeel ddH2O, spin met 3000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel zorgvuldig in ddH2O met behulp van een 20-mL glazen pipet, waardoor aanpassing van de definitieve OD600 naar 3.0 (voor een paard van Troje-assay) of 1.0 (voor ziekte rating).
- Verificatie van het Trojaanse paard: in planta secretie van de maïs fusieproteïne
- Maïs zaailingen met een paard van Troje stam17infecteren.
- Microscopische beeldvorming van besmette zaailingen op 2-3 dagen post-infectie met behulp van een confocale laser scanning microscoop uitvoeren Te dien einde een rechthoekig stuk van het blad 1 cm onder het punt van injectie accijnzen, leg het monster op een microscoopglaasje en voeg een druppel ddH2O. Om te visualiseren mCherry fusieproteïne, prikkelen specimens op λ = 561 nm en record emissie bij λ = 580-630 nm.
- Infectie van volwassen maïs bladeren
- Maïs planten naar het werkgebied van volwassen bladeren cultiveren (wanneer ten minste blad 7 groeit in de stengel).
Opmerking: Dit stadium wordt bereikt na vier weken na het zaaien van 14 h, 28 ° C dag/10 h, 22 ° C nacht ritme met cv. W23 voorwaarden broeikasgassen. Duur kan variëren met de maïs cultivar en broeikasgassen voorwaarden. - Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3-mL spuit met een 20G x 1 hypodermische naald.
- Druk op de stengel zorgvuldig te lokaliseren het meristeem weefsel in de stengel. De basis van het meristeem kan worden onderscheiden door een overgang van moeilijker stengel naar zachtere weefsel.
- Markeer het meristeem op de stengel met behulp van een pen.
- Injecteren van 1,5 mL van U. maydis cultuur 1 cm boven de shoot meristeem of bloeiwijze meristeem.
- Stem op symptomen van de ziekte bij 6 en 12 dagen post infectie.
- Maïs planten naar het werkgebied van volwassen bladeren cultiveren (wanneer ten minste blad 7 groeit in de stengel).
- Infectie van kwasten
- Maïs planten groeien tot het bereiken van de fase van de kwast.
Opmerking: Een gedetailleerde tijdlijn ontwikkelingssamenwerking helmknop en kwast in maïs cv. W23 was eerder beschreven1819. Kwastjes met vooraf Meiotische helmknoppen zijn zeer gevoelig voor U. maydis infectie; in de maïs cv. W23 zijn kwasten de grootte van 4-7 cm. - Druk op de stengel zorgvuldig te lokaliseren van de kwast in de stengel.
- Mark de tip en de boekwaarde van de kwast op de stengel met behulp van een pen.
- Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3-mL spuit met een 20G x 1 hypodermische naald.
- Injecteren van 1,5 mL van het entmateriaal rond de kwast. Gelijke verdeling van het entmateriaal, langzaam uitgevoerd 0,5 mL elke bij het uiteinde, het middengedeelte, en de basis van de kwast gemarkeerd met de pen.
- 10 dagen post infectie die de ziekte symptomen snelheid.
- Maïs planten groeien tot het bereiken van de fase van de kwast.
- Infectie van oren
Opmerking: de oor weefsel ontwikkeling verschilt in verschillende maïs cultivars en broeikasgassen voorwaarden en voorafgaand aan de enting moet worden geobserveerd. Oren beginnen te ontgroeien zijde zijn zeer gevoelig voor U. maydis infectie.- Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3 mL spuit met een 20 G x 1 hypodermische naald.
- Injecteren de inoculatie naald in de ruimte tussen de bladeren van de schil zo diep mogelijk zonder verwonden van het oor.
- Versie 1.5 mL van het entmateriaal rond het oor.
- Verwijder de injectiespuit plus naald en zorgvuldig massage de kolf om de oplossing voor U. maydis gelijkmatig moeten verdelen.
- 14 dagen bericht infectie die de ziekte symptomen snelheid.
- Bevestigen van de levensvatbaarheid van U. maydis entmateriaal
- 10 µL van het entmateriaal op een PD houtskool agarplaat neerzet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
Opmerking: Als de respectieve U. maydis cultuur vermag formulier filamenten, pluizige, witte mycelium wordt zichtbaar (Figuur 5)
- 10 µL van het entmateriaal op een PD houtskool agarplaat neerzet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Constructies voor U. maydis Trojaans paard experimenten zijn gekloond in de plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen van belang-mCherry-Ha. De maïs gen van belang is gesmolten tot een verslaggever van de fluorescentie mCherry en een epitoop HA-label. De uitdrukking van de fusieproteïne is onder controle van de promoter van U. maydis Umpit2 die specifiek is geacti...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Moderne gewas onderzoek eist protocollen voor moleculaire analyse van genetische en eiwitniveaus. Genetische toegankelijkheid via transformatie is niet beschikbaar of inefficiënte en tijdrovende voor de meeste soorten van gewassen zoals maïs. Bovendien zijn betrouwbare genetische hulpmiddelen zoals promotor verslaggever systemen schaars is, waardoor het moeilijk is om te studeren in situ eiwitfunctie met hoge Spatio resolutie op verschillende weefsel sites. Die apoplastisch eiwitten kunnen worden bestudeerd door...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella en Armin Hildebrand voor het verstrekken van lab ruimte en plant materiaal. Het originele werk op het paard van Troje-methode werd gesteund door een Leopoldina postdoc fellowship en NSF project IOS13-39229. Het werk gepresenteerd in dit artikel werd gesteund door SFB924 (projecten A14 en B14) van de DFG.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2 mL-spuit | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermische naald | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA van maïs | van maïsweefsel dat het gen van belang tot expressie brengt | ||
| Aktieve kool | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laserscanningmicroscoop | gebruik lokaal beschikbare apparatuur | ||
| Cuvet (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-schudder ingesteld op 28 °C, 200 rpm | gebruik lokaal beschikbare apparatuur | ||
| Lichtmicroscoop met 400-voudige vergroting | gebruik lokaal beschikbare apparatuur | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | neem contact op met de corresponderende auteur | ||
| Pasteur-pipet (glas, lange punt) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | kan worden uitgewisseld voor andere basis-kloneringsvectoren zoals pENTR of pJET |
| Aardappeldextrose-agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie-pen | gebruik lokaal beschikbare apparatuur | ||
| Spectrofotometer | gebruik lokaal beschikbare apparatuur | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA-ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Gistextract | BD | 212750 |
Referenties
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355(2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535(2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34(2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
